一种肝素酶Ⅲ融合蛋白及其编码基因与表达方法

专利名称：一种肝素酶Ⅲ融合蛋白及其编码基因与表达方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和发酵工程领域中一种肝素酶III融合蛋白及其编码基因 与表达方法。
背景技术：
肝素酶(h印arinase)是一类作用于肝素Q^parin)或者硫酸乙酰肝素O^paran sulfate)的多糖裂解酶，在许多种微生物中发现，包括棒杆菌Corynebacterium sp.(高 宁国等，肝素酶产生菌的筛选及发酵条件，微生物学报1999 Vol. 39 :64_67)、鞘胺醇 杆菌Sphingobacterium sp.(高宁国等，鞘胺醇杆菌肝素酶的产生，微生物学报2003 Vol. 43 :813-816)、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (王忠彦，肝素酶产生菌的筛选及 其粗酶性质的研究，四川大学学报(自然课学版)2002 Vol. 39:777-779)、环状芽孢杆菌 Bacillus circulans (Yasutaka Tahara et al. , Purification and characterization of heparinase that degrades both heparin and heparin sulfate from Bacillus circulans BioSci. Biotechnol. Biochem. 2002 Vol. 66 :1181_1184)、解肝素拟杆 菌 Prevotella heparinolytica(Kazuyuki Sugahara et al. , Characterization of heparinase from an oral bacterium Prevotella heparinolytica J.Biochem. 1998 Vol. 123 :283-288)、粪便拟杆菌 Bacteroides stercoris HJ-15 (Dong Hyuu Kim et al.， Purification and characterization of a novel heparinase from Bacteroides stercoris HJ-15 J. Biochem. 2000 Vol. 128 :323_328)和月干素黄杆菌 Flavobacterium hepar inum (Sas i ekharan, R. 1991 Ph. D. Thesis，Havards University)。但是来自月干素黄杆 菌的肝素酶是商业化的唯一来源。肝素酶的研究具有十分重要的意义(Sasiekharm，R. 1991 Ph. D. Thesis， Havard University ；Sasiekharan, R. et al.，A comparative analysis of the primary sequences and characteristics of heparinase I， II and III from Flavobacterium heparinum Biochemical and Biophysical Research Communication 1996 Vol. 229770-777)肝素酶是多糖裂解酶的一种，用于研究肝素酶及其底物多糖肝素之间的相互作 用，有助于阐明多糖裂解酶的作用机制；肝素酶可以用于解析肝素等复杂粘多糖的结构及 其生物学功能；肝素酶可以用于解析人体内的凝血和抗凝血机制；肝素酶可以用作临床血 液肝素化的去除，防止手术后出血；肝素酶用于PCR反应前血液制品的处理；肝素酶可以用 于制备低分子的抗凝血药物低分子量肝素。来自肝素黄杆菌的肝素酶主要有三种，分别命名为肝素酶I (EC 4. 2. 2. 7)、肝素酶 II (No EC code)和肝素酶 III (EC 4. 2. 2. 8) (Robert J. Linhardt et al. , Purification and characterization of heparin lyases from Flavobacterium heparinum JBC 1992Vol. 267 =24347-24355)。肝素酶I主要作用于肝素，分子量43kDa，肝素酶II作用于 肝素和硫酸乙酰肝素，分子量85kDa，肝素酶III主要作用于硫酸乙酰肝素，分子量73kDa。 其中，对肝素酶I的研究较多，而对肝素酶II和III的研究相对较少。
