利用大肠杆菌产y-谷氨酰甲胺合成酶高效生产l-茶氨酸的方法
【专利摘要】本发明是一种基因工程菌，含重组质粒pET28a-GMAS,质粒大小6585bp，GMAS片段大小1308bp,命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli，具有卡纳青霉素抗性，异丙基硫代-e-D-半乳糖苷诱导表达y-谷酰胺甲胺合成酶基因，是一种具有茶氨酸生物合成能力的基因工程菌。本发明以谷氨酸和乙胺为底物，操作方法简单，便于生产控制，茶氨酸转化生产效率高，具有良好的工业化应用前景。
【专利说明】利用大肠杆菌产Y-谷氨酰甲胺合成酶高效生产L-茶氨酸 的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种利用大肠杆菌基因工程菌生产的 Y -谷氨酰甲胺合成酶来催化合成L-茶氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] 茶氨酸（N-乙基-Y -谷氨酰胺）是茶叶特有的一种氨基酸，也是茶叶的呈味物质 之一，其含量直接决定着茶叶的品质。同时，茶氨酸具有放松神经、抗抑郁、抗肿瘤、降血压、 提高免疫力等医药作用，也可以应用与食品领域、如作为功能食品的添加剂等。因此越来越 受到人们的重视，国内外市场需求量不断增大。
[0003] 目前，茶氨酸的生产方法，主要有三种。一种是从茶叶中提取。茶叶中茶氨酸含量 低，而且原料来源受限，茶氨酸产量很低，最终导致生产成本过高。第二种方法，便是化学合 成的方法。该方法会导致毒性物质残留，而且生成物中会形成D、L-型茶氨酸异构体，拆分 精制工艺复杂。第三种是利用微生物酶法生产L-茶氨酸。目前，专利和文献所报道的生 产茶氨酸的酶主要是谷氨酰胺酶（CN1688705A，2005; JP2007185132A)、γ -谷氨酰转肽酶 (CN101343618A, 2008;茶叶科学，2007, 27 (1)，61-66 ;食品工业科技，2008, 29(2)166-169) 或者谷氨酰胺合成酶等，反应底物为谷氨酰胺和乙胺，与化学合成法相比，不会产生消旋现 象，转化率高，反应条件温和。已受到了广泛研究，并已进入工业化应用领域。然而未见利 用基因工程来源的Y-谷氨酰甲胺合成酶为催化剂，以更低成本的谷氨酸和乙胺为底物， 高效酶法制备茶氨酸的文献报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种高效转化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸的大肠杆菌菌种， 以及该菌种在制备L-茶氨酸中的应用。
[0005] 本发明的技术方案如下： 总体技术方案是自然环境土壤细菌基因组DNA的提取，γ -谷氨酰甲胺合成酶基因的 克隆，采用合适的表达载体和限制性内切酶，构建重组表达载体，将Y -谷氨酰甲胺合成酶 基因克隆到合适的宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌。
[0006] 1.自然环境土壤细菌基因组DNA的提取：在多处茶树根际取样，按照本领域一般 技术人员熟悉的步骤、试剂盒方法提取土壤环境微生物DNA。
[0007] 2. Y-谷氨酰甲胺合成酶基因的克隆：根据Y-谷氨酰甲胺合成酶基因的保守序 列，设计引物，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂配制方法，通过PCR扩增Y-谷氨 酰甲胺合成酶基因。
[0008] 3.表达载体的构建、转化和转化子筛选：按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、 试剂、完全可与从商业途径获得的载体、限制性内切酶和方法，将目标基因克隆到载体，转 化宿主细胞，筛选转化子。
[0009] 4.重组菌的摇瓶发酵：按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、方法，进行摇 瓶发酵，利用SDS-PAGE分析蛋白表达情况。
[0010] 5.茶氨酸酶法转化合成工艺：根据酶本身的活性特征，按照本领域一般技术人员 熟悉的步骤、试剂、方法，进行酶法转化合成实验，参考文献报道，利用液相检测茶氨酸的合 成情况。
