专利名称：一种用于昆虫鉴定的rdb检测膜条、检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及昆虫鉴定，特别是涉及一种用于昆虫鉴定的RDB检测膜条、检测方法 和试剂盒。
背景技术：
昆虫是动物界节肢动物门最大的无脊椎动物类群，世界上已描述的种类超过100 万种。昆虫的种类鉴定普遍采用传统的形态学鉴定方法，通过归纳总结不同昆虫个体共性 和特性的生物学性状来对其进行分类和鉴别。昆虫物种形态学鉴定主要是通过成虫或幼 虫的形态特征，其用于分类的形态特征的抽取和选择在国际上无公认的标准和固定的模 式，甚至没有一个完全统一的昆虫形态学分类体系。作为生命遗传物质的脱氧核糖核酸 (Deoxyribonucleic acid，缩略为DNA)是揭示生命本质和区分生物物种最可靠的武器，近 年来，应用DNA及其相关技术来区分生物物种的技术越来越多。反向斑点杂交(Reverse Dot Blot，缩略为RDB)是一种基于DNA的斑点杂交技术， 在聚合酶链反应(polymerase chain reaction，缩略为PCR)与Southern blot杂交技术相 结合的基础上产生，具有简便、快速、灵敏度高、特异性好以及重复性好的特点。RDB最先由 Erich和Saiki应用于血液病和Beta地贫检测研究，后来由Saiki、Erlich和Levinson将 寡核苷酸固定在固相支持物上与PCR扩增产物杂交，推动了 RDB的研究和应用，其中以医学 检测和基因分型方面应用尤多，如人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，缩略为HPV)基因 分型、人白细胞抗原(Human leukocyte antigen，缩略为HLA)分型、地中海贫血的检测、分 支杆菌检测等。但是，至今未见有RDB技术在昆虫物种鉴定方面的应用。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是弥补现有技术的缺陷，提供一种用于昆虫鉴定 的RDB检测膜条，简单快速、准确地进行昆虫物种鉴定和区分。本发明所要解决的另一个技术问题是弥补现有技术的缺陷，提供一种用于昆虫鉴 定的RDB检测方法。本发明所要解决的再一个技术问题是弥补现有技术的缺陷，提供一种用于上述 RDB检测方法进行昆虫鉴定的RDB试剂盒，能对特定类群中多种未知种类的昆虫简单快速、 准确地进行物种鉴定和区分。本发明涉及的昆虫是一类具有三对足的无脊椎节肢动物，主要是以下21种鞘翅 目昆虫双钩异翅长蠹 Heterobostrychus aequalis (Waterhouse)(简称昆虫 1)；棕异翅长蠹 Heterobostrychus brunneus (Murray)(简称昆虫 2)；—^^Μ-ΙχΛ Heterobostrychus hamatipennis Lesne (3)；Sinoxylon conigerum Gerstoker ( ^^ 4)；双棘长蠹 Sinoxylon anale Lsene (简称昆虫 5)；
^L^MM^M. Sinoxylon ruficome Fahraus (6)；三月氐双棘长蠹 Sinoxylon senegalense Karsch(简称昆虫 7)；黄足长棒长蠹Xylothrips flavipes (Illiger)(简称昆虫 8)；XfsM. Dinoderus minutus (Lesne) (9)；ψX^t-Ix/Jn^ Platypusparallelus (Fabricius) (10)；栎长小蠹 Platypus quercivorus Murayama (简称昆虫 11)；锥长小蠹Ti^ptoplatypus solidus Walk(简称昆虫 12)；散对长小蠹Platypus solutus Schedl (简称昆虫 13)；东亚长小蠹Platypus lewisi Blandford(简称昆虫 14)；杯长小囊 Dinoplatypus cupulatus Chapuis (简称昆虫 15)；小杯长小蠹 Dinoplatypus cupulatulus Schedl (简称昆虫 16)；芦苇黄截尾长小蠹 Dinoplatypus calamus Blandford (简称昆虫 17)；五棘长小蠹 Diapus quinquespinatus Chapuis (简称昆虫 18)；Hylurgus ligniperda Fabricius (19)；松瘤小蠹 Orthotomicus erosus Wollaston (简称昆虫 20)；7jC曲才卯花/]、蠹 Hylesinus fuaxini Panzer (简称昆虫 21)。本发明的用于昆虫鉴定的RDB检测膜条通过以下技术方案予以解决。