专利名称：诱导型启动子携带抗病基因培育烟草抗青枯病品系的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用分子生物学手段，培育高抗烟草青枯病的种质材料方法，更 具体地涉及了利用诱导型启动子携带抗病基因培育烟草抗青枯病的转基因植物的方法，属 于植物基因工程技术领域。
背景技术：
烟草种植过程中容易受到根、茎病的危害，每年给烟叶的产量与烟叶的品质造成 很到的损失，其中以烟草青枯病危害最为严重，烟草青枯病已经成为影响我国南方和长江 流域地区烟草种植的首要病害。烟草青枯病导致烟株死亡的原因很多，近年来的生物化学 和基因研究表明，胞外多糖(EPS，由eps基因编码)以及降解植物细胞壁的纤维素酶(主要 为内切葡萄糖酶EG，由egl基因编码)和果胶酶(主要是内聚半乳糖醛酸酶PG，由pglA基 因编码)是病菌在维管束中群居、蔓延以及植物细胞坏死和溶菌作用所必须的因子(Seal S E，et al. 1999)。青枯病菌还分泌细胞外多种细胞壁降解酶(如纤维素酶类和果胶酶类)，其 可能也在破坏导管组织，引起植株枯萎死亡方面起重要作用(何礼远和康耀卫，1995)。烟草是四倍体，遗传背景相当复杂，抗常规育种来选育抗青枯病的烟草品种 很难实现，加之育种年限过长，不能满足我国烟草生产的要求。而对烟草青枯病的防治目前 尚未有特效药能避免青枯病的发生，随着分子生物学的发展，利用基因工程技术来解决烟 草抗病育种已经成为烟草育种的趋势，而选育有效的启动子和抗病基因成为控制烟草青枯 病发生的重要途径。诱导型启动子主要是一类受某些物理或化学信号(包括生物入侵产生的信号)的 刺激而能大幅度地提高基因在特定时期、特定部位的转录水平的启动子(Subramanian S 2002)。已有很多报道关于诱导型启动子的研究，有热诱导启动子、干旱诱导启动子、激素诱 导启动子、机械损伤诱导启动子，当然很多诱导型启动子的活性的启动可受多因素的诱导 (赵恢武 2000 ；Xu D 1993 ；李婵娟 2006 ；李秋莉 2006 ；Zhu Jun 2005)。几丁质酶广泛存在于多数真菌中与部分细菌中，它可以降解病原真菌细胞壁中的 几丁质破坏细胞新物质的沉积致使病原体死亡，而且产生的细胞壁碎片具有诱导作用，从 而刺激寄主植物的抗病反应。植物基因工程的迅速发展，已经获得了许多抗病转基因植株， 为烟草抗青枯病育种提供了广阔前景。本发明就是针对以上背景技术，通过分子生物学克隆烟草诱导型启动子P1，以及 烟草几丁质酶基因，通过中间载体，将启动子与目的基因整合在一起，构建植物表达载体。 建立了以抗生素为筛选剂的遗传转化体系，通过农杆菌介导法，培育转基因烟草，以及高效 的分子检测手段及抗病鉴定。为安全、高效的转抗烟草青枯病基因，培育新品种奠定了良好 的技术基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导型启动子携带抗病基因培育烟草抗青枯病的转基因植物的方法。利用转基因技术，为安全、高效地转抗烟草青枯病基因，培育新品种奠定了 良好的技术基础。本发明的诱导型启动子携带抗病基因培育烟草抗青枯病的转基因植物的方法，将 烟草基因组中的诱导型启动子Pl核苷酸序列与抗病基因CHI整合在一起，让诱导型启动子 引导抗病基因在受病原菌侵染时表达。更具体的说，是由烟草基因组中的诱导型启动子Pl与与抗病基因CHI整合到中间 载体上，获得植物表达载体，将植物表达载体引入农杆菌，离体转化烟草叶片，培育转基因 烟草。所述植物表达载体是PSC1300-P1-CHI。所述中间载体为pCAMBIA1300。所述诱导型启动子的核苷酸序列来自于烟草翠碧一号，具有如SEQ ID No. 1所示 的核苷酸序列。所述抗病基因CHI为烟草几丁质酶基因，其核苷酸序列来自于三生烟草，具有如 SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列及SEQ ID No. 3所示氨基酸序列。