一种肝素酶Ⅱ融合蛋白及其编码基因与表达方法

专利名称：一种肝素酶Ⅱ融合蛋白及其编码基因与表达方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和发酵工程领域中一种肝素酶Ii融合蛋白及其编码基因与 表达方法。
背景技术：
肝素酶(h印arinase)是一类作用于肝素Q^parin)或者硫酸乙酰肝素O^paran sulfate)的多糖裂解酶，在许多种微生物中发现，包括棒杆菌Corynebacterium sp.(高 宁国等，肝素酶产生菌的筛选及发酵条件，微生物学报1999 Vol. 39 :64_67)、鞘胺醇 杆菌Sphingobacterium sp.(高宁国等，鞘胺醇杆菌肝素酶的产生，微生物学报2003 Vol. 43 :813-816)、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (王忠彦，肝素酶产生菌的筛选及 其粗酶性质的研究，四川大学学报(自然课学版)2002 Vol. 39:777-779)、环状芽孢杆菌 Bacillus circulans(Yasutaka Tahara et al. , Purification and characterization of heparinase that degrades both heparin and heparin sulfate from Bacillus circulans BioSci.Biotechnol. Biochem. 2002 Vol. 66 :1181_1184)、解肝素拟杆 菌 Prevotella heparinolytica(Kazuyuki Sugahara et al. ， Characterization of heparinase from an oral bacterium Prevotella heparinolytica J.Biochem. 1998 Vol. 123 :283-288)、粪便拟杆菌 Bacteroides stercoris HJ-15 (Dong Hyuu Kim et al.， Purification and characterization of a novel heparinase from Bacteroides stercoris HJ-15 J. Biochem. 2000 Vol. 128 :323_328)和月干素黄杆菌 Flavobacterium hepar inum (Sas i ekharan, R. 1991 Ph. D. Thesis，Havards University)。但是来自月干素黄杆 菌的肝素酶是商业化的唯一来源。肝素酶的研究具有十分重要的意义(Sasiekharm，R. 1991 Ph. D. Thesis， Havard University ；Sasiekharan, R. et al.，A comparative analysis of the primary sequences and characteristics of heparinase I， II and III from Flavobacterium heparinum Biochemical and Biophysical Research Communication 1996 Vol. 229770-777)肝素酶是多糖裂解酶的一种，用于研究肝素酶及其底物多糖肝素之间的相互作 用，有助于阐明多糖裂解酶的作用机制；肝素酶可以用于解析肝素等复杂粘多糖的结构及 其生物学功能；肝素酶可以用于解析人体内的凝血和抗凝血机制；肝素酶可以用作临床血 液肝素化的去除，防止手术后出血；肝素酶用于PCR反应前血液制品的处理；肝素酶可以用 于制备低分子的抗凝血药物低分子量肝素。来自肝素黄杆菌的肝素酶主要有三种，分别命名为肝素酶I (EC 4. 2. 2. 7)、肝素酶 II (No EC code)和肝素酶 III (EC 4. 2. 2. 8) (Robert J. Linhardt et al. , Purification and characterization of heparin lyases from Flavobacterium heparinum JBC 1992Vol. 267 =24347-24355)。肝素酶I主要作用于肝素，分子量43kDa，肝素酶II作用于 肝素和硫酸乙酰肝素，分子量85kDa，肝素酶III主要作用于硫酸乙酰肝素，分子量73kDa。 其中，对肝素酶I的研究较多，而对肝素酶II和III的研究相对较少。
