专利名称：检测甲型h1n1流感病毒抗药性突变的引物和探针及方法
技术领域：
本发明涉及一组检测甲型Hmi流感病毒抗药性突变的特异性扩增引物和荧光探 针及其应用，以及检测甲型Hmi流感病毒抗药性突变的方法。
背景技术：
流感(流行性感冒)是由流感病毒引起的一种人、禽、畜共患的急性传染病，其发 病率、死亡率和造成的经济损失位居各传染病之首。奥司他韦(商品名达菲)被广泛用来 作为流感的预防和治疗，但流感病毒由于神经氨酸酶274位的组氨酸突变为酪氨酸而出现 了显著的奥司他韦耐药性。目前建立了多种利用分子生物学方法检测具有奥司他韦耐药性 基因型流感病毒的方法，如单核苷酸多态性分析、滚环扩增技术以及Sanger测序等，但这 些方法不仅费时、费力、比较昂贵，而且还会由于实验室、工作人员、操作方法和标本的不同 而影响其敏感性和特异性。
发明内容
本发明目的是提供一组检测甲型Hmi流感病毒抗药性突变的特异性扩增引物和 荧光探针及其应用，以及检测甲型Hmi流感病毒抗药性突变的方法。本发明采用的技术方案是一种检测甲型Hmi流感病毒抗药性突变的特异性扩增引物和荧光探针，所述特 异性扩增引物序列如下PN1H274Y-F :5，-AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’PN1H274Y-R :5，-AAGACACCCACGGTCGATTC-3，该引物与甲型流感病毒神经氨酸酶274位点编码序列两端互补，其扩增片段的长 度为168bp ；所述荧光探针序列如下PN1H274-Pbl :5’ -HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3，PN1H274Y-Pb2 5，-FAM-AATGCCCCTAATTATTACTA-MGBNFQ-3探针的5’端标记荧光基团HEX或FAM，3’端标记MGB，NFQ为荧光淬灭基团，突变 位点位于探针的中部。基因扩增产物以临床呼吸道分泌物总RNA为模板，通过实时逆转录 PCR进行扩增。所述的特异性扩增引物和荧光探针可用于制备检测甲型Hmi流感病毒抗药性突 变的荧光PCR检测试剂盒。所述试剂盒主要包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、脱氧 三磷酸核苷混合物、特异性扩增弓I物和荧光探针。所述试剂盒中还包括R0X 均一化参比染料。本发明还涉及一种检测检测甲型Hmi流感病毒抗药性突变的方法，所述方法包 括(1)提取样品 RNA;
(2)荧光PCR扩增检测取PCR缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、脱氧三磷酸核苷混 合物、ROX均一化参比染料、特异性扩增引物和荧光探针配成反应液，加入样品RNA为模板 进行扩增反应，反应条件为42°C逆转录30min ；95°C预变性2min ；95°C,5s变性，55°C复性 与延伸40s，收集FAM和HEX荧光，共40个循环；所述特异性扩增引物序列如下PN1H274Y-F :5，-AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’PN1H274Y-R :5，-AAGACACCCACGGTCGATTC-3，所述荧光探针序列如下PN1H274-Pbl :5’ -HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3，PN1H274Y-Pb2 5， -FAM-AATGCCCCTAATTATTACTA-MGBNFQ-3，；(3)结果分析如果仅有HEX荧光积累而没有FAM荧光积累，则表示样品中存在 H274基因型的甲型Hmi流感病毒，且未发生H274Y突变，为对奥司他韦敏感的病毒；如果 有FAM荧光积累，则表示样品中存在甲型Hmi流感病毒，且已发生H274Y突变，为对奥司他 韦不敏感的病毒；如果没有荧光出现，则表示样品中不存在甲型Hmi流感病毒。所述步骤(2)中PCR反应液(以TaKaRa —步法荧光定量RT-PCR试剂盒为例)每 25 μ L组成如下2X One Step RT-PCR Buffer引物 PN1H274Y-F引物 PN1H274Y-R探针PN1H274-Pbl探针PN1H274Y-Pb2R0X 均一化参比染料TaKaRa Ex Taq HSPrimeScript RT Enzyme Mix样品RNADEPC 水补足至 25 μ L。本发明的有益效果主要体现在采用本发明方法，操作方法简单，结果直观明了 ； 引物和探针敏感性强，特异性好；在流感检测与监测中可快速的对是否是抗药株作出鉴定， 大大减少了人力、物力的耗费。