本发明利用烟草基因组中自有的核苷酸序列，通过分子技术手段整合在一起，构 建植物表达载体，培育抗青枯病烟草新材料，是一种利用转基因技术安全、有效改良烟草抗 青枯病的方法。具体地说，从烟草翠碧一号中克隆诱导型启动子P1、从三生烟草中克隆了抗 病基因β//，构建了植物表达载体，利用农杆菌介导法，将基因转入烟草翠碧一号中。本发明利用烟草诱导型启动子Pl与烟草抗病基因β//培育抗青枯病烟草新材 料，包括烟草诱导型启动子Pl的克隆以及烟草抗病基因CHI的克隆，构建植物表达载体，抗 烟草青枯病新材料的培育，以及抗病新材料的分子检测筛选、青枯菌的接种鉴定，其特征在 于
1.克隆得到诱导型启动子的核苷酸序列来自于烟草翠碧一号，具有SEQ ID No. 1的核 苷酸序列。2.克隆得到烟草几丁质酶基因的核苷酸序列来自于三生烟草，具有SEQ ID No. 2 的核苷酸序列。3.将这两个核苷酸序列整合到中间载体上，获得的载体命名为PSC1300-P1-CHI， 其中中间载体指的是PCAMBIA1300，启动子Pl是指烟草受细菌侵染诱导型启动子，基因d 指烟草几丁质酶基因。4.将载体引入农杆菌，转化烟草叶片，培育转基因烟草。5.根据对研究Tl代进行遗传规律分析，发现插入位点为单克隆位点，出现3 :1分 离。培育出来的转基因植株，对烟草的青枯病具有较高的抗病能力。根据上述培育出来的转β//基因烟草在受青枯菌侵染时，表现出很强的抵抗能 力或者免疫能力。已经成功获得一批转PSC1300-P1-CHI的烟草新材料。本发明所克隆的烟草启动子序列由1301 bp个核苷酸组成(含两端的引物长 度)，扣除引物设计时添加的核苷核序列，所克隆的的实际长度为1291 bp。通过NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)在线与GenBank中已报道的序列进行序列相 似性检索。结果与Peng，J. -L等人已发表的PPPs序列相比，核苷酸序列的同源性为 99%，包含了完整的受病原物诱导的Bac元件。这表明本实验已经得到了烟草multiple
4stimulation response gene, Pl 启动子序列。Pl 序列中含有个 514A、417 个 Τ、164 个 C、 196个G，在整个序列中AT占72. 11%，GC的比例仅占27. 89%。采用植物顺式元件查询数椐 库(http://WWW. dna. affrc. go. jp/PLACE/ )对所获Pl启动子区段进行分析，结果显示该 启动子区域含有1个TATA盒，15个CAAT盒，21个GATA盒，1个CCAAT盒，1个rpoH2基 序，1个rpoS17基序，1个phoB基序，1个rpoD17基序和1个rpoD16基序，他们都与基因 表达转录调控有关。所克隆的烟草几丁质酶基因全长有965个核苷酸序列，该序列编码322个氨基酸， 与Shinshi，H.，等人发表的基因的氨基酸序列有4个差异，同源性为98%。BioXM2. 2 软件推导出其蛋白质分子量为34. 39仙^等电点为8.06。融合仍Γ标签后蛋白分子量为 61. 36 KDa0本发明转基因烟草新材料具有以下优点，从烟草基因组克隆得到诱导型启动子、 烟草基因组克隆得到的β//基因运用于烟草分子育种上，提高了转基因安全性，由诱导型 启动子携带抗病基因在烟草受到外界病原菌侵染时让基因启动表达，对烟草青枯病有较强 的抵抗能力甚至达到免疫功能。通过对转基因烟草进行RT-PCR鉴定和接种青枯菌进行抗 性鉴定，得到了高抗烟草青枯病的转基因新材料，为培养高抗烟草青枯病的转基因植株奠 定了有利的基础。
图1为PSC1300-PI-CHI转基因植株基因组DNA的PCR检测； 图2为RT-PCR分子检测PSC1300-P1-CHI转基因Tl代植株；