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硫酸乙酰肝素蛋白聚糖是一种结构复杂的酸性蛋白聚糖，参与体内一系列的生理 和病理过程，如胚胎发育、神经突生长、血管形成、组织修复、炎症、自身免疫、肿瘤生长和转 移等(Kjellen L，Lindahl U· Proteoglycans-Structures and interactions Annu Rev Biochem,1991 Vol. 60 440-443 ；Bernfield M， Gotte M， Park P W， et al. Functions of cell surface heparan sulkfate proteoglycans Annu Rev Biochem，1999，68 :726_729)。 硫酸乙酰肝素的酶解是其发挥上述作用的主要因素。酶解后可以释放并激活各种与它结合 的活性分子，从而影响各种生理及病理过程。因此，降解硫酸乙酰肝素的酶是至关重要的调 节因子，研究该酶(肝素酶II)具有重要的理论意义和应用价值。然而肝素酶II通常是从 肝素黄杆菌发酵液中提纯获得的，肝素黄杆菌生产肝素酶II的同时产生肝素酶I、III和四 种软骨素酶(chondroitinase B, C，ABC, AC)，使肝素酶II的分离纯化变得复杂，通常需要 经过多步的色谱纯化，收率很低。肝素黄杆菌增长速度慢，肝素酶的生产稳定性差，而且，产 肝素酶需要价格昂贵的肝素诱导，增加了酶的成本，因而肝素酶II的异源重组表达是替代 肝素黄杆菌生产肝素酶Π的有效可行的方案。然而对肝素酶II的异源重组表达研究非常有限，到目前为止，文献报道只有傅文 彬和Su等人对其进行了研究。傅文彬等人利用pET表达系统实现了肝素酶II在大肠杆 菌中的重组表达，SDS-PAGE电泳结果显示有目的蛋白条带，但表达量很低，且容易形成包 涵体，可溶性肝素酶活性仅为50U/L A_(傅文彬，余晓等，黄杆菌肝素酶II的克隆与表达， 食品与药品，2007，Vol. 91-4) ；Su研究中所表达的肝素酶II活性有所提高，但是需要多 步纯化，致使纯化费用比较高，不利于工业化应用(Su H，blain F，Musil RA, Zimmermann JJF, Gu K, Bennett DC. Isolation and Expression in Escherichia coli of hepB and hepC, Genes Coding for the Glycosaminoglycan-Degrading Enzymes Heparinase II and Heparinase III, Respectively, from Flavobacterium heparinum. Appl. Environ. Microbiol. 1996，62 :2723-2734)。研究发现，通过将麦芽糖结合蛋白(MBP)与酶的融合 可以显著提高酶重组表达的可溶性。本研究小组利用融合蛋白技术将MBP融合到肝素酶 I的氮端并低温诱导显著的提高了肝素酶I重组表达的可溶性。此项工作已经申请专利， 专利号为200410038098. 6。而且来自大肠杆菌的天然的MBP能够与麦芽糖特异吸附，参与 大肠杆菌对麦芽糖的转运和利用。MBP不但能与直链淀粉结合，实现亲和分离，也能与马 铃暮淀粉实现亲禾口分离(Usha Srinivasan et al. ，A convenient method for affinity purification of maltose binding protein fusions. Journal of Biotechnology 1998 Vol。62 163-167 ；廉德君等，一种改进的融合蛋白亲和层析纯化方法，生物化学与生物进 展1998 Vol. 25 :283_284)，从而可以大大降低酶的分离纯化成本，有利于实现工业化规模 的分离纯化。

发明内容
本发明的目的在于提供一种肝素酶II融合蛋白及其编码基因。本发明提供的融合蛋白(命名为MBP-H印B)，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2的第1-1118所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸且具有肝素酶II活性的由a)衍生的蛋白质。
该融合蛋白MBP-H印B中的MBP的氨基酸序列如SEQ ID No 2的自氨基酸第1-367 所示；该融合蛋白中的H印B的氨基酸序列如SEQ ID No 2的自氨基酸第372-1118所示。上述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。进一步，上述基因是如下1)或2)或3)1)编码序列是序列表中序列1 ；2)在高严谨条件下与序列表中序列1的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述蛋 白的核苷酸序列；3)与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有95%以上的同源性且编码权利要求 1所述蛋白的核苷酸序列。序列1中，MBP的编码区是序列1的自5，端第1-1101位的碱基；H印B的编码区是 序列1的自5’端第1114-3360位的碱基。所述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液， pH7. 2,7% SDS)中，65°C预杂交30min ；弃预杂交液，加入杂交液(0. 