专利名称：朱砂叶螨scar标记及其特异性pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及植物昆虫鉴定技术，特别是一种朱砂叶螨SCAR标记及其特异性PCR检测方法。
背景技术：
朱砂叶螨属于蛛形纲蜱螨亚纲真螨目叶螨科，俗称红蜘蛛，是农业生产上的重要害螨，该螨寄主范围广泛，主要为害蔬菜和棉花、小麦等重要农作物。朱砂叶螨以成螨和幼若螨聚集在植物叶片的背面进行刺吸为害，造成叶片上出现失绿斑点，严重时出现火烧状， 叶片干枯脱落，甚至植株成片死亡。朱砂叶螨雌成螨梨形，0. 5mm大小，体呈红褐色或锈红色；雄成螨约0. 3mm大小， 腹部末端稍尖。如此微小的个体在田间采用肉眼很难观察清楚。同时，在田间，多种叶螨种类经常同域混合发生，比如在蔬菜田，朱砂叶螨、二斑叶螨和截形叶螨混合发生，而玉米田则以截形叶螨为主，混合发生有其它种类的叶螨。以前研究发现，叶螨种类在不同的地理区域、不同年度经常发生变化。因此，研究此类叶螨首先需要搞清楚其种类，尤其是优势发生种类。传统的种类鉴定方法中，叶螨是根据其雄性外生殖器的形态特征来进行鉴别的 (Hrnra，1999)，然而，由于叶螨是偏雌性比，田间采集到的试虫中，雌性叶螨通常占绝大多数。因此，在传统分类中，为了鉴定叶螨的组成和种类，许多野外采集的叶螨试虫都必须在室内单头饲养到下一代，获得雄性个体，把雄性个体的外生殖器做成切片，待切片在烘箱内烘干之后，结合雌雄成螨的体色在显微镜下观察鉴定。这样的鉴定方法需要耗费较长时间， 大约半个月到一个月，而且研究发现不同地理区域内同种叶螨的外生殖器形态特征也存在较大变异，分类专业人员遇到难以界定的种类时，尚需教科书进行比对，因此这种传统方法对于非分类专业的研究者来说困难重重。但是，害虫的种类鉴定在害虫防治中占有非常重要的地位，准确快速的种类鉴定是进行其它生物学特性研究和防控技术研究的前提和基石出。随着分子生物技术的发展及其广泛应用，DNA条码(DNA barcoding)被用来解决种类鉴定这个问题(Hebert等，2003a，2003b ;Tautz等，2002)。很多研究者由于其mtCOI 基因的母系遗传及多态性的特性而采用该基因进行研究，多数是采用扩增测序mtCOI序列或者ITS2序列并与其它已登录在GenBank上的该基因序列构建系统进化树，分析样本与已知序列之间的同源性和遗传差异远近，进而推断出该基因的所属种类(Hinomoto等，2007 ； Vera等，2007 ；Tselila等，2007)。但是该技术也存在一些缺点和局限性，比如有些叶螨种类的序列在GenBank中未有登录，这样部分物种就得不到有效的聚类，因而无法进行准确分析；另外，该技术需要标本在PCR扩增之后进行测序，这样会耗费大量的时间和财力。限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，简称RFLP)和单链构象多态性(Single-Mranded Confirmation Polymorphisms，简称 SSCP)等技术也通常被用来进行昆虫种类的分子鉴定，但是其过程复杂，需要酶切、扩增或者PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染方法等，都是需要花费较长时间，费时费力。因此，建立一套简便快速的分子鉴定技术对于朱砂叶螨各项相关工作的开展都是至关重要的。以前研究证明，北方地区蔬菜田叶螨种类主要为朱砂叶螨、二斑叶螨和截形叶螨， 其中朱砂叶螨和截形叶螨均为红色体型，二斑叶螨通常为黄绿色体型，这三种叶螨混合在一起发生时，普通技术人员用肉眼基本无法鉴定其种类或者优势种类，非专业技术人员即使在显微镜下也很难根据形态区别各种螨，或区别有益螨和有害螨，因此通过分子生物学方法鉴别蔬菜螨种类，根据鉴别结果施予针对性的防治措施具有重要的价值。
发明内容
本发明根据上述领域的空白和需求，提供一种朱砂叶螨的特异性SCAR标记及其 PCR检测方法，此方法与传统鉴定方法相比，简便快速，省时省力，对分类专业和非分类专业人士来说均易于掌握，是一种快速鉴定朱砂叶螨的方法。一种朱砂叶螨的SCAR标记，具有kq ID No. 2所示的核苷酸序列。一种朱砂叶螨的特异性PCR检测方法，其特征在于PCR扩增体系中采用的特异性正反向引物是根据上述SCAR标记的核苷酸序列设计的，所述特异性正反向引物扩增的区域在所述SCAR标记的核苷酸序列上。所述特异性正反向引物为230F :5，-CGG AAA TCA GAC TAT GTG—3，)，230R 5' -CTG TTG ATA ACG GAG AAA-3，。