一种易固定化肝素酶i编码基因及其蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种易固定化肝素酶I蛋白及其编码基因。该蛋白可被几丁质高效率固定化；本发明提供的易固定化肝素酶I蛋白，其氨基酸序列如SEQ?IDNO:2.所示,本发明的蛋白的编码基因也在保护范围之内。本发明通过重叠延伸PCR技术设计肝素酶I基因和几丁质结合域融合表达可固定化的肝素酶I。
【专利说明】—种易固定化肝素酶I编码基因及其蛋白
【技术领域】
[0001]本发明涉及酶的基因工程改造，特别涉及到易固定化肝素酶I编码基因及其蛋白。
【背景技术】
[0002]肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又发现在一些微生物和动物组织中也有肝素酶存在。肝素酶具有清除血液中残存肝素、防止凝血等功能，同时对生产低分子肝素、研究肝素的结构有重要的作用。然而游离的肝素酶容易失活，尤其是肝素酶I溶液在保存96h后活性只有原来的23%，此外，游离的肝素酶在发生反应时需要将其加入底物中，反应以后酶溶液、底物和产物混合在一起不容易分离，导致肝素酶无法重复使用，酶的利用效率低下，这为肝素酶的应用带来很多不便，因此，需要寻找一种既能提高肝素酶的利用效率，又能延长酶的保存时间的方法。
[0003]与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控等一系列优点，因此，对肝素酶I的固定化是一种提高使用效果的理想选择。目前对肝素酶 I 进行固定化的研究较少，Howard Bernstein 等[Bernstein, H., (1987), App1.B1chem.B1tech.16, 129-143]以 CNBr-activated Sepharose 4B 为固定化材料，对肝素酶I进行了共价交联法的固定化，实现了肝素酶的固定，但是该方法的固定化效率低，我们采用相同的材料和方法得到的结果只能达到每毫升材料固定IIU的肝素酶I，而且以CNBr-activated Sepharose 4B为固定化材料成本较高。
[0004]经过长期研究，本发明的发明人首次通过在肝素酶I的基因C端加上几丁质结合域后转入工程菌中表达的方法，得到一种新型的易于固定化的肝素酶I，为实现高效且低成本的肝素酶I的固定化成为可能。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了提供一种易固定化肝素酶I基因以及表达蛋白。
[0006]本发明所提供的肝素酶I蛋白，名称为H印A-1-chBD，其肝素酶H印A_l_chBD是具有序列表中SEQ IDNo:2氨基酸残基序列的蛋白质。
[0007]序列表中的SEQ ID No:2由个801个氨基酸残基组成。
[0008]固定化肝素酶I蛋白编码基因，名称为IfepA-1，其具有下列核苷酸序列之一:
1)序列表中SEQID N0.1的DNA序列:
2)编码序列表中SEQID N0.2蛋白质序列的多核苷酸；
序列I中的DNA序列由个2043个碱基组成，该基因的开放阅读框架为自5’端第I到第2043位碱基。
[0009]扩增该蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
[0010]本发明的第二个目的是提供一种表达固定化肝素酶I蛋白的方法。
[0011]本发明所提供的表达易固定化肝素酶I蛋白的方法，是将含有上述肝素酶I蛋白编码基因的重组表达载体导入表达宿主菌，表达肝素酶I蛋白，且其带有MBP标签。
[0012]其中，所述易固定化肝素酶I编码基因全序列是以构建好的PMAL-C2X-HepA为模板，以 5 GACTGGATCCcaggccgacagtgctaag 3 和 5 GGTCAGGCCAAGTTTtctggcagtttcgctgt 3按照常规PCR方法得到，紧接着几丁质结合区域以人工合成的几丁质结合域为模板，以 5 CAGCGAAACTGCCAGAAAACTTGGCCTGACCGGT 和 5 GACTAAGCTTCTATTGAAGCTGCCACAAGGC3，按照常规PCR方法得到后，以上述两个PCR产物混合物为模板，以GACTGGATCCcaggccgacagtgctaag 和 GACTAAGCTTCTATTGAAGCTGCCACAAGGC 3 为引物进行 PCR后得到。所述宿主菌可为大肠杆菌，所述大肠杆菌可为以下菌株:BL21。
[0013]易固定化肝素酶I蛋白的诱导表达条件可为0.1mM IPTG.16摄氏度诱导20小时:所采用的培养基为LB培养基，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为H印A-1的PCR电泳图谱。
[0015]图2为阳性转化子的双酶切鉴定示意图。
[0016]图3为!fepA-1-chBD蛋白通过直链淀粉树脂亲和分离的SDS-PAGE电泳图谱。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明。
[0018]实施例1、缺失肝素酶I蛋白H印A-1的表达。