25mol/L磷酸钠缓 冲液，pH7.2,7% SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65°C杂交12hr ；弃杂交液，加入洗膜 液I (20mmol/L磷酸钠缓冲液，ρΗ7· 2,5% SDS)，65°C洗膜2次，每次30min ；加入洗膜液 II (20mmol/L 磷酸钠缓冲液，ρΗ7· 2,1% SDS)，65°C洗膜 30min。含有上述基因的重组载体或转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。进一步，上述重组载体是通过以下步骤构建的将序列表中序列1所示的DNA片段插入质粒pMAL-c2x的多克隆位点，得到重组表 达载体。含有上述基因的重组菌也属于本发明的保护范围之内。进一步，上述重组菌是含有上述的重组载体的重组大肠杆菌。上述重组大肠杆菌的宿主优选是TBl。本发明的另一目的在于提供一种生产肝素酶II的方法。本发明提供的方法，是将上述的重组菌诱导培养，表达得到肝素酶II。上述诱导培养条件是0. Ol-ImM的IPTG，10_42°C诱导培养15-28小时；优选是 0. 24mM的IPTG，15°C诱导培养24小时。上述诱导培养的培养基的溶剂是水，溶质是10g/L NaCl, 5g/L酵母提取物，10g/L 蛋白胨，(质量百分比)乙醇，0.6mg/L氯霉素和100 μ g/L氨苄青霉素。本发明构建了防止包涵体形成的融合表达载体，并通过amylose树脂实现一步 亲和分离。通过融合蛋白首次实现肝素酶II在大肠杆菌中90%以上有活性、正确折叠的 可溶蛋白形式存在；大肠杆菌TBI (pMAL-hepB)在37摄氏度培养2. 5小时后，加入0. 24mM IPTG，诱导温度15摄氏度，培养基中酵母粉浓度0. 5%，乙醇1%，生产的肝素酶II酶活可 达118. 4IU/L发酵液，表达量可达179mg/L发酵液，比酶活可达0. 66IU/mg。本发明还可通 过亲和分离实现了该融合蛋白的一步纯化。本发明通过改变IPTG浓度，加入IPTG时间，诱 导温度，培养基成分等优化提高了融合蛋白的产量和肝素酶活。本发明将在肝素酶II的生 产中发挥重要作用。


图1为表达载体pMAL-h印B的构建过程示意图。图2为从肝素黄杆菌中PCR扩增得到的肝素酶II基因电泳图谱。图3为转化子PCR验证电泳图谱。图4为转化子酶切验证电泳图谱。图5为融合质粒pMAL-h印B宿主优化结果(a)为0D600、粗酶液酶活以及蛋白浓 度比较；(b)为粗酶液比酶活比较。图6为大肠杆菌TBl/pMAL-h印B工程菌株表达MBP-HepB的SDS-PAGE图。图7为融合蛋白MBP-HEPB通过直链淀粉树脂亲和分离的SDS-PAGE电泳图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。所述引物合成及测序工作均由 Invitrogen生物技术有限公司完成；所有的限制性内切酶均购自New England Biolabs公 司；Pfu酶及dNTP购自TaKaRa公司；所有感受态细胞(如DH5 α、ΤΒ1和ToplO)购自北京 全式金生物技术有限公司；肝素酶II酶活测定底物肝素购自河北常山生化药业股份有限 公司，其它的化学药品均为一般分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。实施例1、肝素酶II融合蛋白MBP-H印B的表达一、去除信号肽的肝素黄杆菌肝素酶II编码序列的克隆
表达载体pMAL-hepB的构建过程如图1所示，具体过程如下1、引物的设计及合成经Genbank查询得至Ij月干素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)月干素醇II 白勺 DNA )ψ 歹Ij (Su, H. ， Blain, F. ， Musil, R. Α. ， Zimmermann, J. J. ， Gu, K. and Bennett, D. C. Isolation and expression in Escherichia coli of hepB and hepC, genes coding for the glycosaminoglycan-degrading enzymes heparinase II and heparinase III， respectively, from Flavobacterium heparinum. Appl. Environ. Microbiol. 1996,62, 2723-2734)，再根据去除编码信号肽碱基的肝素黄杆菌肝素酶II的DNA序列设计引物，并 在引物序列中引入限制性内切酶Sac I和Pst I的识别位点，所用的上下游引物分别为上游引物Pl :5，-ATATGAGCTCGCAAACCAAGGCCGATGTG-3‘(带下划线的碱基为 SacI 的酶切位点)，下游引物P2 5’ -CATACTGCAGTCATTATCTCAAAAAACGGTAGGTTCCTTC-3’ (带下划线的 碱基为PstI的酶切位点)，扩增后，即分别引入Sac I和Pst I酶切位点。