所述PCR 体系为12· 5μ 1 2 X ES Mix, 1 μ 1 230F, 1 μ 1 230R, 7. 5pg DNA 模板，补充 ddH20 至 25 μ 1。所述PCR扩增的程序为94°C预变性3min，94°C变性lmin，57°C退火45sec，72°C 延伸lmin, 30个循环，最后72°C延伸IOmin0本发明通过筛选RAPD扩增条带中朱砂叶螨的特异性引物，发现并回收克隆了一条569bp的DNA片段，基于此片段设计了一对特异性的SCAR引物，即230F(5，_CGG AAA TCA GACTAT GTG-3，)和 _230R(5，-CTG TTG ATA ACG GAG AAA-3')，可以成功快速地从朱砂叶螨中扩增出一条230bp的DNA条带，而在其同域发生的二斑叶螨和截形叶螨中未扩增到该条带，另外，从山楂叶螨中也未检测到任何条带，说明该片段是朱砂叶螨特有的SCAR标记。 根据SCAR标记的特异性，本领域技术人员可根据该SCAR标记设计出多对特异性引物，只要所设计的引物对的扩增区域在SCAR标记的序列上，既可用于特异性鉴别检测朱砂叶螨。本发明还提供了优化的PCR体系和程序，可以是检测灵敏度达到皮克级别。该特异性SCAR引物对朱砂叶螨种类特异性很强，大大缩短了朱砂叶螨的种类鉴定时间，DNA提取过程需要约6个小时，特异性PCR扩增仅需要2-3个小时，因此整个过程仅需要1天时间即可完成，且准确率高，技术易于掌握。
图10PC-06对三种叶螨的PCR扩增结果，M =Marker VII, 1-4 朱砂叶螨；5-8 二斑叶螨；9-12 截形叶螨；图2特异性SCAR引物在不同叶螨种类中的PCR扩增结果，Ml =MarkerI ； 1-7 朱砂叶螨；9_10 二斑叶螨；11-12 截形叶螨；13-14 山楂叶螨。
具体实施例方式实施例1朱砂叶螨的特异性片段克隆1.材料1. 1供试叶螨朱砂叶螨由南京农业大学植物保护学院提供，同域发生的对照种类二斑叶螨和截形叶螨分别由南京农业大学和福建省农科院植保所提供，这三个种类通过传统的显微镜下观察其雄性外生殖器形态特征及雌性成螨的颜色等形态特征而鉴定。异域发生的叶螨对照种类采用山楂叶螨，由山东省农科院果树所提供。上述叶螨均为已知叶螨，且本实验室均有保存，可向公众发放用于验证试验。1. 2 试剂随机扩增引物采用Operon公司的RAPD通用引物系列，采用0PA、0PB、0PC系列，每个系列包含20条引物。叶螨的基因组DNA提取试剂盒和克隆试剂盒分别购自北京百泰克生物技术有限公司和北京全式金生物技术有限公司，酶Taq MasterMix购自北京康为世纪有限公司。DNAMarker为天根生化科技(北京)有限公司产品。序列测定和引物合成委托上海生物工程公司进行。2.方法2. IDNA 提取单头雌成螨的基因组DNA提取方法采用北京百泰克有限公司的DNA提取试剂盒 (溶液型)，方法参照试剂盒说明书进行。将单头叶螨置于滴有20 μ 1裂解液中的Parafilm 膜上，以0. 2ml的PCR管底部作为勻浆器充分研磨，用另40 μ 1裂解液清洗勻浆器2次，合并混勻；然后以微量移液器移入1. 5ml离心管；加入蛋白酶K 2μ 1，混勻后，55°C条件下水浴4小时；短暂电动离心后，加入RNase2. 5 μ 1，置于37°C烘箱，15 30min ；取出后晾至室温，加入蛋白沉淀液25 μ 1，漩涡振荡器上高速震荡25s ；冰浴5min沉淀蛋白；室温13000r/ min离心5min ；小心吸取上清液到另一个新管中(不要吸入沉淀)，加入等体积的异丙醇， 颠倒混勻30次；室温12000r/min离心lOmin，弃上清；加入Iml 70%乙醇漂洗DNA沉淀，室温12000r/min离心2min，弃上清；加入Iml无水乙醇漂洗DNA沉淀，室温12000r/min离心 2min,弃上清；加入20 μ 1 DNA溶解液，于65°C下水浴60min，放于_20°C保存。DNA的浓度是用UV-2800紫外分光光度计测得，约为0. 006μ g/ml。2. 2RAPD 扩增RAPD扩增反应设为20 μ 1体系。其中，2 X Es Taq MasterMix 为 10 μ 1，DNA 为 1.5 μ 1，RAPD 引物(IOnmol)为 3μ 1，ddH20 为 5. 5 μ 1。PCR反应于S1000PCR扩增仪上进行。PCR扩增程序为94°C进行^iin预变性； 940C lmin, 37°C 45sec，72°C Imin :35s，共进行 40 个循环，之后在 72°C下延伸 lOmin，最后保存于4°C。