专利名称：可利用甲烷的微杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体的说涉及一种可利用甲烷的微杆菌及其应用。
背景技术：
甲烷氧化菌是一种特殊的、以甲烷为唯一碳源和能源的甲基营养型微生物，分布 范围很广，在酸、碱、盐、高温、低温、贫瘠等很多环境下都发现甲烷氧化菌存在。其特殊的代 谢过程和代谢产物对全球环境具有重大影响，已经引起广泛的关注。甲烷氧化菌不仅在全 球甲烷消耗中起重要作用，而且在碳、氮、氧循环中也发挥着重要作用。甲烷氧化菌是一种革兰氏阴性菌，严格寡营养型。自1906年首次分离出 甲烷氧化菌以来，至今已经发现的甲烷氧化菌共有8个属，主要包括甲基单胞菌属 (Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基孢囊 菌属(Methylocytis)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium) > Methylocaldum和Methylospera。根据代谢途径、膜结构、主要磷脂脂肪酸成分等系列特 征，可将甲烷氧化菌分为I型、II型和X型三大类型。甲烷氧化菌对甲烷氧化途径有两条， 一条是通过由乙醛酸到丝氨酸的途径，另一条是甲醛结合在磷酸核糖上生成6-磷酸阿洛 酮糖的途径。这些菌可以利用任何一条途径来进行同化，总反应式CH4 — CH3OH — HCHO — HCOOH — CO2甲烷氧化菌的特征酶是催化第一步反应的甲烷单加氧酶 (methanemonooxygenase,ΜΜ0)，MMO能断裂非常稳定的C-H键，将分子氧中的一个氧原子插 入C-H中，另一个氧原子则生成水。它有两种不同的类型颗粒状或膜结合甲烷单加氧酶 (particulatemethane monooxygenase, pMMO)禾口可溶性甲烧单力口氧Bl (soluble methane monooxygenase, sMMO)。甲烷氧化菌研究速度过快导致了目前国内外研究报道中对该类细菌的称谓存 在着不统一和歧义。以文献报道为依据，对甲烷氧化菌进行全面介绍最早可追溯到1958 年，Leadbetter总结了自1906年首次发现甲烷氧化菌以来的研究成果，文章之所以提及 甲烷利用细菌而不是甲烷氧化菌，主要是因为当时研究条件以及研究深度和广度的局限， 并不能给出这一类菌的共同特征。在伯杰细菌手册第八版(1984)中，将这一类菌归属于 了甲基单胞菌科，并定义这一类菌仅利用单碳有机化合物作为碳源，属于革兰氏阴性菌。 1996年，Hanson对甲烧氧化菌的称谓进行了统一，即Methane-oxidation bacteria和 Methane-utilizingbacteria 者β^Τ禾尔为 methanotrophs。在伯杰细菌手册关于甲基单胞菌科的描述中发现了另一个重要的信息，“许多细 菌是能利用多碳化合物以及单碳化合物，而不是专依靠甲烷或甲醇作为碳源和能源”。与 传统意义上只以甲烷为唯一碳源和能源的甲烷氧化菌相区别，此类细菌称之为兼性营养甲 烷氧化菌(facultative methanotrophs)。经典生物学研究在培养基优化中很少关注以甲 烷为碳源，目前，已有一些文献报道了非甲烷氧化菌可以消耗甲烷。Wolf早在1979年就 发现了可以利用甲烷的酵母菌，目前有许多甲烷利用酵母被分离和纯化，其中包括Pichiapastoris, Hansensulapolymorpha, Candida spp.，and Trichsporon spp.。兼性营养甲烷氧化菌可以利用其它碳源，因此更易实现扩大培养。生活垃圾在漫 长的降解过程中富含了丰富的微生物，前期研究表明矿化垃圾具有很好的降解甲烷能力， 从生活垃圾填埋场中提取兼性营养甲烷氧化菌有望在生活垃圾填埋场等人为源甲烷减排 的工程化方面取得新的突破，并为甲烷氧化在温室气体方面的工程应用提供新的平台。
发明内容
