一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株的制作方法

专利名称：一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株。
背景技术：
四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TTMP)，又名川芎嗪，是吡嗪环碳原子上均连 接甲基的含氮杂环化合物。TTMP天然存在于可可制品、咖啡、乳制品、肉、花生、榛子、朗姆 酒、威士忌酒和大豆制品中，作为天然香料具有烘烤、花生、榛子、可可香气，主要用于烘烤 食品、冷饮、肉类、乳制品、卷烟等香精的调配；同时，TTMP作为活血行气祛瘀中药材川芎 (Ligusticum wallichii)根茎的主要活性生物碱成分，具有扩张血管、改善微循环及抑制 血小板集聚等药理作用，现已作为一种新型的钙离子拮抗剂广泛应用于临床，是循环、中枢 神经、呼吸及其它系统相关疾病的大宗用药，广泛应用于心脑血管疾病、呼吸系统疾病、肾 小球疾病等的治疗；近年来，在中国传统白酒中亦检测到TTMP和其它烷基吡嗪类化合物， 它们通常具有较低的风味阈值，因此被认为对中国白酒的酱香型风味有重要的贡献；同时， TTMP可以用作光敏剂以及医药和农药的中间体。TTMP的生产方法可分为生物合成法、直接从植物中提取法和化学合成法三种。 TTMP的直接萃取法由于川芎植物来源有限，且TTMP在川芎中的含量较低，导致后提取成本 过高，在工业化大规模生产方面仍存在困难。利用美拉德反应和Strecker降解化学法合 成吡嗪类化合物由于产物成分复杂且产率较低，尚未有大规模工业化生产的报道。利用非 Strecker降解的方法化学合成TTMP亦有大量的研究，包括化学合成法和催化合成法，但普 遍存在较严峻的环保问题，反应条件一般较剧烈，对设备要求较高，且产品不属于‘天然’或 ‘生物合成’范畴。随着人们对绿色产品需求的日益提高，利用生物工程的手段生产四甲基 吡嗪具有产品绿色天然、成本低、反应条件温和、环境污染小等优点而广受消费者关注。利用微生物发酵生产TTMP的相关研究较晚，且目前普遍认为发酵体系中TTMP的 合成是细胞自身代谢过程中酶促催化反应的产物。1993年，日本Yamaguchi等人考察了不 同碳源对Bacillus natto液态发酵生产吡嗪类化合物的影响，发现以葡萄糖为碳源时总吡 嗪产量较高，但仅为42mg/L ；法国Besson等人利用B. subtilis IF03013以大豆为培养基 固态发酵法生产TTMP，通过添加适量前体乙偶姻，发酵14天后，TTMP产量达2. 5g/kg固态 培养基(相当于0.58g/L)。由上可知，虽然枯草杆菌能够利用自身的代谢途径“从头合成” 吡嗪类化合物，且添加前体物质可以有效强化代谢通路，但野生菌株发酵生产TTMP的能力 仍较低，难以进行工业化生产。本实验室在前期研究的基础上，开发出了一株枯草芽胞杆菌XZ1124，该菌株发酵 120小时，TTMP的产量达3. 92g/L ；在研究中还发现，该菌株能够大量合成TTMP前体物质乙 偶姻，研究人员推测乙偶姻可能通过生物酶催化的方式生成TTMP(—株高产四甲基吡嗪的 枯草芽胞杆菌及其发酵生产四甲基吡嗪的方法，专利申请号=200810235366. 1)；然而，局 限于尚未有对微生物发酵生产TTMP特性的考察以及基于TTMP合成特性的发酵调控方面的 报通，未能开发出相应技术，通过应用该菌株发酵积累前体乙偶姻以及发酵体系中TTMP的合成特性，进一步提高TTMP的产量。