扩增反应结束后，每种叶螨随机抽取4个样品取样6μ 1，在的琼脂糖凝胶电泳上，于IXTAB缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后于自动凝胶成像系统上照相检测。2. 3特异性扩增产物回收克隆RAPD扩增结果中发现0PC-06引物扩增时，对于朱砂叶螨来说，表现出很强的种的特异性，一条569bp的DNA条带在朱砂叶螨不同个体中稳定出现，在二斑叶螨和截形叶螨中则均未出现，且该特异性条带很亮，见图1。在琼脂糖凝胶电泳上回收该特异性条带，采用DNA纯化试剂盒(北京百泰克)进行纯化，之后把该纯化片段连接到pEASY-T载体(北京全式金)上，转化到T0P10感受态细胞，37°C条件下倒置培养过夜，挑取白色阳性克隆，加入LB液体培养基中37°C过夜振荡培养，最后采用北京百泰克生物技术有限公司的质粒提取试剂盒提取质粒，阳性质粒采用特异性引物扩增验证后，送交上海生物工程技术有限公司进行测序，序列如kq ID No. 1所
7J\ ο实施例2根据朱砂叶螨特异性片段设计引物并获得SCAR标记基于kq ID No. 1，设计一对特异性引物朱砂-230F(5，-CGGAAA TCA GAC TAT GTG-3，)朱砂-230R(5，-CTG TTG ATA ACG GAG AAA-3，)，反应体系设定为25μ 1，其中 2XES Taq Master Mix(含 ES TaqE 5U/yl)为 12. 5 μ 1，230F/230R 分别为 1μ 1，DNA 模板为 1.25 μ 1。反应程序如下94°C预变性3min，之后进行30个循环(94°C变性lmin，57°C退火 45seC，72°C延伸lmin)，最后72°C延伸IOmin0预期扩增片段大小为230bp。采用特异性SCAR 引物对朱砂-230F(5，-CGG AAA TCA GAC TAT GTG-3，)和朱砂-230R(5，-CTG TTG ATA ACG GAG AAA-3，)来对室内保存的朱砂叶螨种群进行PCR扩增， 以二斑叶螨、截形叶螨和山楂叶螨作为对照种群，发现仅在朱砂叶螨种群中出现一条230bp 的特异性条带，而在作为对照的其它三个种类中未出现任何条带，见图2，说明该特异性引物对于朱砂叶螨存在着种的特异性。克隆测序该特异性片段，序列大小及序列信息与预期一致，如kq ID No. 2所示。
权利要求
1.朱砂叶螨的SCAR标记，具有kqID No. 2所示的核苷酸序列。
2.朱砂叶螨的特异性PCR检测方法，其特征在于PCR扩增体系中采用的特异性正反向引物是根据权利要求1所述的SCAR标记的核苷酸序列设计，所述特异性正反向引物扩增的区域在所述SCAR标记的核苷酸序列上。
3.根据权利要求2所述的特异性PCR检测方法，所述特异性正反向引物为 230F 5' -CGG AAA TCA GAC TAT GTG-3，，230R :5’ -CTG TTG ATA ACG GAG AAA-3，。
4.根据权利要求3所述的特异性PCR检测方法，所述PCR体系为12.5μ 1 2XES Taq MasterMix, 1 μ 1 230F, 1 μ 1 230R, 7. 5pg DNA 模板，补充 ddH20 至 25 μ 1。
5.根据权利要求3或4所述的特异性PCR检测方法，所述PCR扩增的程序为94°C预变性;3min，94°C变性 lmin，57°C退火 45sec，72°C延伸 lmin，30 个循环，最后 72°C延伸 IOmin0
全文摘要
本发明“朱砂叶螨SCAR标记及其特异性PCR检测方法”，属于植物昆虫鉴定技术，所述朱砂叶螨的SCAR标记，具有Seq ID No.2所示的核苷酸序列；朱砂叶螨的特异性PCR检测方法，其特征在于PCR扩增体系中采用的特异性正反向引物是权利要求1所述的SCAR标记的核苷酸序列设计的，所述特异性正反向引物扩增的区域在所述SCAR标记的核苷酸序列上。此方法与传统鉴定方法相比，简便快速，省时省力，对分类专业和非分类专业人士来说均易于掌握，是一种快速鉴定朱砂叶螨的分子生物学方法。
文档编号C12Q1/68GK102181551SQ201110098889
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月20日 优先权日2011年4月20日
发明者吴青君, 张友军, 徐宝云, 戴宇婷, 王少丽, 王相晶 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所