[0011] 发明效果 本发明的有益效果体现在，通过构建高效表达Y-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌工程 菌，在有效获得高产量重组酶的同时，能有效利用谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸，且转化率 在70%左右，为今后充分利用低成本的谷氨酸工业化成产L-茶氨酸提供了有效的生产菌 株。
[0012]
【专利附图】
【附图说明】 图1重组质粒（ρΕΤ-GMAS)图谱 图2 SDS-PAGE凝胶电泳图谱 附序列Y-谷氨酰甲胺合成酶基因核苷酸序列。
【具体实施方式】
[0013] 1材料与方法 1. 1菌株与质粒 大肠杆菌CfecAericAia co/i)DH5a、BL21 (DE3)菌株及质粒载体 pMD18_T simple vector, pET28a均为本实验室保藏。
[0014] L 2试剂和材料 实验试剂：DNA 聚合酶（Taq DNA Polymerase，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase)，限 制性内切酶（AfcoI 和及丽7 I)，T4 DNA Ligase, dNTP，DNA marker DL10, 000, Premixed Protein Marker (Low )均购自 Takara公司；Power Soil DNA Isolation Kit 购自 MOBIO Laboratories公司，质粒小量提取试剂盒、DNA纯化试剂盒购自北京鼎国生物技术有限公 司；硫酸卡纳霉素、氨节青霉素、IPTG购自Genview公司；其余化学试剂均为分析纯。
[0015] 1.3实验方法 细菌基因组提取、质粒提取以及DNA纯化回收等均按照试剂盒使用说明，大肠杆菌感 受态的制备、酶切、酶连、载体的转化，琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE等常规分子生物学操作 参考《分子克隆实验指南》第三版（科学出版社，2002)。
[0016] 1. 3. 1环境微生物基因组DNA的提取 收集茶园茶树根际土壤，按照试剂盒Power Soil DNA Isolation Kit使用说明，提取 根际土壤微生物基因组DNA。
[0017] 1. 3. 2目标基因Y-谷氨酰甲胺合成酶编码序列的扩增 根据Genbank登录的办sp. MCl (登录号NC_015717.1)编码序列设计 一对引物（上海英骏生物技术有限公司合成），引物序列及其酶切位点如下： PF :5' -CATG^rggCTCAGGATCTTGCCCAGCTC-3' (下划线为 Afco I 酶切位点） PR: 5' -CGCGGAr6TTTAGCAGTCCAGCGTATGTGC-3' (下划线为及丽7 I 酶切位点）。
[0018] 1. 3. 3反应体系及条件： PCR反应体系（50 μ?) : 5XPCRbuffer 10 μ?，dNTP 4 μ?，引物PF 和 PR(10 μΜ) 各 1 μ 1，模板 〇· 5 μ 1，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase 0· 5 μ 1，水至 50 μ 1。
[0019] PCR 反应条件（Touch down PCR) :95°C 5min ;98°C 10 sec，60-51 °C 10 sec，72 °C延伸 I. 5 min，10 个循环；98 °C 10 sec，55 °C 10 sec，72 °C延伸 I. 5 min，20 个循环； 72°C 10 min反应终止。0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测及纯化PCR产物。
[0020] PCR产物加A反应体系（20 μ 1):取14. 5 μ I PCR产物，加入2μ I IOXTaq Buffer，3yl dNTP，2 U Taq DNA Polymerase，72 °C反应 20?30 min 后直接纯化回收。
[0021] 1. 3. 4目标基因克隆载体的构建与鉴定 按照PMD18-T simple vector试剂盒操作说明，连接目标基因与T载体，转化万. DH5ci，利用蓝白斑筛选阳性转化子，并选择部分转化子送至生工生物工程(上海）股份有限 公司测序。
[0022] 1. 3. 5目标基因克隆及鉴定 在相关克隆子的测序结果中，选择携带兴趣基因的转化子，37 °C过夜摇瓶培养，提取 重组质粒，利用AfcoI和及_7 I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目标基因。