图1为双重实时荧光逆转录PCR方法的特异性检测结果；曲线A代表274Υ，曲线B 代表274Η，曲线C代表274Η和274Υ的混合液。图2为双重实时荧光逆转录PCR方法的敏感性检测结果；用10倍倍比稀释的Hmi 病毒RNA作为模板。A =WHO设计的实时方法检测A型流感；B 内部设计的2009流行性Hmi 检测方法；C :WH0设计的2009流行性Hmi检测方法；D 本发明双重实时荧光逆转录PCR方 法检测2009流行性Hmi中H274Y的突变。图3为H274Y检测的模型图；1_丨274H阳性样本(HEX荧光)；▲ :274H和274Y双
12. 5μ L 0. 4μΜ 0. 4μΜ 0. 2μΜ 0. 2μΜ 0. 5μ L 0. 5μ L 0. 5μ L 5 μ L
5阳性的样本(FAM和HEX荧光)阴性对照。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 引物和探针的设计比对GenBank登录的流感NA基因序列并据此设计引物和探针。其中引物序列为PN1H274Y-F :5，-AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’ ；PN1H274Y-R 5’ -AAGACACCCACGGTCGATTC-3 ’，分别位于823 825突变位点的两侧，扩增片段长度为168bp。探针序列为PN1H274-Pbl :5’ -HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3'；PN1H274Y-Pb2 :5， -FAM-AATGCCCCTAATTAIIACTA-MGBNFQ-3，。分别与823 825位点及两端序列互补，其中荧光基团位于探针的5’端，MGB位 于3’端。 实施例2 人工合成包含274野生型或突变型编码序列的RNA用PmH274Y-F和PmH274Y_R引物从临床分离样本中扩增274H野生型DNA片段， 用PmH274Y-F和包含突变位点的274Rm(GCATTCCTCATAGTAATAATTAGGG)引物，包含突变位 点的 274Y-Fm(CCCTAATTATTACTATGAGGAATGC)和 PN1H274Y-R 分别扩增突变位点的 5，禾口 3， 端片段，然后将纯化回收的片段混合作为模板，以PN1H274Y-F和PN1H274Y-R为引物进行扩 增，获得含有274Y突变的片段。将突变型和野生型的片段克隆到pGEM-Teasy (Promega公 司)载体中(pGEM-Teasy-274Y、pGEM-Teasy-274H)进行测序。将MS2噬菌体的assembly protein和coat protein的基因片段用引物 CTAGATCTCCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTT 和 TTGGATCCGAGTTGAACTTCTTTGTTGTCTTC 扩增后用 BglII和BamHI酶切，酶切片段克隆到载体pET28a的BamHI位点中并测序鉴定方向，选取 BamHI位点临近T7ter序列的pET28a_MS2作为进一步克隆的载体。用BamHI和HindIII 从测序正确的pGEM-Teasy-274H和pGEM_Teasy-274Y质粒中切出目的片段并分别克隆到 pET28a-MS2载体中构建pET28a_MS2_274H和pET28a_MS2_274Y质粒，然后转化到大肠杆菌 BL21 (DE3)中进行IPTG诱导表达，然后抽提RNase和DNase处理的菌液上清中的RNA。实施例3 该方法的特异性检测以季节性流感HlNl、H3N2及B型流感，人源高致病性禽流感H5W和禽源的H9N2 病毒RNA为模板，及IO4倍稀释的H274Y野生型和突变型RNA混合物作为模板进行特异性 检测。PCR反应液组成如下(采用TaKaRa —步法荧光定量RT-PCR试剂盒，ABI 7500荧 光定量PCR仪)2XOne Step RT-PCR Buffer 12. 5μ LPN1H274Y-F0. 4 μ MPN1H274Y-R0. 4 μ MPN1H274-Pbl0. 2 μ M