图3为转基因植株Tl代PCR分子检测；
图4为Ttl代转基因烟草青枯菌接种鉴定；其中a为转基因植株，b为对照； 图5为Tl代转基因植株接种青枯菌鉴定；其中a为转基因植株，b为发生分离的植株； 图6为烟草Pl诱导型特异启动子携带抗病基因CHI的载体构建。为了进一步更详细地阐明本发明不是限制发明，以下结合实施例加以说明。实施例1烟草基因组DNA的提取以及启动子、抗病基因的克隆
取烟草叶片0. 3g左右的冻存组织，液氮研成粉末。加入500ul裂解缓冲液(lOmmol Tris-Cl ρΗ8· 0 ；0. Imol EDTA pH8. O ；0. 5% SDS ；20ug/ml RNase A)，50°C水浴 3_5hr。加入 500ul平衡酚，振荡混勻后，于4°C 12000g离心15min，取上层水相。反复抽提一次。加入 等体积的氯仿异戊醇(24 :1)，振荡混勻后，于4°C 12000g离心IOmin ；取上层水相，加入 2倍体积的冰预冷的无水乙醇，置_20°C 20min。以吸头小心挑取云絮状物转入另一 Ep管 中，以70%乙醇洗涤1-2次。待沉淀风干后，加入IOOuITE溶液溶解，置-20°C保存。通过
GENBANK已经公布的PPS启动子序列，设计两条引物F: 5，-GCAAGCTTATTGATGAAAATTTTGA-3 ，
R:5，-GTGGATCCAGTAGTACTATTTATAGTGATATATATTT-3，利用同源扩增 PCR 克隆 得到 Pl 启动子，所以得 PCR 程序为94 V 5min — (94 V Imin — 54 V 30s — 72 V 2. 5min) IOcycle — (94°C Imin ^ 57°C 30s ^ 72°C 2. 5min)20cycle 72°C IOmin0 回收 目的条带，用T4连接酶连接到pGEM18-T载体上，大肠杆菌DH5 α转化涂板，置于37°C恒温 培养箱中过夜培养，挑取阳性克隆进行摇菌，提质粒，送出去测序。结果与Peng，J. -L等人已发表的PPPs序列相比，核苷酸序列的同源性为99%，包含了完整的受病原物诱导的Bac 元件。这表明本实验已经得到了烟草multiple stimulation response gene, W启动子 序列。通过GENBANK已经公布的CHI基因序列，设计两条引物CHIF-I-SmaI 5，-ATATCCCGGGGCCACCATGAGGCTTTGTAAATTCAC -3， CHIR-990-SacI 5’ -CGGCG
AGCTCTTAATTTCCAAAAGACCTCTGGT -3’克隆得到烟草几丁质酶基因，所克隆的烟草几丁 质酶基因全长有965个核苷酸序列，该序列编码322个氨基酸，与Shinshi，H.，等人发表的 CHI基因的氨基酸序列有4个差异，同源性为98%。实施例2烟草Pl诱导型特异启动子携带抗病基因CHI的载体构建
如图6所示，先用限制性内切酶PST I、EcoR I双酶切载体PSPROK和载体 PCAMBIA1300,并将回收到的目的片段进行纯化，用T4连接酶过夜连接，转化到大肠杆菌 DH5a菌株，涂板后，倒置放在37°C过夜培养后挑起单菌落，用试剂盒提取质粒，用PST I、 EcoR I双酶切鉴定，获得的重组的载体命名为Pscl300。利用BamH I、Hind III双酶切载体Pscl300以及Pl启动子，回收目的片段，用T4 连接酶16°C过夜连接，用大肠杆菌DH5 α菌株转化，涂板后，倒置放在37°C过夜培养后挑 起单菌落，用试剂盒提取质粒，用BamH I、Hind III双酶切鉴定，获得的重组的载体命名为 Pscl300- Pl0分别用Smal、Sac I单酶切载体Pscl300-Pl和胶回收目的基因CHI，并同时回收 酶切产物，用T4连接酶16°C过夜连接，转化到大肠杆菌DH5ci菌株，涂板后，倒置放在37°C 过夜培养后挑起单菌落，进行PCR鉴定，挑单个阳性重组菌于Kan含量为50mg. L-I的LB培 养基中37°C振荡过夜培养，用试剂盒提取质粒，命名为Pscl300- P1-CHL·实施例3烟草的遗传转化