本发明针对现有技术中甲烷生物无法工程化方面存在的不足之处，提供一种可以 高效利用甲烷的微杆菌，其保藏号为CCTCC NO :M2010099，其16SrDNA序列如SEQ ID NO 1 所示。本发明所述的可利用甲烷的微杆菌，其菌落直径Imm左右，淡黄色，半透明，突起， 边缘光滑；革兰氏染色阴性；最佳生长温度为25 40°C，pH为6. 5 7. 5。本发明所述的可利用甲烷的微杆菌可用于制备甲烷生物吸收剂、垃圾处理剂或生 物催化剂。本发明的微杆菌DH(保藏号为CCTCC NO :M2010099，保藏单位为中国典型培养物 保藏中心-武汉大学保藏中心)，从生活垃圾填埋场矿化垃圾中分离得到的。该菌可高效利 用甲烷。菌株DNA的测序委托大连宝生物公司完成，微杆菌DH 16S rDNA碱基测定的长度 为1397bp (SEQ ID NO 1),碱基序列在GenBank核酸序列数据库进行比较发现与微杆菌属 (Microbacterium sp.)的3个菌株的同源性在99%以上。通过对该菌株进行的一系列生 理生化以及工艺优化试验表明，本发明提供的可利用甲烷的微杆菌(MicrcAacterium sp.) DH(保藏号为CCTCC NO :M2010099)，可有效解决人为源甲烷的减排，主要优点如下(1)微杆菌(MicrcAacterium sp.)DH的发现克服了甲烷氧化菌菌体密度低，菌体 难于扩大培养等应用困难。(2)用微杆菌(MicrcAacterium sp.)DH的完整细胞作为生物催化剂，液体培养菌 体密度(560nm下菌液吸光度)可达到1. 1以上，比传统甲烷氧化菌液体培养密度高出约 50% ；脱离环境体系后仍可维持较高的甲烷氧化活性；适用于高浓度甲烷氧化，血清瓶中浓 度为40% (ν/ν)的甲烷可完全降解。(3)该菌利用甲烷的半饱和常数Ks为7. 097mmol/L，远低于目前报道的66mmol/L。 半饱和常数Ks越低说明菌体与底物的亲和性越高，因此该菌对甲烷有较高的亲和性。(4)微杆菌(MicrcAacterium sp. ) DH扩大培养所需的培养基简单，成本低。特别 适用于生活垃圾填埋场、水稻田等甲烷人为源，可以广泛推广。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
图1是微杆菌(MicrcAacterium sp. )DH菌株切胶回收目的片段的DNA电泳图，M DL2000DNAMarker ；1 :DH_PCR 产物；+ 正对照；-负对照；图2是微杆菌(MicrcAacterium sp. )DH菌株的电镜扫描照片；图3表示微杆菌(MicrcAacterium sp. )DH菌株以甲烷为碳源的生长曲线；
图4是不同碳源培养的微杆菌(MicrcAacterium sp. ) DH菌株对甲烷降解效果图；图5是不同碳源培养的微杆菌(MicrcAacterium sp.)DH菌株代谢过程二氧化碳 生产效果图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。1.实验材料NMS 培养基的组成如下(g/L) =KH2PO4L Og · Λ Na2HPO4 · 12Η20 2. 9g · Λ MgSO4 ·7Η20 0. 32g ·ΙΛ (NH4) 2S043. Og · Γ1，微量元素溶液 10ml，蒸馏水 990ml，pH 6. 8。微量 元素溶液组成如下(mg/L) =ZnSO4 ·7Η20 0. 287 ；MnSO4 ·7Η200· 223 ；H3BO3O. 062 ；Na2M0O4 ·2Η20 0. 048 ；COCl2 · 6Η20 0. 048 ；KI 0. 083 ；CaCl2 · 2Η20 3. 5。垃圾颗粒选自生活垃圾填埋场矿化垃圾，本实施例选取上海老港垃圾填埋场(上 海市南汇区老港东部)已填埋10年的垃圾，取4mm筛下和2mm筛上垃圾颗粒，在甲烷和空 气混合气中密闭驯化2周以实现菌株的复壮。2.菌种富集与优化实验1)富集培养称取矿化垃圾Ig放入IOOml匪S培养基中，置于30°C、160转/min 摇床振荡2h。