6
PN1H274Y-Pb20. 2 μ MR0X 均一化参比染料0. 5 μ LTaKaRa Ex Taq HS0. 5 μ LPrimeScript RT Enzyme Mix 0. 5 μ L样品RNA5μ LDEPC处理水补足至25 μ L，混勻；反应程序为42°C逆转录30min ；95°C预变性2min ；95°C，5s变性，55°C复性与延伸 40s，收集FAM (FAM通道)和HEX (VIC通道)荧光，共40个循环。结果如图1所示，该方法可以特异的检测H274Y突变，与所检测的流感病毒没有交 叉反应发生。季节性流感HlNl、H3N2和B型流感，人禽流感病毒H5W以及禽源的H9N2病 毒用来评价该方法是否会产生交叉反应，结果均未扩增。实施例4 该方法的敏感性检测将本发明方法(图2D)与WHO推荐的A型流感(图2A)及2009新型流 感的检测方法(CDC protocol of real-time RT-PCR for influenza A (HlNl), http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/CDCR ealtimeRTPCR_ SwineHlAssay-2009_20090430. pdf.)(图2C) ,2009新型流感的检测试剂盒(上海超世生物 技术公司)(图2B)进行比较。用等量的Hmi病毒RNA为模板进行PCR反应。结果如图2 所示，证明该方法与WHO推荐的检测甲型流感的方法敏感性相同，明显优于WHO推荐的2009 新型流感的检测方法。实施例5 对临床样本的检测对收集的715份Hmi阳性临床样本，以RNA作为模板进行双重实时荧光定量 RT-PCR反应，对临床样本中是否存在H274Y基因型的病毒进行检测。所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用Qiagen RNeasy Mini Kit或其它试 剂盒所提取。本发明中，所述样品RNA的提取步骤可为1)离心管中加入500 μ 1 RLT禾口 6 μ L β -巯基乙醇；2)向上述溶液中加入200 μ L样本(包括含漱液、咽拭子、呼吸道吸出物等)，振荡 混勻Imin ；3)加入等体积的70 %乙醇混勻；4)取700 μ 1混合液加入收集管内的离心柱中，12000rpm离心15s ；5)重复步骤4 一次；6)加入700 μ 1 Rffl缓冲液于离心柱中，12000rpm离心15s ；7)加入500 μ 1 RPE缓冲液于离心柱中，12000rpm离心15s ；8)重复步骤7 —次；9)倒尽收集管中液体，空离一次；10)加入适量无RNA酶的水溶解RNA并离心收集，置于_70°C保存。所述双重实时荧光定量RT-PCR反应试剂组成(以TaKaRa —步法荧光定量RT-PCR 试剂盒为例)和反应程序(以ABI 7500荧光定量PCR仪为例)为2XOne Step RT-PCR Buffer12. 5μ 1
PN1H274Y-F0. 4 μ MPN1H274Y-R0. 4 μ MPN1H274-Pbl0. 2 μ MPN1H274Y-Pb20. 2 μ MROX 参比染料0.5yLTaKaRa Ex Taq HS0. 5 μ LPrimeScript RT Enzyme Mix 0. 5 μ L病毒 RNA5 μ LDEPC处理水补足至25 μ L，混勻；反应程序为42°C逆转录30min ；95°C预变性2min ；95°C，5s变性，55°C复性与延伸 40s，收集FAM (FAM通道)和HEX (VIC通道)荧光，共40个循环。结果证明715份样本中，有一份出现了 HEX和FAM两种荧光的累积，说明该份样 本中的病毒为奥司他韦耐药型与敏感型混合病毒，且从扩增曲线中的Ct值可以看出，耐药 型病毒明显多于敏感型病毒，通过设计一对引物扩增NA基因的0RF，并克隆到pGEM-Teasy 载体进行蓝白斑筛选，随机挑取100个分离良好的白色菌落培养并测序，结果证明NA确为 Y274与H274基因型的混合物，且其比例约为3. 5 1。该H274Y突变的神经氨酸酶基因序 列已经登录美国GenBank数据库，登录号为HM145748。