硫酸乙酰肝素蛋白聚糖是一种结构复杂的酸性蛋白聚糖，参与体内一系列的生理 和病理过程，如胚胎发育、神经突生长、血管形成、组织修复、炎症、自身免疫、肿瘤生长和转 移等(Kjellen L，Lindahl U· Proteoglycans-Structures and interactions Annu Rev Biochem,1991 Vol. 60 440-443 ；Bernfield M， Gotte M， Park P W， et al. Functions of cell surface heparan sulkfate proteoglycans Annu Rev Biochem，1999，68 :726_729)。 硫酸乙酰肝素的酶解是其发挥上述作用的主要因素。酶解后可以释放并激活各种与它结合 的活性分子，从而影响各种生理及病理过程。因此，降解硫酸乙酰肝素的酶是至关重要的调 节因子，研究该酶(肝素酶III)具有重要的理论意义和应用价值。然而肝素酶III通常是 从肝素黄杆菌发酵液中提纯获得的，肝素黄杆菌生产肝素酶III的同时产生肝素酶I、II和 四种软骨素酶(chondroitinase B, C，ABC, AC)，使肝素酶III的分离纯化变得复杂，通常 需要经过多步的色谱纯化，收率很低。肝素黄杆菌增长速度慢，肝素酶的生产稳定性差，而 且，产肝素酶需要价格昂贵的肝素诱导，增加了酶的成本，因而肝素酶III的异源重组表达 是替代肝素黄杆菌生产肝素酶III的有效可行的方案。然而对肝素酶III的异源重组表达研究非常有限，到目前为止，文献报道只有 Godavarti和Su等对肝素酶III进行了重组表达，但是结果都不理想。Godavarti研 究结果表明重组肝素酶III的活性非常低，且绝大部分都以不可溶形式存在(80-85% 为包涵体)(Godavarti R，Davis M，Cooney C，Langer R，Sasisekharan R. Heparinase III from Flavobacterium heparinum :Cloning and Recombinant Expression in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996，225 :751_758) ；Su 的石if 究中表 达的肝素酶III活性有所提高，但是不能进行一步纯化，致使纯化费用比较高，不利于 XMtM^ (Su H， blain F, Musil RA, Zimmermann JJF, Gu K， Bennett DC. Isolation and Expression in Escherichia coli of hepB and hepC，Genes Coding for the Glycosaminoglyean—Degrading Enzymes Heparinase II and Heparinase III， Respectively, from Flavobacterium heparinum. Appl. Environ. Microbiol. 1996，622723-2734)。研究发现，通过将麦芽糖结合蛋白(MBP)与酶的融合可以显著提高酶重组表 达的可溶性。本研究小组利用融合蛋白技术将MBP融合到肝素酶I的氮端并低温诱导显著 的提高了肝素酶I重组表达的可溶性。此项工作已经申请专利，专利号为200410038098. 6。 而且来自大肠杆菌的天然的MBP能够与麦芽糖特意吸附，参与大肠杆菌对麦芽糖的转运和 利用。MBP不但能与直链淀粉结合，实现亲和分离，也能与马铃薯淀粉实现亲和分离(Usha Srinivasan et al. ， A convenient method for affinity purification of maltose binding protein fusions. Journal of Biotechnology 1998 Vol. 62 :163-167 ；廉德君 等，一种改进的融合蛋白亲和层析纯化方法，生物化学与生物进展1998 Vol. 25 :283_284)， 从而可以大大降低酶的分离纯化成本，有利于实现工业化规模的分离纯化。

发明内容
本发明的目的在于提供一种肝素酶III融合蛋白及其编码基因。本发明提供的融合蛋白(命名为MBP-H印C)，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2的第1-1028所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有肝素酶III活性的由a)衍生的蛋白质。该融合蛋白MBP-H印C中的MBP的氨基酸序列如SEQ ID No 2的自氨基酸第1-367 所示；该融合蛋白中的H印C的氨基酸序列如SEQ ID No 2的自氨基酸第394-1028所示。上述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。进一步，上述基因是如下1)或2)或3)1)编码序列是序列表中序列1 ；2)在高严谨条件下与序列表中序列1的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述蛋 白的核苷酸序列；3)与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有95%以上的同源性且编码权利要求 1所述蛋白的核苷酸序列。序列1中，MBP的编码区是序列1的自5，端第1-1101位的碱基；Ifepc的编码区是 序列1的自5，端第1180-3090位的碱基。所述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液， pH7. 