2、PCR扩增去除信号肽的肝素黄杆菌肝素酶II的编码序列PCR扩增的反应体系为50ng肝素黄杆菌基因组DNA模版，IOOpmol每种引物，1 X 扩增缓冲液(北京天为生物技术有限公司)，200 μ mol/L每种dNTP，1单位高保真Pfu酶； 扩增程序为95摄氏度变性5分钟，50、52、54、56、58或60摄氏度引物退火1分钟，72摄氏 度延伸3分钟，30个循环后，72摄氏度延伸10分钟结束反应。该PCR结果如图2所示，表 明扩增得到了 2. 2kb的肝素酶II基因片段，测序表明产物的核苷酸序列如序列表中序列 1的第1114位-3360位所示(命名为H印B)。图2中，泳道1_6分别为退火温度为60、58、56、54、52或50摄氏度扩增结果，泳道M为分子量marker (条带大小依次为10kb、8kb、6kb、 5kb、4kb、3kb、2kb、l. 5kb、lkb、800bp、500bp、300bp)，箭头所指处为 2. 2kb 目标片段。3、构建含有目的片段的克隆载体参照试剂盒说明书进行操作，将步骤一中步骤2的PCR扩增的目的片段直接亚克 隆入载体pMD -19T Simple (TaKaRa公司)中，得到连接产物。4、转化大肠杆菌及阳性克隆转化子的筛选及测序将步骤3获得的连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，具体方法为将10 μ 1 的连接产物与100 μ 1的大肠杆菌DH5 α感受态细胞混勻，冰浴30分钟，42摄氏度热激90 秒，冰浴10分钟，然后加入800 μ 1含100 μ g/L氨苄青霉素的LB液体培养基(蛋白胨3g， 酵母提取物1. 5g, NaCl 3g，水285mL)中，180rpm、37摄氏度振摇60分钟，涂于含100 μ g/ L氨苄青霉素的LB抗性培养平板(蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，琼脂粉4.5g，水 285mL，16 μ 1 X-gal和4 μ 1 IPTG/平板)进行蓝白斑筛选。37摄氏度培养12-20小时。挑 选白斑并以此为模版，用引物Pl和P2进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系及反应条件与步骤 2相同。反应结束后，对扩增产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，可含转化子的阳性克隆。 将筛选得到的阳性克隆转至5mL含0. 05mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37摄氏度、 220rpm振摇12小时，将菌液交由irwitrogen生物技术有限公司进行测序，将含有具有序列 表中序列1的第1114-3360位核苷酸序列的肝素酶II蛋白编码基因的pMD _19T Simple 重组载体命名为pMD-19-h印B。二、重组大肠杆菌表达载体的构建以pMD-19-h印B质粒为模版，用引物Pl和P2进行PCR扩增肝素黄杆菌肝素酶II 的基因，PCR反应体系及反应条件与步骤一中2相同。将pMAL-c2x载体(购自美国New England Biolabs公司)和PCR产物(以pMD_19_h印B质粒为模版的扩增产物)分别用 Sac I和Pst I双酶切，用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)连接，转化DH5 α，以Pl和Ρ2为 引物，通过菌落PCR筛选转化子(如图3所示)，提取可得到2.2kb PCR产物的转化子中的 pMAL-c2x重组载体，分别通过Sac I和Pst I双酶切验证(如图4所示)。图3中M为分 子量 marker (条带大小依次为 IOkb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1. 5kb、Ikb、800bp、500bp、 300bp)，泳道1、2为PCR验证的转化子，箭头所指处为肝素酶II基因条带。图4中M为分 子量 marker (条带大小依次为 IOkb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1. 5kb、Ikb、800bp、500bp、 300bp)，泳道1、2为重组质粒pMAL-h印B双酶切后电泳图，箭头所指处为肝素酶II基因条 带，泳道3、4为正确连接的重组质粒pMAL-h印B，泳道5、6为原始质粒pMAL-c2x。将通过 Sac I和Pst I双酶切得到的2. 2kb片段的质粒进行测序，将含有具有序列表中序列1的 第1114-3360位核苷酸序列的肝素酶II融合蛋白编码基因的pMAL_C2x重组载体命名为 pMAL-h印B。在pMAL-h印B中，h印B基因与IacZa基因之间有两个连续的终止密码TAATGA， 从而能够有效地终止蛋白翻译不会表达IacZa蛋白。三、肝素酶II融合蛋白MBP-H印B的表达提取步骤二中含有pMAL-hepB的大肠杆菌DH5 α中的质粒，按照常规方法转化 大肠杆菌 TBI、ToplO、JM109、BL21(DE3)、BL21(DE3) (plysS)。