权利要求
一种检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的特异性扩增引物和荧光探针，其特征在于所述特异性扩增引物序列如下PN1H274Y F5’ AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA 3’PN1H274Y R5’ AAGACACCCACGGTCGATTC 3’所述荧光探针序列如下PN1H274 Pb15’ HEX ATGCCCCTAATTATCACTA MGBNFQ 3’PN1H274Y Pb25’ FAM AATGCCCCTAATTATTACTA MGBNFQ 3’。
2.如权利要求1所述的特异性扩增引物和荧光探针在制备检测甲型Hmi流感病毒抗 药性突变的荧光PCR检测试剂盒中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述试剂盒主要包括PCR缓冲液、DNA聚合 酶、逆转录酶、脱氧三磷酸核苷混合物、特异性扩增引物和荧光探针。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述试剂盒中还包括R0X 均一化参比染料。
5.一种检测检测甲型Hmi流感病毒抗药性突变的方法，所述方法包括(1)提取样品RNA；(2)荧光PCR扩增检测取PCR缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、脱氧三磷酸核苷混合物、 ROX均一化参比染料、特异性扩增引物和荧光探针配成PCR反应液，加入样品RNA为模板进 行扩增反应，反应条件为42°C逆转录30min ；95°C预变性2min ；95°C,5s变性，55°C复性与 延伸40s，收集FAM和HEX荧光，共40个循环；所述特异性扩增引物序列如下 PN1H274Y-F :5’ -AGGCCTCATACAAGATCTTCAGAATA-3’ PN1H274Y-R :5’ -AAGACACCCACGGTCGATTC-3’ 所述荧光探针序列如下PN1H274-Pbl :5’ -HEX-ATGCCCCTAATTATCACTA-MGBNFQ-3， PN1H274Y-Pb2 :5’ -FAM-AATGCCCCTAATTATTACTA-MGBNFQ-3’ ；(3)结果分析如果仅有HEX荧光积累，则表示样品中存在H274基因型的甲型Hmi流 感病毒，且未发生H274Y突变，为对奥司他韦敏感的病毒；如果有FAM荧光积累，则表示样品 中存在甲型Hmi流感病毒，且已发生H274Y突变，为对奥司他韦不敏感的病毒；如果没有荧 光出现，则表示样品中不存在甲型Hmi流感病毒。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中PCR反应液每25μ L组成如下2XOne Step RT-PCR Buffer 12. 5μ L引物 PN1H274Y-F0. 4 μ M引物 PN1H274Y-R0. 4 μ M探针 PN1H274-Pbl0. 2 μ M探针 PN1H274Y-Pb20. 2 μ MR0X 均一化参比染料0.5yLTaKaRa Ex Taq HS0. 5 μ LPrimeScript RT Enzyme Mix 0. 5 μ L样品RNA5μ LDEPC水补足至25 μ L。
全文摘要
本发明提供了一组检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的特异性扩增引物和荧光探针及其应用，以及检测甲型H1N1流感病毒抗药性突变的方法。采用本发明方法，操作方法简单，结果直观明了；引物和探针敏感性强，特异性好；在流感检测与监测中可快速的对是否是抗药株作出鉴定，大大减少了人力、物力的耗费。
文档编号C12N15/11GK101928787SQ201010258889
公开日2010年12月29日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者卢亦愚, 周敏, 张严峻, 茅海燕, 陈寅 申请人:浙江省疾病预防控制中心