这种用于昆虫鉴定的RDB检测膜条，包括通用引物、固相载体、固定在载体上的探 针以及PCR阳性质控质粒，所述通用引物为简并引物对TF/TR，所述固相载体是Biodyne C 膜。这种用于昆虫鉴定的RDB检测膜条的特点是所述固定在载体上的探针，是由一组质控探针和RDB检测探针组成的阵列。所述质控探针包括显色点探针、阳性对照探针和阴性对照探针。所述显色点探针，是具有序列表中Seq ID No. 1所示的序列，5 ‘ -NH2_CAATTGCCTG GGATGTTAC-biotin-3'，这是一条19nt的寡核苷酸，序列与鞘翅目昆虫序列无同源性，5 ‘ 端氨基(-NH2)修饰，3'端生物素标记，其作用是质控RDB检测膜条的制备和RDB杂交过程 是否正常。所述阳性对照探针，是具有序列表中Seq ID No. 2所示的序列， 5' -NH2-TGAGACCAACCAACTGAAACG-3‘，这是一条能和阳性质粒特异结合，阳性质粒上克隆 有一段共194nt的序列，这段序列的5'端和3'端分别与简并引物对TF/TR互补，其中TF 的5'端氨基(-NH2)修饰，其作用是质控PCR扩增过程和RDB杂交过程是否正常。所述阴性对照探针，是具有序列表中Seq ID No. 3所示的序列，5 ‘ _NH2_GACTATAG TATAAGCGCGGTCCA-3'，这是一条23nt的寡核苷酸，序列与鞘翅目昆虫序列无同源性，5 ‘端 氨基(-NH2)修饰，其作用是检测膜条的制备过程和杂交过程中的非特异性结合情况，并作 为检测探针位点是否阳性的参照。所述RDB检测探针，即能特异鉴定昆虫种类的探针，均为一段15 19nt的寡核苷 酸，5'端都标记有氨基(-NH2),其作用是保证探针与检测膜条结合。本发明的用于昆虫鉴定的RDB检测膜条通过以下进一步的技术方案予以解决。所述简并引物对TF/TR序列如下
6
正向引物TF:Seq ID No. 4，序列5' -biotin-ACA IGAAAG AGG IAAAAA IGAA-3'；反向引物TR:Seq ID No. 5，序列5' -ATI GCI AAT ACI GCI CCT AT-3'，其中I代表次黄嘌呤，可以与A、C、G、T配对。所述阳性质粒克隆序列如下Seq ID No 6，这是一段5'端和3'端与简并引物对 TF/TR互补的序列，探针序列为c acatgaaagagggaaaaaagaa ccgagaaaccatattcagagcgaatcatctgtgagccgtttcagtt ggttggtctcaaaagcccttcctgcccagagtgatctcactcgtcgaggccatcggctctgacgcgatatacggttg tgccgagtgtcaatagtttcaaatgag ^taggggcagtattcgcta^ t,所述探针序列是质粒克隆序列中的
正义链，方框中的序列为简并引物对TF/TR结合位点。所述Biodyne C膜的孔径为0. 45 μ m和0. 2 μ m中的一种。本发明的用于昆虫鉴定的RDB检测方法通过以下技术方案予以解决。这种用于昆虫鉴定的RDB检测方法的特点是依次有以下步骤1)提取昆虫基因组DNA从昆虫的卵、幼虫、蛹或成虫标本中提取基因组DNA ；2)目标片段PCR扩增用简并引物对TF/TR进行PCR扩增；所述PCR 扩增的反应条件为 94°C /5min ；94°C /30s_48°C /30s_72°C /30s, 40 个循 环；72°C /5min ；3)杂交将PCR扩增产物与固定在RDB检测膜条上的探针杂交；4)显色 在PCR扩增过程中利用生物素标记PCR产物，所述生物素标记PCR产物，是通过与 链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物(Sti^ptavidin peroxidase conjugate，缩略 为POD)、四甲基联苯胺(3，3' ,5,5' -Tetramethylbenzidine，缩略为TMB)反应进行化学 发光显色。所述RDB检测膜条，包括通用引物、固相载体、固定在载体上的探针以及PCR阳性 质控质粒，所述通用引物为简并引物对TF/TR，所述固相载体是Biodyne C膜。所述固定在载体上的探针，是由一组质控探针和RDB检测探针组成的阵列。所述质控探针包括显色点探针、阳性对照探针和阴性对照探针。所述显色点探针，是具有序列表中Seq ID No. 1所示的序列，5 ‘ -NH2_CAATTGCCTG GGATGTTAC-biotin-3'，这是一条19nt的寡核苷酸，序列与鞘翅目昆虫序列无同源性，5 ‘ 端氨基(-NH2)修饰，3'端生物素标记，其作用是质控RDB检测膜条的制备和RDB杂交过程 是否正常。所述阳性对照探针，是具有序列表中Seq ID No. 2所示的序列，