发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供生产四甲基吡嗪(TTMP)的菌株，所述菌株 其分类命名为地衣芽孢杆菌UaciWiAS Iicheniformis) BL-Ll, MT-6和MT-15，已于2010 年6月28日保藏于CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院，其保藏编号分别为CGMCC NO :3961、3962和3963 ；枯草芽孢杆菌(feci/A/s subtil is) TL112A,已保藏于中国典型培 养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO =M 208157(—株高产四甲基吡嗪的枯草芽胞杆菌及 其发酵生产四甲基吡嗪的方法，专利申请号=200810235366. 1)。本发明所要解决的另一个技术问题是提供了一种生产四甲基吡嗪(TTMP)的方法。为解决上述技术问题，本发明建立了微生物两步法制备TTMP的工艺；首先，利用 微生物发酵积累前体乙偶姻，然后，发酵体系中的乙偶姻和氨经非酶促催化反应生成TTMP ； 其以内源方式积累前体乙偶姻，有效提高了乙偶姻的利用率以及TTMP的产量。本发明所采用的具体技术方案如下1.微生物发酵积累内源前体乙偶姻(1)弱酸胁迫的发酵策略在利用Bacillus licheniformis BL_L1、MT_6 和 MT-15 以及 Bacillus subtilis XZ1124发酵积累前体乙偶姻的过程中，通过流加8mol/L HCl或8mol/L NaOH控制发酵体系 pH为5. 5-6. 0，发酵时间48h。(2)补加葡萄糖的发酵策略在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XZ1124发酵积累前体乙偶姻的过程中，初 始葡萄糖浓度为80g/L，培养36h时，补加50-80g/L葡萄糖，继续发酵至乙偶姻达到峰值。在地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BL-L1、MT-6 和 MT-15 发酵积累前体 乙偶姻的过程中，初始葡萄糖浓度为60g/L，培养24h时，补加70-100g/L葡萄糖，继续发酵 至乙偶姻达到峰值。(3)两阶段搅拌转速控制策略在枯草杆菌(Bacillus subtilis)发酵积累前体乙偶姻的过程中，0_14h，控制培 养温度搅拌转速为700rpm ； 14h后，控制搅拌转速为500rpm，继续发酵至乙偶姻达到峰值。在地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BL-L1、MT-6 和 MT-15 发酵积累前 体乙偶姻的过程中，0-12h，控制培养温度搅拌转速为650rpm;12h后，控制搅拌转速为 500rpm,继续发酵至乙偶姻达到峰值。上述摇瓶种子液的培养基为YPG培养基，以g/L计葡萄糖100，蛋白胨30，酵母膏 10，磷酸氢二铵30，121°C灭菌20min，装液量50mL/250mL ；培养方法斜面活化培养37C培 养18-24h ；种子培养从斜面上挑取一环菌体接入液体种子培养基，在摇床上以200r/min 的转速进行培养。上述发酵罐发酵的培养基为YG培养基，以g/L计葡萄糖100，酵母膏30，磷酸氢 二铵30，121°C灭菌20min ；培养方法-J. 5L全自动发酵罐分批发酵装液量5L/7. 5L发酵 罐，接种量 4%，通气量 lvvm，37°C，流加 8mol/L HCl 或 8mol/L NaOH 控制 pH 5. 5-6.0。
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2.乙偶姻和氨反应生成TTMP将上述含有乙偶姻的微生物培养液以IOOOOrpm离心lOmin，去除菌体，取上清液 测定乙偶姻的含量；向上述微生物培养液中加入2倍相应乙偶姻摩尔浓度的磷酸氢二铵， 溶解后，于55°C水浴摇床(150rpm)反应16_20h。本发明运用代谢流量分析的手段，确定了 Bacillus subtilis XZ1124、Bacillus IicheniformisBL-LK Bacillus licheniformis MT一6 禾口 Bacillus licheniformis MT-15 两步法合成TTMP的主要途径，以及不同培养条件对上述微生物发酵体系中相关代谢流量 分布的影响，通过动力学分析，进而提出了合成乙偶姻和TTMP的分阶段发酵控制策略。