取菌悬液2ml作为种子接入分装了 20ml匪S培养基的IOOml血清瓶中，加盖 橡胶塞密封；用20ml甲烷气置换瓶内20ml空气，然后在30°C、160转/min条件下振荡培养一周。2)纯菌分离用已冷却的无菌蒸馏水对菌液进行10倍系列稀释，制成稀释度为 IO-1 UO-2的稀释液。采用倾注法进行NMS培养基培养。将平板倒置于真空干燥器中，并向干 燥器中通入一定量的甲烷，然后用保鲜膜封口。将干燥器置于生化培养箱中，30°C培养4 5天。将长势好的菌种进行多次传代，纯化。3)优化实验利用纯菌株制备一定浓度的菌悬液，加入到装有一定量匪S培养基 的血清瓶中；用甲烷置换瓶内空气，之后具塞密封。在30°C、160转/min条件下振荡培养。 间隔一段时间检测菌液浓度以及生物气浓度。随着甲烷的消耗，需定期补充一定体积的氮 气，以消除瓶中负压。3.菌种鉴定实验使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (Code No. D310) 进行PCR扩增目的片段。取5μ1进行3%琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRa Agarose GelDNAPurification Kit Ver. 2. 0 (Code No. DV805A)切胶回收目的片段进行DNA测序。DNA 的测序委托大连宝生物公司完成。Wkq Forward,Seq Reverse、Seqhternal为引物进行 DNA测序。4.检测方法菌液的OD值采用UV2000分光光度计检测，波长为560nm。活细胞浓度采用平板 菌落计数法确定。菌体干重通过一定体积的菌液在80°C下烘干至恒重，用精密电子天平称 量。每个实验最少做2组平行试验，确保RSD小于5%。甲烷的检测采用气相色谱(安捷伦6890N)。色谱条件⑶X不锈钢柱(IOmX 2mm)， 进样口温度、柱温以及检测器(TCD)温度分别为80、50、120°C，氢气为载气，流速为25ml/min,进样量 0. 5ml。实施例1微杆菌Microbacterium sp. DH的纯化与鉴定该菌属革兰氏阴性，平铺在整个培养皿中，表面光滑，呈现一层黄色油脂状，有的 上面有淡黄色小菌落，菌落直径Imm左右，半透明，突起，边缘光滑；颜色有淡黄、黄色和桔 黄色，根据培养基及培养条件颜色有所不同。细胞电镜扫描照片见图2。细胞为短杆状，中 间向内凹陷，似圆盆形，外径0. 6 0. 7um,内径0. 2 0. 4um，可产生有荧光的扩散性黄色 素。菌株的主要生理生化特性见表1。表1微杆菌Microbacterium sp. DH的理化特性
权利要求
1.一种可利用甲烷的微杆菌，其特征在于，其保藏号为CCTCC NO :M2010099o
2.根据权利要求1所述的可利用甲烷的微杆菌，其特征在于，其16SrDNA序列如SEQ ID NO 1 所示。
3.根据权利要求1或2所述的可利用甲烷的微杆菌，其特征在于，菌落直径Imm左右， 淡黄色，半透明，突起，边缘光滑；革兰氏染色阴性。
4.权利要求1所述的可利用甲烷的微杆菌在制备甲烷生物吸收剂中的应用。
5.权利要求1所述的可利用甲烷的微杆菌在垃圾处理中的应用。
6.权利要求1所述的可利用甲烷的微杆菌在制备生物催化剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种可利用甲烷的微杆菌及其应用。该微杆菌的保藏号为CCTCC NOM2010099。其可用于制备甲烷生物吸收剂、垃圾处理剂、生物催化剂。该微杆菌克服了甲烷氧化菌菌体密度低，菌体难于扩大培养等应用困难，对甲烷有较高的亲和性。特别适用于生活垃圾填埋场、水稻田等甲烷人为源，可以广泛推广。
文档编号C12R1/01GK102071160SQ20101026010
公开日2011年5月25日 申请日期2010年8月23日 优先权日2010年8月23日
发明者全学军, 张丽杰, 赵天涛, 赵由才, 邓郁平 申请人:重庆理工大学