2,7% SDS)中，65°C预杂交30min ；弃预杂交液，加入杂交液(0. 25mol/L磷酸钠缓 冲液，pH7.2,7% SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65°C杂交12hr ；弃杂交液，加入洗膜 液I (20mmol/L磷酸钠缓冲液，ρΗ7· 2,5% SDS)，65°C洗膜2次，每次30min ；加入洗膜液 II (20mmol/L 磷酸钠缓冲液，ρΗ7· 2,1% SDS)，65°C洗膜 30min。含有上述基因的重组载体或转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。进一步，上述重组载体是通过以下步骤构建的将序列表中序列1所示的DNA片段插入质粒pMAL-c2x的多克隆位点，得到重组表 达载体。含有上述基因的重组菌也属于本发明的保护范围之内。进一步，上述重组菌是含有上述的重组载体的重组大肠杆菌。上述重组大肠杆菌的宿主优选是ToplO。本发明的另一目的在于提供一种生产肝素酶III的方法。本发明提供的方法，是将上述的重组菌诱导培养，表达得到肝素酶III。上述诱导培养条件是0. Ol-ImM的IPTG，10_42°C诱导培养15-28小时；优选是 0. 24mM的IPTG，15°C诱导培养25小时。上述诱导培养的培养基的溶剂是水，溶质是10g/L NaCl, 5g/L酵母提取物，10g/L 蛋白胨，(质量百分比)乙醇，0.6mg/L氯霉素和100 μ g/L氨苄青霉素。本发明构建了防止包涵体形成的融合表达载体，并通过amylose树脂实现一步亲 和分离。通过融合蛋白首次实现肝素酶III在大肠杆菌中90%以上有活性、正确折叠的可 溶蛋白形式存在；大肠杆菌Topl0(pMAL-h印C)在37摄氏度培养2. 5小时后，加入0. 24mM IPTG，诱导温度15摄氏度，培养基中酵母粉浓度0.5%，乙醇1%，生产的肝素酶酶活可达 1776. 3IU/L发酵液，表达量可达240mg/L发酵液，比酶活可达7. 39IU/mg。本发明还可通过 亲和分离实现了该融合蛋白的一步纯化。本发明通过改变IPTG浓度，加入IPTG时间，诱导 温度，培养基成分等优化提高了融合蛋白的产量和肝素酶III活性。本发明将在肝素酶III 的生产中发挥重要作用。


图1为表达载体pMAL-h印C的构建过程示意图。图2为从肝素黄杆菌中PCR扩增得到的肝素酶III基因电泳图谱。图3为转化子PCR验证电泳图谱。图4为转化子酶切验证电泳图谱。图5为大肠杆菌ToplO/pMAL-h印C工程菌株表达MBP-H印C的SDS-PAGE图谱。图6为融合蛋白MBP-HEPC通过直链淀粉树脂亲和分离的SDS-PAGE电泳图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。所述引物合成及测序工作均由 invitrogen生物技术有限公司完成，所有的限制性内切酶均购自New England Biolabs公 司；Pfu酶及dNTP购自TaKaRa公司；所有感受态细胞(如DH5 α、ΤΒ1和ToplO)购自北京 全式金生物技术有限公司)；肝素酶III酶活测定底物硫酸乙酰肝素购自Sigma公司，其它 的化学药品均为一般分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。实施例1、肝素酶III融合蛋白MBP-H印C的表达一、去除信号肽的肝素黄杆菌肝素酶III编码序列的克隆表达载体pMAL-hepC的构建过程如图1所示，具体过程如下1、引物的设计及合成经Genbank查询得至Ij月干素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)月干素醇III 白勺 DNA )ψ 歹Ij (Su, H. ， Blain, F. ， Musil, R. Α. ， Zimmermann, J. J. ， Gu, K. and Bennett, D. C. Isolation and expression in Escherichia coli of hepB and hepC,genes coding for the glycosaminoglycan-degrading enzymes heparinase II and heparinase III， respectively, from Flavobacterium heparinum. Appl. Environ. Microbiol. 1996,62, 2723-2734)，再根据去除编码信号肽碱基的肝素黄杆菌肝素酶III的DNA序列设计引物，并 在引物序列中引入限制性内切酶BamH I和Pst I的识别位点，所用的上下游引物分别为上游引物Pl 5’-CGCGGATCCCAAAGCTCTTCCATTACCAGG-3’ (带下划线的碱基为 BamH I的酶切位点)，下游引物P2 5，-AAAACTGCAGTTACTAAGGAACCAACACAAGCTG-3，(带下划线的碱基为 Pst I的酶切位点)，扩增后，即分别引入BamHI和Pst I酶切位点。