75' -NH2-TGAGACCAACCAACTGAAACG-3‘，这是一条能和阳性质粒特异结合，阳性质粒上克隆 有一段共194nt的序列，这段序列的5'端和3'端分别与简并引物对TF/TR互补，其中TF 的5'端氨基(-NH2)修饰，其作用是质控PCR扩增过程和杂交过程是否正常。所述阴性对照探针，是具有序列表中Seq ID No. 3所示的序列，5 ‘ -NH2-GACTATAG TATAAGCGCGGTCCA-3'，这是一条23nt的寡核苷酸，序列与鞘翅目昆虫序列无同源性，5 ‘端 氨基(-NH2)修饰，其作用是检测膜条的制备过程和杂交过程中非特异性结合的情况，并作 为检测探针位点是否阳性的参照。所述RDB检测探针，即能特异鉴定昆虫种类的探针，均为一段15 19nt的寡核苷 酸，5'端都标记有氨基(-NH2),其作用是保证探针与膜结合。本发明的用于昆虫鉴定的RDB检测方法通过以下进一步的技术方案予以解决。所述简并引物对TF/TR序列如下正向引物TF:Seq ID No. 4，序列5' -biotin-ACA IGA AAG AGG IAA AAA IGA A_3'；反向引物TR:Seq ID No. 5，序列5' -ATI GCI AATACI GCI CCTAT-3'，其中I代表次黄嘌呤，可以与A、C、G、T配对。所述阳性质粒上还克隆有一段具有与简并引物对TF/TR完全互补的序列，所述与 简并引物对TF/TR互补的序列为人工设计，共194nt，与鞘翅目昆虫序列无同源性。所述阳性质粒克隆序列如下Seq ID No 6，这是一段5'端和3'端与简并引物对 TF/TR互补的序列，探针序列为c :|acatgaaagagggaaaaaagaa| ccgagaaaccatattcagagcgaatcatctgtgagccgtttcagttg gttggtctcaaaagcccttcctgcccagagtgatctcactcgtcgaggccatcggctctgacgcgatatacggttgt gccgagtgtcaatagtttcaaatgag|ataggggcagtattcgctat[t，所述探针序列是质粒克隆序列中的正
义链，方框中的序列为简并引物对TF/TR结合位点。所述Biodyne C膜的孔径为0. 45 μ m和0. 2 μ m中的一种。本发明的用于昆虫鉴定的RDB检测方法通过以下再进一步的技术方案予以解决。还包括步骤5)数据分析和结果判读。本发明的用于昆虫鉴定的RDB试剂盒通过以下技术方案予以解决。这种用于昆虫鉴定的RDB试剂盒，含有检测膜条。这种用于昆虫鉴定的RDB试剂盒的特点是所述检测膜条是用于昆虫鉴定的RDB检测膜条，所述RDB检测膜条，包括通用引 物、固相载体、固定在载体上的探针以及PCR阳性质控质粒，所述通用引物为简并引物对 TF/TR，所述固相载体是Biodyne C膜。所述固定在载体上的探针，是由一组质控探针和RDB检测探针组成的阵列。所述质控探针包括显色点探针、阳性对照探针和阴性对照探针。所述显色点探针，是具有序列表中Seq ID No. 1所示的序列，5 ‘ -NH2_CAATTGCCTG GGATGTTAC-biotin-3'，这是一条19nt的寡核苷酸，序列与鞘翅目昆虫序列无同源性，5 ‘
8端氨基(-NH2)修饰，3'端生物素标记，其作用是质控RDB检测膜条的制备和RDB杂交过程 是否正常。所述阳性对照探针，是具有序列表中Seq ID No. 2所示的序列， 5' -NH2-TGAGACCAACCAACTGAAACG-3‘，这是一条能和阳性质粒特异结合，阳性质粒上克隆 有一段共194nt的序列，这段序列的5'端和3'端分别与简并引物对TF/TR互补，其中TF 的5'端氨基(-NH2)修饰，其作用是质控PCR扩增过程和杂交过程是否正常。所述阴性对照探针，是具有序列表中Seq ID No. 3所示的序列，5 ‘ _NH2_GACTATAG TATAAGCGCGGTCCA-3'，这是一条23nt的寡核苷酸，序列与鞘翅目昆虫序列无同源性，5 ‘端 氨基(-NH2)修饰，其作用是检测膜条制备过程和杂交过程中非特异性结合的情况，并作为 检测探针位点是否阳性的参照。所述RDB检测探针，即能特异鉴定昆虫种类的探针，均为一段15 19nt的寡核苷 酸，5'端都标记有氨基(-NH2)，其作用是保证探针与膜结合。本发明的用于昆虫鉴定的RDB试剂盒通过以下进一步的技术方案予以解决。所述简并引物对TF/TR序列如下正向引物TF:Seq ID No. 4，序列5' -biotin-ACA IGAAAG AGG IAAAAA IGAA-3'；反向引物TR:Seq ID No. 5，序列5' -ATI GCI AAT ACI GCI CCT AT—3'，其中I代表次黄嘌呤，可以与A、C、G、T配对。