1. 烟草无菌苗的获得以及根瘤农杆菌侵染液的制备
往1. 5毫升的离心管中放入大概200粒左右的CB—1烟草种子，用70%的酒精进行消 毒1分钟，在超净工作台上用事先准备好的无菌水清洗三次用0. 1%的砷汞进行消毒10-15 分钟无菌水再次清洗5次，将处理好的无菌种子种植在1/2MS培养基上。从YEB固体平板上挑取含有重组质粒的单菌落，接种到含有Rif和Km的液体培 养基中，28°C 250rpm培养过夜；取Iml过夜培养的菌液接种到30ml含有相应抗生素(或无 任何抗生素)的YEB液体培养基中继续振荡培养，至0. D. 600 =0. 6-0. 8,4000rpm, 4°C离心 IOmin,弃上清；沉淀用20ml MS液体培养基(MS大量+ MS微量+20 g/Ι蔗糖，pH=5. 8)重 新悬浮备用。分光光度计测得此时菌液的0. D. 600在0.3-0. 6左右。2.根瘤农杆菌介导的烟草遗传转化
外植体制备取事先培养的无菌苗嫩叶，剪切成0. 5X0. 5cm大小。叶盘法转化将 处理好的外植体投入制备好的菌液中，浸泡侵染5mi后，用含有Cef 500mg/L的无菌水冲 洗3-5次后，接种于共培养基中于28°C暗培养；2天后转入含有Cef 500mg/L, Hyg IOmg/ L的叶片芽诱导培养基上筛选培养，控制温度为25-28°C、光强为20001eX、每天光照时间 为12-14hr。等叶芽长至Icm大hr，转入生根培养基。待基部伸出大量根系、上部生长至 3 4cm的幼苗转至盛有无菌沙土的培养盒内，炼苗后转入温室培养。诱导培养基培养基 +0. lmg/L NAA+ lmg/L 6-BA，共培养培养基MS 培养基+0. lmg/L NAA+ lmg/L 6-BA，诱导筛选培养基:MS 培养基 +0. lmg/L NAA+lmg/L 6-BA+lOmg/L Hyg +500mg/L Cef，生根培养基 MS 培养基 5mg/L Hyg +500mg/L Cef。实施例4转基因烟草的PCR、RT-PCR、抗性检测
1.采用CTAB法快速提取烟草基因组DNA，叶片粉末取0. lg，加入600-700ul CTABC100 mM Tris ‘ Cl, pH 8. 0 ,20 mM EDTA, pH 8.0，1.4 M NaCl)，65°C水浴 15min_30min，加入 相同体积的氯仿异戊醇，剧烈震动lmin，10，OOOrpm.离心lOmin，取上清液到新的离心管 中，加入相同体积的异丙醇(预冷)10，OOOrpm.离心lOmin，用70%酒精清洗两次。并烘干用 30-50ul H20溶解，并加入小量的RNAase，取l_3ul用于PCR检测，通过在Pl启动子的末端 合成上游引物promoter -P1-F: 5 ‘ CAAGCAATGACATCTAAGC3’，在终止子Tnos上游合成 引物Tnos-R: 5，TACATGCTTAACGTAATTCAACAGA 3’。图1所示为转基因植株TO代植株进 行PCR鉴定，结果表明，转基因植株中含有目的启动子、抗病基因及终止子的整个表达单元 元件。目的条带刚好符合引物所扩增的条带。由图3可以看出，转基因阳性植株在Tl代发 生分离现在，分离的比例为3:1，符合孟德尔遗传规律，质粒是单个位点插入，定位为单基因 插入。2.采用Trizol方法提取转基因烟草叶片总RNA，取5ul总RNA样品(约2ug)，加 入Iul 0. 5ug/ul的Oligo (dT) 15，于70°C水浴锅温浴3min，置于冰上2min，分别加入下列成 分5ul 的 5*RNAM-MLV 缓冲液，9. 