[0019]1、表达载体 pMal- HepA-1-chBD 的构建。
[0020]模板PMal- H印A的构建参考专利，专利号为CN 1312183C。
[0021] 表达载体pMal- HepA-1-chBD的构建具体过程如下:以已经构建好的PMAL- HepA和几丁质结合域质粒PMD19T为模板，所用的上下游引物分别为GACTGGATCCcaggccgacagtgctaag (带下划线的喊基为 BamHI 的酶切位点)，和 GGTCAGGCCAAGTTTtctggcagtttcgctgt 3 以及，以 5 CAGCGAAACTGCCAGAAAACTTGGCCTGACCGGT 和5 GACTAAGCTTCTATTGAAGCTGCCACAAGGC 3，分别引入 BamHI 和 HindIII 酶切位点，紧接着再以回收纯化后的PMAL- H印A-1和几丁质结合域质粒PMD19T-chBD PCR产物为模板以GACTGGATCCcaggccgacagtgctaag 和 GACTAAGCTTCTATTGAAGCTGCCACAAGGC 3 为引物扩增该编码基因得到H印A-1-chBD;扩增的反应体系为:50ng模板DNA，200nmol每种引物，5XPSbuffer扩增缓冲液，2.5uMol/L每种dNTP，I单位高保Pfu酶；扩增程序为:95摄氏度变性5分钟，50-60摄氏度引物退火15秒，72摄氏度引物延伸120秒，30个循环后，72摄氏度延伸5分钟结束反应。该PCR.结果如图1所示，表明扩增得到1.1kb的固定化肝素酶I基因片段。图1中，I为几丁质结合域PCR回收纯化产物，大小为174bp ;2为肝素酶I基因，大小为1047bp ；3-7分别为引物退火温度为51、53、55、57、59、61°C扩增固定化肝素酶基因，8为分子量marker DLl, 000,目标片断处为1.lkb。
[0022]将H印A-1-chBD和pMal_c2x载体分别用BamHI和HindIII双酶切，用T4DNA连接酶连接，转化BL21，提质粒通过BamHI和HindIII双酶切验证。验证结果如图2示，同时将结果送去测序，其中序列完全正确的一株命名为重组大肠杆菌BL21 (pMal- HepA-1-chBD) 0
[0023]2、易固定化变肝素酶I蛋白H印A-1-chBD的表达。
[0024]重组大肠杆菌BL21 (pMal- H印A-1-chBD)在 LB 培养基(含 100ng/ml Amp) 37°C培养3小时，待0D600=0.7-0.8时加入0.7mM IPTG在15°C进行诱导培养。诱导20小时后菌液在8000rpm下离心1min,弃滤液后重悬在40ml 2OmmoI Tris.HCl中超声破碎(超声功率为150W，超声5s，间歇时间5s，超声200个循环)，18000rpm.30min离心。
[0025]实施例2、通过直链淀粉柱纯化肝素酶I蛋白H印A-1-chBD及肝素酶H印A-1-chBD活性测定。
[0026]1.肝素酶I蛋白！fepA-1-chBD纯化。
[0027]本发明中利用的融合伙伴(fus1n partner)麦芽糖结合蛋白MBP能够与直链淀粉亲和吸附实现一步分离。具体的亲和分离步骤如下:将0.7mmol IPTG诱导表达20小时的菌体诱导后菌液在8000rpm下离心1min,弃滤液后重悬在40ml 2OmmoI Tris.HCl中超声破碎(超声功率为150W，超声5s，间歇时间5s，超声200个循环)，18000rpm.30min离心。离心后上清液体以0.5ml/min通过20ml预平衡的直链淀粉亲和分离柱，通过1mM 0.5ml/min麦芽糖梯度洗脱并收集。
[0028]用1mM麦芽糖在10个柱体积下能够将目标蛋白洗脱。结果如图3所示，表明经过直链淀粉树脂一步纯化后目标蛋白可占95%以上。图3为1mM麦芽糖浓度洗脱纯化后SDS-PAGE电泳图，M为分子量marker，I, 2，3为可溶目标蛋白H印A-1-chBD，分子量为80KD。
[0029]2.肝素酶H印A-1-chBD活性测定。
[0030]肝素酶活性测定:在5 ml石英比色皿中加入在35 1:预热过的2.5 ml肝素浓度为I mg/ml 的 Tris-HCl (50 mM,含 CaC12 10 mM, pH7.0)缓冲液，移取 20 μL 酶液，摇匀后在232 nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。以双键的摩尔消光系数3500计算其形成量，换算为酶液中酶的国际单位。蛋白浓度测定采用Bradford法。
【权利要求】
1.一种易固定化肝素酶I蛋白，是由序列表中序列SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因的核苷酸序列式序列表中SEQID NO:1所述的核苷酸序列。
4.含有权利要求2所述基因的工程菌。
【文档编号】C12N15/60GK104073480SQ201410316391
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】杜宏银, 马小来, 李锂 申请人:深圳市海普瑞药业股份有限公司