所述阳性质粒上还克隆有一段具有与简并引物对TF/TR完全互补的序列，所述与 简并引物对TF/TR互补的序列为人工设计，共194nt，与鞘翅目昆虫序列无同源性。所述阳性质粒克隆序列如下Seq ID No 6，这是一段5'端和3'端与简并引物对 TF/TR互补的序列，探针序列为c :|acatgaaagagggaaaaaagaa！ ccgagaaaccatattcagagcgaatcatctgtgagccgtttcagtt ggttggtctcaaaagcccttcctgcccagagtgatctcactcgtcgaggccatcggctctgacgcgatatacggttg tgccgagtgtcaatagtttcaaatgag |ataggggcagtattcgctat|i t，所述探针序列是质粒克隆序列中的
正义链，方框中的序列为简并引物对TF/TR结合位点。所述Biodyne C膜的孔径为0. 45 μ m和0. 2 μ m中的一种。本发明与现有技术对比的有益效果是本发明通过对昆虫的特定基因序列进行分析，设计可用于获得所有或部分特定类 群目标基因片段PCR扩增的通用引物，设计和筛选用于昆虫物种鉴定的RDB检测膜条、检测 方法和检测试剂盒，能够快速、准确、直观的对昆虫的成虫、幼虫、卵以及蛹等各种个体实现 准确分类鉴定，解决了传统形态学昆虫鉴定需要专业分类知识、模式标本比对和昆虫种类 多、鉴定困难的难题，特别是不能有效鉴定昆虫的幼虫、卵、蛹，以及鉴定特征有损坏的成虫 的难题。
9
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明。
具体实施方式
一(一)用于21种鞘翅目昆虫鉴定的RDB检测膜条21种鞘翅目昆虫是双钩异翅长蠹 Heterobostrychus aequalis (Waterhouse)(简称昆虫 1)；棕异翅长蠹 Heterobostrychus brunneus (Murray)(简称昆虫 2)；—^^Μ-ΙχΛ Heterobostrychus hamatipennis Lesne (3)；Sinoxylon conigerum Gerstoker ( ^^ 4)；双棘长蠹 Sinoxylon anale Lsene (简称昆虫 5)；^L^MM^-M. Sinoxylon ruficome Fahraus (6)；三月氐双棘长蠹 Sinoxylon senegalense Karsch (简称昆虫 7)；黄足长棒长蠹Xylothrips flavipes (Illiger)(简称昆虫 8)；XfsM. Dinoderus minutus (Lesne) (9)；Φ-Ix/Jn^ Platypus parallelus (Fabricius)10)；栎长小蠹 Platypus quercivorus Murayama (简称昆虫 11)；锥长小蠹Ti^ptoplatypus solidus Walk(简称昆虫 12)；散对长小蠹Platypus solutus Schedl (简称昆虫 13)；东亚长小蠹Platypus lewisi Blandford(简称昆虫 14)；杯长小囊 Dinoplatypus cupulatus Chapuis (简称昆虫 15)；小杯长小蠹 Dinoplatypus cupulatulus Schedl (简称昆虫 16)；芦苇黄截尾长小蠹 Dinoplatypus calamus Blandford (简称昆虫 17)；五棘长小蠹 Diapus quinquespinatus Chapuis (简称昆虫 18)；Hylurgus ligniperda Fabricius (19)；松瘤小蠹 Orthotomicus erosus Wollaston (简称昆虫 20)；/Jcffi^PiEzhS Hylesinus fraxini Panzer21)。用于上述21种昆虫物种鉴定的RDB检测膜条，固定在膜载体上的探针，是由一组 质控探针和RDB检测探针组成的寡核苷酸探针阵列。检测探针21条，一条探针对应一种昆 虫。表1是21种昆虫的RDB检测膜条探针排布示意，表2是21种昆虫分别对应的RDB检 测探针。每张膜上的探针点阵可根据实际需要设计，但至少要包括检测探针，检测探针的种 类和数量视实际需要增减。表 1