本发明的微生物两步法发酵生产TTMP工艺在7. 5L发酵罐上完成，通过自动流加 装置以及不同的转速条件实现相应的发酵控制，在微生物分批发酵过程中，在线监测溶氧、 pH，离线监测发酵过程中菌体干重、残糖、有机酸(乳酸和乙酸)、乙偶姻和TTMP的含量。在已知上述代谢产物的基础上，运用发酵动力学分析的手段，对不同条件下上述 微生物发酵各代谢物的流量分布进行分析，探索菌体生长和乙偶姻、TTMP发酵特征，进而提 出相应的发酵控制策略，并对该控制策略进行验证和分析。本发明基于发酵过程分析以及相关验证试验，证明发酵体系中TTMP的生成是微 生物代谢产生的前体乙偶姻和氨非酶促催化反应的产物，将发酵体系中TTMP的生成过程 分为两个阶段一是前体乙偶姻的积累阶段，二是TTMP的非酶促合成阶段；基于两个阶段 对培养环境要求的差异，建立微生物两步法制备TTMP的工艺，并对该控制策略进行验证和 分析。本发明的有益效果本发明提出了一种高效制备TTMP的方法，首先，通过应用发 酵控制策略，促进细胞的快速增殖与前体乙偶姻的大量积累，在此基础上，选择适宜的反 应条件，促进发酵体系中乙偶姻和氨反应生成TTMP ；应用上述方法，最终发酵体系中TTMP 的浓度可达16-20g/L。该工艺具有生产方法简单，条件温和，原料来源丰富和生产成本低等 特点，具有诱人的工业应用前景。


图1胞外酶促催化反应的验证；A，胞外粗酶液添加量对TTMP生成的影响；B胞外 粗酶浓缩液对TTMP生成的影响图2B. subtilis XZl 124发酵体系中TTMP合成途径示意3微生物两步法制备TTMP工艺的示意4B. licheniformis BL-L1在弱酸胁迫条件下的发酵过程曲线图5应用搅拌转速控制策略的B. licheniformis MT-15发酵过程曲线图6应用葡萄糖补加策略的B. subtilis XZ1124发酵过程曲线图7乙偶姻和氨反应生成TTMP的过程曲线
具体实施例方式实施例1 乙偶姻和氨反应生成TTMP的验证(1)胞外酶促催化反应的验证为验证发酵体系中前体乙偶姻和氨反应生成TTMP 的过程是否存在胞外酶促催化反应，设计模型体系，该模型体系中含有一定浓度的乙偶姻和30g/L的DAP，调节模型体系的pH为7. 0。将枯草杆菌XZ1124接种于YG培养基中进行摇瓶培养。取培养48h的发酵液， SOOOrpm离心15min，上清液过0. 22 μ m的水膜，所得的澄清液作为胞外粗酶液。向上述模 型体系中加入一定体积的粗酶液，剧烈震荡后作为反应的开始，以加入相同体积去离子水 的反应为空白。假设胞外粗酶液中存在相关酶催化乙偶姻和氨反应生成TTMP，提高模型体系中胞 外粗酶液添加量则能够促进乙偶姻和氨反应生成TTMP ；同时，将胞外粗酶液用IOKD超滤膜 过滤，分别制得2X、3X和4X的浓缩液，将该系列浓缩液和原液(IX)以及滤液(filtrate) 分别作为胞外粗酶液加入到乙偶姻/DAP模型体系中，考察不同胞外粗酶添加量和浓缩液 对TTMP的生成的影响，结果如图1所示。由图KA)可知，增大模型体系中胞外粗酶液的添加量，反应结束时TTMP的增加量 相应提高，表明胞外粗酶液中存在促进TTMP合成的因素。为验证该因素是否与大分子量的 酶蛋白的催化相关，将胞外粗酶液用IOKD的超滤膜浓缩，得到不同浓缩倍数的胞外粗酶 浓缩液。已知的氧化还原酶分子量均超过10KD，经Bradford法检测，各浓缩液中蛋白含量 基本呈相应的倍数关系。然而，根据图I(B)的结果，模型体系中加入胞外粗酶浓缩液后并 未有相应的TTMP增长量，且TTMP增量与滤液作为粗酶液时的TTMP增量相当。上述研究 结果表明，胞外粗酶液中含有促进乙偶姻和氨反应生成TTMP的因素，但该促进因素并非由 酶液中的酶蛋白催化导致，因此，胞外粗酶液中不存在相关的酶参与乙偶姻和氨反应生成 TTMP的过程。(2)胞内酶促催化反应的验证假设枯草杆菌XZ1124细胞内存在相关酶催化乙偶 姻和氨反应生成TTMP，把整细胞看作生物催化剂，将不同培养时间的发酵液IOOOOrpm离心 20min,上清液用0. 22 μ m膜过滤，去除残余细胞，得到的滤液继续放置于枯草杆菌XZl 124 培养环境进行反应(控制总时间为6天)，考察无细胞体系中TTMP的生成情况。表1无细胞体系中乙偶姻和氨反应生成TTMP的情况