5ul 的无水 RNase 的水，2ul 的 dNTPs，0. 5ul 的 RNase 抑 制剂以及2ul的M-MLV反转录酶。混勻，瞬间离心，42°C温浴60min。然后将反应物加热至 75°C，温浴Smin终止反应，冰上冷却并离心后于-20°C保存。然后利用上述基因引物对烟草 根茎叶进行RT-PCR，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察基因的表达情况如图2所示，转基 因植株的RT-PCR鉴定，表明了目的基因在转基因植株RNA上有表达，未发现基因沉默现象， 克服了传统组合型启动子容易造成基因沉默的现象。3.将实验室保存的青枯菌种划板，挑取单克隆于SPA培养基过夜培养，过夜取 Iml菌液于新的SPA培养基培养，5个小时后，检测浓度，OD=O. 5的时候，取出菌液离心，收 集菌体，用等量的无菌水悬浮。用一毫升容量的注射器吸取重悬的菌液接种于转基因植株 叶片上，以同期生长的CB-I作为对照，如图4、图5所示，图4为转基因植株TO代接种青枯 菌鉴定，从图上可以看出，转基因植株在受青枯菌诱导的情况下，对青枯菌有较强的免疫能 力，能起到抑制青枯菌的能力，同时证实了 CHI基因能对细菌性病害有一定的抑制能力，证 实了 CHI基因并非只对真菌性病害抑制作用。图5为Tl代转基因植株接种青枯菌鉴定，结 果表明，TI代转基因植株能很好的保持原有的抗性，对青枯病有抑制作用，而发生分离的植 株，在接种同量的菌液后发生枯萎，死亡。证实了转基因植株对青枯菌确实存在较强的抵抗 能力。
权利要求
一种诱导型启动子携带抗病基因培育烟草抗青枯病的转基因植物的方法，其特征在于将烟草基因组中的诱导型启动子P1核苷酸序列与抗病基因CHI整合在一起，让诱导型启动子引导抗病基因在受病原菌侵染时表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于由烟草基因组中的诱导型启动子Pl与与 抗病基因CHI整合到中间载体上，获得植物表达载体，将植物表达载体引入农杆菌，离体转 化烟草叶片，培育转基因烟草。
3.根据权利要求2所示的方法，其特征在于所述植物表达载体是PSC1300-P1-CHI。
4.根据权利要求2所示的方法，其特征在于所述中间载体为PCAMBIA1300。
5.根据权利要求1或2所示的方法，其特征在于所述诱导型启动子的核苷酸序列来 自于烟草翠碧一号，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1或2所示的方法，其特征在于所述抗病基因CHI为烟草几丁质酶基 因，其核苷酸序列来自于三生烟草，具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列及SEQ ID No. 3 所示的氨基酸序列。
全文摘要
本发明提供了一种诱导型启动子携带抗病基因培育烟草抗青枯病品系的方法，该方法将烟草基因组中的诱导型启动子P1核苷酸序列与抗病基因CHI整合在一起，让诱导型启动子引导抗病基因在受病原菌侵染时表达。从烟草基因组克隆得到诱导型启动子、烟草基因组克隆得到的CHI基因运用于烟草分子育种上，提高了转基因安全性，由诱导型启动子携带抗病基因在烟草受到外界病原菌侵染时让基因启动表达，对烟草青枯病有较强的抵抗能力甚至达到免疫功能。通过对转基因烟草进行RT-PCR鉴定和接种青枯菌进行抗性鉴定，得到了高抗烟草青枯病的转基因新材料，为培养高抗烟草青枯病的转基因植株奠定了有利的基础。
文档编号C12N9/42GK101880687SQ201010227468
公开日2010年11月10日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者兰岚, 庄伟建, 石新国, 蔡铁城, 陈华, 陈顺辉 申请人:福建农林大学