10 表1中的空白对照是浓度为32 %的1-乙基-3 [3_ ( 二甲氨基)丙基]碳二亚胺(N -ethyl-N' - (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride,缩略为 EDC)禾口碳酸 钠或碳酸氢钠等量配制的混和液，用于检测杂交背景。表 2 (二)制备RDB检测膜条RDB检测膜条的制备包括设计探针矩阵、准备探针、点样，以及膜处理步骤。设计探针矩阵是用激光打印机将Biodyne C膜按照长X宽为4. 5mmX 4. 5mm的固 定格式打印备用。准备探针是用浓度为0. 5mol/L、pH为8. 40的碳酸钠或碳酸氢钠点样缓冲液溶解 稀释探针，显色点探针稀释浓度至5 μ Μ,其余探针稀释浓度至20 μ Μ,将探针与现配现用的 质量体积比为32%的EDC等体积混合。点样是从已打印好的RDB探针阵列的Biodyne C膜上按表1探针排布大小剪取所 需区域，依次点上不同探针。每条探针需至少重复2个点，每点约需0. 5 μ 1探针溶液，可用 RDB点样仪或手工点样，采用符合最小量程的移液器或电子排枪将探针点在膜打印方格的 正中央。膜处理是将点样后的RDB检测膜条在室温下放置2h或者在60°C下烘烤20min，再 将RDB检测膜条用浓度为0. lmol/L的氢氧化钠处理IOmin后用去离子水洗4次，每次5min， 然后在60°C下烘干20min，最后在4°C下保存RDB检测膜条备用。(三)21种昆虫鉴定的RDB检测方法1)提取昆虫基因组DNA利用动物/昆虫DNA提取试剂盒获得昆虫标本基因组DNA，DNA模板必须满足下游 PCR扩增实验的要求。昆虫DNA从卵、幼虫、蛹或成虫标本中获取。2)目标片段PCR扩增用本发明的昆虫mtDNA COI基因简并引物对TF/TR进行不对等PCR扩增，上游引物
12的浓度为20 μ mol/L,下游引物的浓度为10 μ mol/L,同时以阳性对照质粒为模板，用简并 引物对TF/TR进行PCR扩增，上游引物TF的5'端氨基(-NH2)修饰，通过PCR反应，将PCR 扩增产物标记上生物素。PCR 扩增的反应条件为 94°C /5min ；94°C /30s_48°C /30s_72°C /30s, 40 个循环； 72°C /5min。简并引物对TF/TR由北京奥科生物技术有限公司合成。木材害虫PCR扩增片段长度为390bp，阳性对照质粒PCR扩增片段长度为192bp。简并引物对TF/TR序列如下正向引物TF:Seq ID No. 4，序列5' -biotin-ACA IGAAAG AGG IAAAAA IGAA-3'；反向引物TR:Seq ID No. 5，序列5' -ATI GCI AATACI GCI CCTAT-3'。说明简并引物对TF/TR为简并引物对，I代表次黄嘌呤，可以与A、C、G、T配对， 其中TF的5'端氨基(-NH2)修饰。PCR扩增的反应体系见表3 表 3 3)杂交将生物素标记的PCR扩增产物与固定在RDB检测膜条上的探针杂交，用油性笔在 制备好的检测膜条上编号，放入5ml的离心管中，每个离心管放一张检测膜条，加入4ml的 杂交液I，然后把变性后的PCR产物加入其中，在每个管中加3μ 1的变性的阳性对照质粒 PCR产物，盖好管盖，放入42°C的水浴杂交3h，杂交过程保持摇动。杂交反应体系见表4。表 4
13 表4 中杂交液I是2 X SSC与0. 1 % SDS的混合物；SSC(Saline Sodium Citrate)是氯化钠(Sodium Chloride, BP Saline)和柠檬酸 钠(Sodium Citrate)的混合液；SDS(Sodium Dodecylsulfonate)是十二烧基磺酸钠。杂交3h后，取50ml离心管，加入20ml预热至42°C的杂交液II :0. 5 X SSC与0. 1 % SDS的混合物，放入至多四张检测膜条，在42°C下处理2次，每次5min ；取50ml离心管加入20ml杂交液I，加入7. 5 μ 1溶液I，反应lOmin，可放置十张 检测膜条；经过溶液I处理的检测膜条在室温下用杂交液I处理3次，每次5min，可放置二 至十张检测膜条，每次更换杂交液，必须同时更换离心管；最后，用溶液II洗涤一次，洗涤2min。4)显色现用现配显色液19ml溶液II +2ml溶液III +10 μ 1溶液IV，放入十张检测膜条进 行化学发光显色反应，反应5min后倒掉显色液，加入纯水终止反应，静置2min，取出用试纸 吸干检测膜条的水分后扫描保存显色反应结果。上述杂交和显色采用的试剂名称及浓度见表5。表 5 表5中
SSC(Saline Sodium Citrate)是氯化钠(Sodium Chloride，即Saline)和柠檬酸钠(Sodium Citrate)的混合液；
SDS(Sodium Dodecylsulfonate)是十二烷基磺酸钠；
杂交液I是2×SSC与0．1％SDS的混合物；
杂交液II是0．5×SSC与0．1％SDS的混合物；
POD(Streptavidin peroxidase conjugate)是链霉抗生物素蛋白一辣根过氧化物酶结合物；
／MB(3，3’，5，5’ 一TetramethylbenZidine)是四甲基联苯胺。