权利要求
一种生产四甲基吡嗪的方法，以枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)XZ1124 CCTCC NOM 208157为出发菌株，其特征是首先微生物发酵积累前体乙偶姻，然后向发酵体系中添加铵盐，乙偶姻和氨经非酶促催化反应生成四甲基吡嗪。
2.如权利要求1所述的生产四甲基吡嗪的方法，其特征是微生物发酵积累前体乙偶姻 的过程中，应用PH 5. 5-6. 0弱酸胁迫的条件，促进前体乙偶姻的积累。
3.如权利要求1所述的生产四甲基吡嗪的方法，其特征是在微生物发酵积累前体 乙偶姻的过程中，采用葡萄糖补加策略，初始葡萄糖浓度为60-80g/L，培养24-36h，补加 50-100g/L葡萄糖，继续发酵至乙偶姻达到峰值。
4.如权利要求1所述的的生产四甲基吡嗪的方法，其特征是在微生物发酵积累前体乙 偶姻的过程中，采用两阶段搅拌转速控制策略，0-12h，控制搅拌转速为700rpm ； 12h后，控 制搅拌转速为500rpm，继续发酵至乙偶姻达到峰值。
5.如权利要求1所述的生产四甲基吡嗪的方法，其特征是在乙偶姻和氨反应生成四甲 基吡嗪的过程中，向微生物培养液中加入1. 5-3. 0倍乙偶姻摩尔浓度的磷酸氢二铵，溶解 后，于温度55-90°C、转速150rpm水浴摇床反应16_20h，最终得到浓度为16_20g/L的四甲 基吡嗪。
6.如权利要求1或2所述的的生产四甲基吡嗪的方法，其特征是微生物发酵积累前体 乙偶姻的优选培养基为以g/L计，以蒸馏水定容至1L，选用葡萄糖100，酵母膏30，磷酸氢二铵 30。
7.应用权利要求1所述方法生产四甲基吡嗪的菌株，其特征是该菌株还可以为地衣芽 孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL-Ll、MT_6 和 MT-15 中任——株。
8.如权利要求7所述的菌株，其特征是地衣芽胞杆菌BL-Ll，该菌株已保藏于中国普通 微生物菌株保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC NO :3961。
9.如权利要求7所述的菌株，其特征是地衣芽胞杆菌MT-6，该菌株已保藏于中国普通 微生物菌株保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC NO :3962。
10.如权利要求7所述的菌株，其特征是地衣芽胞杆菌MT-15，该菌株已保藏于中国普 通微生物菌株保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC NO :3963。
全文摘要
本发明公开了一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株，具体地说是一种微生物利用还原糖发酵积累前体乙偶姻、以及乙偶姻和氨经非酶促反应合成四甲基吡嗪的两步法生产工艺，属于生物工程技术领域。所述微生物为枯草芽孢杆菌(CCTCC NOM 208157)、地衣芽孢杆菌(CGMCC NO3961)地衣芽孢杆菌(CGMCC NO3962)以及地衣芽孢杆菌(CGMCCNO3963)中任一一株，上述菌株利用还原糖发酵获得生物量并积累内源前体乙偶姻，然后，发酵体系中的乙偶姻和氨经非酶促催化反应合成四甲基吡嗪。本发明的优点如下1.获得较高的菌体量，且乙偶姻积累量得以有效提高(38-44g/L)；2.高浓度的内源前体乙偶姻和氨在适宜的条件下可快速反应生成四甲基吡嗪(16-20g/L)；3.内源乙偶姻的积累以及原位发酵环境，显著提高了前体的利用率(40.3％)。
文档编号C12N1/20GK101955980SQ20101023868
公开日2011年1月26日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者徐岩, 朱兵峰 申请人:江南大学