除 Ε. coli TBI 感受态细 胞制作按照《分子克隆实验指南》中氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的说明完成外， E. coliT0P10、E. coli DH5a、E.coli JM109、E. coli BL21 (DE3)、Ε· coli BL21(DE3) (plysS)感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。经过氨苄青霉素筛选和利用步骤一中 步骤1提供的引物进行菌落PCR鉴定，得到含有pMAL-h印B的大肠杆菌TBl、ToplO、JM109、 BL21 (DE3)和 BL21 (DE3) (plysS)，即 TBl/pMAL-h印B、ToplO/pMAL_h印B、JM109/pMAL_h印B、 BL21 (DE3) /pMAL-hepB, BL21 (DE3) (plysS) /pMAL-hepB 禾Π DH5 α /pMAL-hepB 作为表达 MBP-HepB的工程菌。以质粒 pMAL-c2x 转化大肠杆菌 TBl、ToplO、JM109、BL21 (DE3)、BL21 (DE3) (plysS) 和 DH5 α，得到空载体对照 TBl/pMAL-c2x、ToplO/pMAL-c2x、、JM109/pMAL-c2x、BL21 (DE3) / pMAL-c2x、BL21 (DE3) (plysS)/pMAL_c2x 和 DH5 α /pMAL_c2x。以下操作对上面的工程菌平行进行。将空载体对照和工程菌分别在含氨苄青霉素抗性的LB培养基(NaCl 10g/L，酵母 提取物为5g/L，蛋白胨10g/L，l% (质量百分比)乙醇，0.6mg/L氯霉素，含100yg/L氨苄 青霉素)37摄氏度培养2. 5小时后，加入终浓度为0.24mM IPTG 15摄氏度诱导24小时。 10000rpm，8分钟离心收集菌体并用20mmol/L Tris-HCl (pH 7. 5)洗涤两次，重悬至OD6tltl约 为8. 000附近。将上面OD6tltl约为8. 000重悬液进行超声破碎(输出功率为300W，每次超 声3秒和间歇3秒的处理198次)，12000rpm, 30分钟离心，超声破碎后离心所得的上清液 即为粗酶液。酶活力(单位为IU/L)的检测采用232nm的光吸收法，IIU的酶活定义为30 摄氏度每分钟产生1 μ mol不饱和键的反应效力。取肝素底物溶液0. 5ml (25g/L肝素，40mM NaCl，3. 5mM CaCl2,17mM Tris-HCl, pH 7. 5)，加入上步中所得的粗酶液，其他体积以Tris 缓冲液补充，最终的反应体积为1. 5ml，测单位时间内在232nm的吸光度变化ΔΑ232。消光 系数ε = 3800ΜΛ比酶活(单位为IU/mg蛋白)的定义为酶活力与粗酶液蛋白浓度(单 位为mg/L)的比值。蛋白浓度监测采用常规的Bradford法。结果表明空载体对照菌株TBl/pMAL-c2x、ToplO/pMAL_c2x、JM109/pMAL_c2x、 BL21 (DE3)/pMAL-c2x、BL21 (DE3) (plysS)/pMAL-c2x 和 DH5 α /pMAL-c2x 诱导培养后无酶 活，其他工程菌均表达出了可溶性的MBP-H印B融合蛋白，其中在大肠杆菌TBI中的表达 效果最佳，结果如图5所示无论从菌的OD值、酶活或者比酶活来看，TBl均要优于其它 宿主(TBI为宿主时OD值、酶活和比酶活分别为3.87、118.24IU/I^P0.66IU/mg)。并且 经过测序，TBl/pMAL-h印B、ToplO/pMAL-h印B、JM109/pMAL_h印B、BL21 (DE3)/pMAL-h印B、 BL21 (DE3) (plysS) /pMAL-hepB和DH5 α /pMAL-hepB表达出的蛋白的氨基酸序列均如序列 表SEQ ID No 2所示；并且该融合蛋白MBP-H印B的MBP的氨基酸序列如SEQ ID No 2的 自氨基酸第1-367所示；该融合蛋白MBP-IfepB的H印B的氨基酸序列如SEQ ID No 2的自 氨基酸第372-1118所示。对最佳宿主TBl表达的蛋白进行SDS-PAGE电泳取上步超声破碎后离心所得的 上清液(粗酶液)40 μ 1做可溶蛋白组分SDS-PAGE电泳，取上述超声破碎后离心所得的沉 淀来做不可溶蛋白组分SDS-PAGE电泳。结果如图6所示，图中M为marker(由上至下分 子量依次均为 230kDa、150kDa、100kDa、80kDa(红色)、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa、 20kDa、15kDa、IOkDa)，1、2分别为空载体对照TBl/pMAL_c2x的不可溶蛋白组分和可溶蛋白 组分；3、4分别为大肠杆菌TBl/pMAL-h印B的不可溶蛋白组分和可溶蛋白组分，箭头所指处 为融合蛋白MBP-H印B(123KDa)。实施例2、通过直链淀粉柱纯化肝素酶II融合蛋白MBP-IfepB