5)数据分析和结果判读
分析杂交信号数据时，依据下述判读原则通过肉眼进行判读
(1)显色点必须显示蓝色斑点，如果没有出现，说明膜制备或者杂交过程失败；
(2)阳性对照必须显示蓝色斑点，如果没有出现，说明PCR过程或者杂交过程失败；
(3)如果显色点显示蓝色斑点，而阳性对照点没有出现蓝色斑点，说明PCR过程失败，而制膜和杂交正常；
(4)如果阴性对照或空白对照出现蓝色斑点，说明点样时污染，实验结果不准确；
(5)显色点和阳性对照都显示蓝色斑点，阴性对照和空白对照未出现蓝色斑点，说明实验过程正常，可以判读检测物种；
(6)每条探针的检测点显示蓝色即判读该条探针为阳性。
本具体实施方式
在质控探针正常情况下判读结果如下
当检测探针heae出现阳性信号，判定为昆虫l
双钩异翅长蠹Heter。b。StryChuS aequal i S(Waterhouse)；
当检测探针hebr出现阳性信号，判定为昆虫2
棕异翅长蠹Heter。b。StryChuS brunneus(Murray)；
二突异翅长蠹Heter。b。StryChuS hamatipenniS Lesne；
当检测探针sico出现阳性信号，判定为昆虫4
当检测探针sian出现阳性信号，判定为昆虫5
三胝双棘长蠹Sinoxylon senegalense Karsch；
当检测探针siru出现阳性信号，判定为昆虫7
红角双棘长蠹Sinoxylon ruficome Fahraus；
当检测探针xyfi出现阳性信号，判定为昆虫8
黄足长棒长蠹Xylothrips flavipes(11 l igor)；
当检测探针dimi出现阳性信号，判定为昆虫9
大竹蠹BostrychopsiS parallcla(Lesne)；
当检测探针plpa出现阳性信号，判定为昆虫10 ΦX^t-Ix/hS Platypus parallelus (Fabricius)；当检测探针plso出现阳性信号，判定为昆虫11 散对长小蠹 Platypus solutus Schedl ；当检测探针plqu出现阳性信号，判定为昆虫12 栎长小蠹Platypus quercivorus Murayama ；当检测探针pile出现阳性信号，判定为昆虫13 东亚长小囊 Platypus lewisi Blandford ；当检测探针trso出现阳性信号，判定为昆虫14 维长小囊 Ti^ptoplatypus solidus Walk;当检测探针diqu出现阳性信号，判定为昆虫15 长zj、産 Diapus quinquespinatus Chapuis ；当检测探针dicu出现阳性信号，判定为昆虫16 杯长zj、産 Dinoplatypus cupulatus Chapuis ；当检测探针ditu出现阳性信号，判定为昆虫17 小杯长小蠹 Dinoplatypus cupulatulus Schedl ；当检测探针dica出现阳性信号，判定为昆虫18 声華黄截尾长小囊 Dinoplatypus calamus Blandford ；当检测探针hyli出现阳性信号，判定为昆虫19 长林小蠹 Hylurgus ligniperda Fabricius ；当检测探针orer出现阳性信号，判定为昆虫20 松瘤小蠹 Orthotomicus erosus Wollaston ；当检测探针hyfr出现阳性信号，判定为昆虫21 /Jcffi^PiEzhS Hylesinus fraxini Panzer。
具体实施方式
二用于侵害木材的21种鞘翅目昆虫鉴定的RDB试剂盒本具体实施方式
的试剂盒中包含RDB检测膜条、通用引物、阳性对照质粒、P0D、 ΤΜΒ、Η202以及使用手册，各组分的数量或容积、贮存条件见表6。表 6 本检测试剂盒可实现具体实施方式
一中的21种鞘翅目昆虫的种类鉴定。具有快 速、灵敏和多个种并行检测的能力，检测结果稳定可靠，可应用于出入境检验检疫系统和农 业植保部门对该类昆虫的检测和监控工作，也可用于昆虫物种鉴定或区分的教学实验与研允。 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当 视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
权利要求