[0023] 同时利用AfcoI和及?" I双酶切pET28a载体，并琼脂糖凝胶回收载体产物。
[0024] 然后，利用T4连接酶16 °C过夜酶连pET28a载体和目标基因，产物转化凡 DH5 a (CaCl2法），选择部分转化子经生工生物工程(上海）股份有限公司测序。
[0025] 选择测序结果正确的转化子，提取重组质粒（pET-GMAS)转化凡co/i BL21(CaCl2 法）。
[0026] 1.3.6重组蛋白的表达 挑取重组菌凡co/i BL21接种于含有硫酸卡纳霉素的LB培养基中，37 °C振荡过夜 培养。将培养物接种于新鲜的含有硫酸卡纳霉素的LB培养基中，接种量2%，500 mL摇瓶 37^振荡培养至00_=0.6?0.8。301：1?了6诱导（终浓度0.31111)，311后离心收集细胞 ；20 mMTris-Cl (pH8. 0)重悬细胞，超声破碎，离心分别收集上清和沉淀。SDS-PAGE分析上清和 沉淀。带有空载的凡co/i BL21作为阴性对照。
[0027] L 3. 7酶法转化生产茶氨酸 如1. 3. 6,发酵完毕，5000r/min，离心IOmin收集菌体。IOOmL发酵液菌体浓缩至10mL， 溶解于20mM的Tris-Cl缓冲液（pH8. 0)，超声破碎10min。茶氨酸合成反应体系参考文 献（Biosci. Biotechnol. Biochem.，71(2)，545 - 552，2007)，含有 50mM 谷氨酸，150mM 乙胺盐酸盐，7. 5mMATP、30mM MgCl2，100mM咪唑缓冲液（pH7. 75)，适量的细胞破碎后酶液， 30°C温育。茶氨酸的检测方法参考文献（Process Biochemistry, 45 ,1330 - 1333,2010)。
[0028] 2实验结果 2.1以环境微生物基因组DNA为模板的Y-谷氨酰甲胺合成酶基因的PCR扩增 以PF和PR为引物，以土壤环境基因组DNA为模板，PCR扩增到约1300 bp左右的DNA 片段。
[0029] 2.2目标基因克隆文库的构建 将PCR产物与pMD18-T simple载体酶连，转化万.co/i DH5a，并利用蓝白斑筛选阳 性克隆，收获了大约500个左右的转化子。
[0030] 2. 3目标基因的克隆及表达载体的构建 选择经过测序的兴趣基因转化子，提取克隆载体，并双酶切收获目标基因，酶连双酶消 化的pET28a载体，转化万.co/i DH5a。选择阳性克隆子，提取重组质粒，并进行PCR及双 酶切验证，结果表明酶连成功，重组载体图谱如图1。
[0031] 2.4重组蛋白的表达 重组大肠杆菌BL21 (pET-GMAS)，在IPTG诱导后，表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析， 在大约44. 3kDa左右出现清晰的蛋白条带（图2)，即为γ -谷氨酰甲胺合成酶；诱导后，菌 体经超声破碎后取样上清SDS-PAGE电泳，可见该蛋白在上清中存在，具有良好的可溶性。
[0032] 2. 5酶法转化生产茶氨酸 按照1. 3. 7所述转酶化方法，离心收集菌体，细胞破碎，进行转化实验。经8小时连续 转化，12000rpm离心。按照1. 3. 7所述进行液相检测，谷氨酸转化率为69. 8%，表明重组酶 具有良好的酶转化活性。
【权利要求】
1. 一种生产Y-谷氨酰甲胺合成酶的菌株，该菌株为大肠杆菌基因工程菌，其特征在 于该菌株为用重组基因工程质粒PET28-GMAS转化大肠杆菌得来。
2. 如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，其宿主菌选自大肠杆菌BL21、 DH5a。
3. 如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，重组基因工程质粒PET28-GMAS含 有如说明书中野生Y-谷氨酰甲胺合成酶基因核苷酸序列。
4. 如权利要求1-3所述的任一权利要求所述基因工程菌主要用于生产L-茶氨酸。
【文档编号】C12N1/21GK104212757SQ201410316269
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】马承国, 程占冰, 王开成 申请人:上海凯圣生物科技有限公司