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本发明利用的融合伙伴(fusion partner)麦芽糖结合蛋白MBP能够与直链淀粉 亲和吸附实现一步分离。具体的亲和分离步骤如下将终浓度为0. 24mM IPTG诱导表达24 小时的菌体lOOmL，IOOOOrpm离心5分钟；同时设未诱导表达的菌体对照。接着按以下两个 方案分别操作方案一用柱平衡液Column buffer (20mM Tris-HCl, 200mM NaCl，pH7. 5)洗涤两 次，重悬在5mL Column buffer中，进行超声破碎(输出功率为300W，每次超声3秒和间歇 3秒的处理198次)。方案二 渗透压冲击。将菌体重悬在IOOmL osmotic shock buffer I中(20-40% 蔗糖，30mM Tris-HCl,lmM EDTA) 15分钟，搅拌。IOOOOrpm离心10分钟，然后重悬在等体积 0. 5mM硫酸镁中，冰浴10-15分钟，IOOOOrpm,离心10分钟。离心后上清液以0. 5ml/min通过2ml预平衡的直链淀粉亲和分离柱，通过 IOmMO. 5ml/min麦芽糖洗脱并收集。每一步取40 μ 1做SDS-PAGE，目标蛋白经过直链淀粉(amylose)树脂吸附后，用 IOmM麦芽糖在1个柱体积下能够将目标蛋白洗脱。结果如图7所示，表明经过直链淀粉 树脂一步纯化后目标蛋白可占95%以上。图7中，MSmarkeH由上至下分子量依次均为 230kDa、150kDa、100kDa、80kDa(红色)、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa、20kDa、15kDa、 10kDa)，l为0. 24mM IPTG诱导的大肠杆菌TBI (pMAL-h印B)的可溶蛋白组分，2，3，4，5，6分 别为0.24mM IPTG诱导的大肠杆菌TBl(pMAL-h印B)经过直链淀粉树脂吸附后用麦芽糖洗 脱收集的不同浓度的蛋白组分，箭头所指为目标蛋白。
权利要求
一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2的第1 1118所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有肝素酶II活性的由a)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)1)编码序列是序列表中序列1；2)在高严谨条件下与序列表中序列1的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述蛋白的 核苷酸序列；3)与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有95%以上的同源性且编码权利要求1所 述蛋白的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体或转基因细胞系。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是通过以下步骤构建的将序列表中序列1所示的DNA片段插入质粒pMAL-c2x的多克隆位点，得到重组表达载体。
6.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是含有权利要求4或5所 述的重组载体的重组大肠杆菌。
8.—种生产肝素酶的方法，是将权利要求6或7所述的重组菌诱导培养，表达得到肝素酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述诱导培养条件是0.Ol-ImM的IPTG， 10-42°C诱导培养15-28小时；优选诱导培养条件是0. 24mM的IPTG，15°C诱导培养24小 时。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述诱导培养的培养基的溶剂是水，溶 质是10g/L NaCl，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，(质量百分比)乙醇，0.6mg/L氯霉素和100 μ g/L氨苄青霉素。
全文摘要
本发明公开了一种肝素酶II融合蛋白及其编码基因与表达方法。本发明提供的融合蛋白(命名为MBP-HepB)，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2的第1-1118所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白质。上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。将上述基因导入重组大肠杆菌中表达的蛋白肝素酶酶活可达118.4IU/L发酵液，表达量可达179mg/L发酵液，比酶活可达0.66IU/mg。本发明还可通过亲和分离实现了该融合蛋白的一步纯化。
文档编号C12N9/42GK101942024SQ20101025990
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者冯权, 叶逢春, 张翀, 李晔, 蒋培霞, 邢新会 申请人:清华大学;北京思清源生物科技有限公司