一种用于昆虫鉴定的RDB检测膜条，包括通用引物、固相载体、固定在载体上的探针以及PCR阳性质控质粒，所述通用引物为简并引物对TF/TR，所述固相载体是Biodyne C膜，其特征在于所述固定在载体上的探针，是由一组质控探针和RDB检测探针组成的阵列；所述质控探针包括显色点探针、阳性对照探针和阴性对照探针；所述显色点探针，是具有序列表中Seq ID No.1所示的序列，5′ NH2 CAATTGCCTGGGATGTTAC biotin 3′，这是一条19nt的寡核苷酸，序列与鞘翅目昆虫序列无同源性，5′端氨基( NH2)修饰，3′端生物素标记；所述阳性对照探针，是具有序列表中Seq ID No.2所示的序列，5′ NH2 TGAGACCAACCAACTGAAACG 3′，这是一条能和阳性质粒特异结合，阳性质粒上克隆有一段共194nt的序列，这段序列的5′端和3′端分别与简并引物对TF/TR互补，其中TF的5′端氨基( NH2)修饰；所述阴性对照探针，是具有序列表中Seq ID No.3所示的序列，5′ NH2 GACTATAGTATAAGCGCGGTCCA 3′，这是一条23nt的寡核苷酸，序列与鞘翅目昆虫序列无同源性，5′端氨基( NH2)修饰；所述RDB检测探针，均为一段15～19nt的寡核苷酸，5′端都标记有氨基( NH2)。
2.如权利要求1所述的用于昆虫鉴定的RDB检测膜条，其特征在于 所述简并引物对TF/TR序列如下正向引物TF: Seq ID No. 4，序列 5' -biotin-ACA IGAAAG AGG IAAAAA IGAA-3 ‘； 反向引物TR: Seq ID No. 5，序列 5' -ATI GCIAATACI GCI CCTAT-3 ‘， 其中I代表次黄嘌呤，可以与A、C、G、T配对。
3.如权利要求1或2所述的用于昆虫鉴定的RDB检测膜条，其特征在于所述阳性质粒克隆序列如下Seq ID No 6，这是一段5'端和3'端与简并引物对TF/ TR互补的序列，探针序列为c Iacatgaaagagggaaaaaagaa ccgagaaaccatattcagagcgaatcatctgtgagccgtttcagttggtt ggtctcaaaagcccttcctgcccagagtgatctcactcgtcgaggccatcggctctgacgcgatatacggttgtgcc gagtgtcaatagtttcaaatgag jataggggcagtattcgctatj t，所述探针序列是质粒克隆序列中的正义链，方框中的序列为简并引物对TF/TR结合位点。
4.一种用于昆虫鉴定的RDB检测方法，其特征在于 依次有以下步骤1)提取昆虫基因组DNA从昆虫的卵、幼虫、蛹或成虫标本中提取基因组DNA ；2)目标片段PCR扩增用简并引物对TF/TR进行PCR扩增；所述 PCR 扩增的反应条件为 94°C /5min ；94°C /30s_48°C /30s_72°C /30s, 40 个循环； 72 °C /5min ；3)杂交将PCR扩增产物与固定在RDB检测膜条上的探针杂交；4)显色在PCR扩增过程中利用生物素标记PCR产物，所述生物素标记PCR产物，是通过与链霉 抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物、四甲基联苯胺反应进行化学发光显色；所述RDB检测膜条，包括通用引物、固相载体、固定在载体上的探针以及PCR阳性质控 质粒，所述通用引物为简并引物对TF/TR，所述固相载体是Biodyne C膜；所述固定在载体上的探针，是由一组质控探针和RDB检测探针组成的阵列； 所述质控探针包括显色点探针、阳性对照探针和阴性对照探针； 所述显色点探针，是具有序列表中Seq ID No. 1所示的序列，5 ‘ -NH2_CAATTGCCTGGGAT GTTAC-biotin-3'，这是一条19nt的寡核苷酸，序列与鞘翅目昆虫序列无同源性，5 ‘端氨 基(-NH2)修饰，3'端生物素标记；所述阳性对照探针，是具有序列表中Seq ID No. 2所示的序列， 5' -NH2-TGAGACCAACCAACTGAAACG-3‘，这是一条能和阳性质粒特异结合，阳性质粒上克隆 有一段共194nt的序列，这段序列的5'端和3'端分别与简并引物对TF/TR互补，其中TF 的5'端氨基(-NH2)修饰；所述阴性对照探针，是具有序列表中Seq ID No. 3所示的序列，5 ‘ -NH2-GACTATAGTATA AGCGCGGTCCA-3'，这是一条23nt的寡核苷酸，序列与鞘翅目昆虫序列无同源性，5 ‘端氨基 (-NH2)修饰；所述RDB检测探针，均为一段15 19nt的寡核苷酸，5'端都标记有氨基(-NH2)。
5.如权利要求4所述的用于昆虫鉴定的RDB检测方法，其特征在于 所述简并引物对TF/TR序列如下正向引物TF: Seq ID No. 4，序列 5' -biotin-ACAIGAAAGAGG IAAAAAIGAA-3'； 反向引物TR: Seq ID No. 5，序列 5' -ATI GCI AAT ACI GCI CCT AT-3'， 其中I代表次黄嘌呤，可以与A、C、G、T配对。
6.如权利要求4或5所述的用于昆虫鉴定的RDB检测方法，其特征在于所述阳性质粒克隆序列如下Seq ID No 6，这是一段5'端和3'端与简并引物对TF/ TR互补的序列，探针序列为c acatgaaagagggaaaaaagaa丨 ccgagaaaccatattcagagcgaatcatctgtgagccgtttcagttggtt ggtctcaaaagcccttcctgcccagagtgatctcactcgtcgaggccatcggctctgacgcgatatacggttgtgcc gagtgtcaatagtttcaaatgag jataggggcagtattcgctalj t，所述探针序列是质粒克隆序列中的正义 链，方框中的序列为简并引物对TF/TR结合位点。
7.如权利要求6所述的用于昆虫鉴定的RDB检测方法，其特征在于还包括步骤5)数据分析和结果判读。
8.一种用于昆虫鉴定的RDB试剂盒，含有检测膜条，其特征在于所述检测膜条是用于昆虫鉴定的RDB检测膜条，所述RDB检测膜条，包括通用引物、固 相载体、固定在载体上的探针以及PCR阳性质控质粒，所述通用引物为简并引物对TF/TR， 所述固相载体是Biodyne C膜；所述固定在载体上的探针，是由一组质控探针和RDB检测探针组成的阵列； 所述质控探针包括显色点探针、阳性对照探针和阴性对照探针； 所述显色点探针，是具有序列表中Seq ID No. 1所示的序列，5 ‘ -NH2_CAATTGCCTGGGAT GTTAC-biotin-3'，这是一条19nt的寡核苷酸，序列与鞘翅目昆虫序列无同源性，5 ‘端氨 基(-NH2)修饰，3'端生物素标记；所述阳性对照探针，是具有序列表中Seq ID No. 2所示的序列， 5' -NH2-TGAGACCAACCAACTGAAACG-3‘，这是一条能和阳性质粒特异结合，阳性质粒上克隆 有一段共194nt的序列，这段序列的5'端和3'端分别与简并引物对TF/TR互补，其中TF 的5'端氨基(-NH2)修饰；所述阴性对照探针，是具有序列表中Seq ID No. 3所示的序列，5 ‘ _NH2_GACTATAGTATA AGCGCGGTCCA-3'，这是一条23nt的寡核苷酸，序列与鞘翅目昆虫序列无同源性，5 ‘端氨基 (-NH2)修饰；所述RDB检测探针，即能特异鉴定昆虫种类的探针，均为一段15 19nt的寡核苷酸， 5'端都标记有氨基(-NH2)。
9.如权利要求8所述的用于昆虫鉴定的RDB试剂盒，其特征在于 所述简并引物对TF/TR序列如下正向引物TF: Seq ID No. 4，序列 5' -biotin-ACA IGAAAG AGG IAAAAA IGAA-3‘； 反向引物TR: Seq ID No. 5，序列 5' -ATI GCI AAT ACI GCI CCT AT-3'， 其中I代表次黄嘌呤，可以与A、C、G、T配对。
10.如权利要求8或9所述的用于昆虫鉴定的RDB试剂盒，其特征在于所述阳性质粒克隆序列如下Seq ID No 6，这是一段5'端和3'端与简并引物对TF/ TR互补的序列，探针序列为c jacatgaaagagggaaaaaagaa丨 ccgagaaaccatattcagagcgaatcatctgtgagccgtttcagttggtt ggtctcaaaagcccttcctgcccagagtgatctcactcgtcgaggccatcggctctgacgcgatatacggttgtgcc gagtgtcaatagtttcaaatgag Jataggggcagtattcgctat|i t,所述探针序列是质粒克隆序列中的正义 链，方框中的序列为简并引物对TF/TR结合位点。
全文摘要
一种用于昆虫鉴定的RDB检测膜条、检测方法和试剂盒，膜条包括通用引物、固相载体、固定在载体上的探针以及PCR阳性质控质粒，通用引物为简并引物对TF/TR，固相载体是Biodyne C膜，固定在载体上的探针是由一组质控探针和RDB检测探针组成的阵列。质控探针包括显色点探针、阳性对照探针和阴性对照探针。RDB检测探针均为一段15～19nt的寡核苷酸，5′端都标记有氨基(-NH2)。能够快速、准确、直观的对昆虫的成虫、幼虫、卵以及蛹等实现准确分类鉴定，解决了传统形态学昆虫鉴定需要专业分类知识、模式标本比对和昆虫种类多、鉴定困难的难题，特别是不能有效鉴定昆虫幼虫、卵、蛹以及鉴定特征有损坏的成虫的难题。
文档编号C12Q1/68GK101914617SQ20101022848
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者余道坚, 康林, 徐孟杰, 徐浪, 焦懿, 王银竹, 胡斌, 郑耘, 陈乃中, 陈志粦 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心;深圳市检验检疫科学研究院