2、PCR扩增去除信号肽的肝素黄杆菌肝素酶III的编码序列PCR扩增的反应体系为50ng肝素黄杆菌基因组DNA模版，IOOpmol每种引物，1 X 扩增缓冲液(北京天为生物技术有限公司)，200 μ mol/L每种dNTP，1单位高保真Pfu酶； 扩增程序为95摄氏度变性5分钟，50、53、56或60摄氏度引物退火1分钟，72摄氏度延伸 2分钟，30个循环后，72摄氏度延伸10分钟结束反应。该PCR结果如图2所示，表明扩增得 到了 1. 9kb的肝素酶III基因片段，测序表明，扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1的 第1180-3090位所示(命名为H印C)。图2中，泳道1_4分别为退火温度为60、56、53或50 摄氏度扩增结果，泳道M为分子量marker (条带大小依次为10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、 2吐、1.5吐、1吐、80(^ 、50(^ 、30(^ )，箭头所指处为1. 9kb目标片段。
3、构建含有目的片段的克隆载体参照试剂盒说明书进行操作，将步骤一中2中的PCR扩增的目的片段直接亚克隆 入载体pMD -19T Simple (TaKaRa公司)中，得连接产物。4、转化大肠杆菌及阳性克隆转化子的筛选及测序将步骤3获得的连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，具体方法为将10 μ 1 的连接产物与100 μ 1的大肠杆菌DH5 α感受态细胞混勻，冰浴30分钟，42摄氏度热激90 秒，冰浴10分钟，然后加入800 μ 1含100 μ g/L氨苄青霉素的LB液体培养基(蛋白胨3g， 酵母提取物1. 5g，NaCl 3g，水285mL)中，180rpm、37摄氏度振摇60分钟，涂于含100 μ g/L 氨苄青霉素的LB抗性培养平板(蛋白胨3g，酵母提取物1. 5g，NaCl 3g，琼脂粉4. 5g，水 285mL，16 μ 1 X-gal和4 μ 1 IPTG/平板)进行蓝白斑筛选。37摄氏度培养12-20小时。挑 选白斑并以此为模版，用引物Pl和P2进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系及反应条件与步骤 2相同。反应结束后，对扩增产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，可含转化子的阳性克隆。 将筛选得到的阳性克隆转至5mL含0. 05mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37摄氏度、 220rpm振摇12小时，将菌液交由invitrogen生物技术有限公司进行测序，将含有具有序列 表中序列1的第1180-3090位核苷酸序列的肝素酶III蛋白编码基因的pMD _19T Simple 重组载体命名为pMD-19-h印C。二、重组大肠杆菌表达载体的构建以pMD-19-h印C质粒为模版，用引物Pl和P2进行PCR扩增肝素黄杆菌肝素酶 III的基因，PCR反应体系及反应条件与步骤一中2相同。将PMAL-C2X载体(购自美国 New England Biolabs公司和PCR产物(以pMD_19_h印C质粒为模版的扩增产物)分别用 BamHI和Pst I双酶切，用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)连接，转化DH5 α，以Pl和Ρ2为 引物，通过菌落PCR筛选转化子(如图3所示)，提取可得到1.9kb PCR产物的转化子中的 pMAL-c2x重组载体，分别通过BamH I和Pst I双酶切验证(如图4所示)。图3中M为分 子量 marker (条带大小依次为 IOkb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1. 5kb、Ikb、800bp、500bp、 300bp)，泳道1、2为PCR验证的转化子，箭头所指处为肝素酶III基因条带。图4中M为分 子量 marker (条带大小依次为 IOkb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1. 5kb、Ikb、800bp、500bp、 300bp)，泳道1为重组质粒pMAL-h印C被BamH I和Pst I双切后电泳图，箭头所指处为肝 素酶III基因条带，泳道2为重组质粒pMAL-h印C被Kpn I单切后电泳图，泳道3为正确连 接的重组质粒pMAL-h印C，泳道4为原始质粒pMAL-c2x。将通过BamHI和Pst I双酶切得 到的1.9kb片段的质粒进行测序，将含有具有序列表中序列1的第1180-3090位核苷酸序 列的肝素酶III融合蛋白编码基因的pMAL-c2x重组载体命名为pMAL-h印C。在pMAL-h印C 中，h印C基因与IacZa基因之间有两个连续的终止密码TAGTAA，从而能够有效地终止蛋白 翻译不会表达IacZ α蛋白。三、肝素酶III融合蛋白MBP-H印C的表达提取步骤二中含有pMAL-hepC的大肠杆菌DH5a中的质粒，按照常规方法转 化大肠菌 TBI、ToplO、JM109、BL21(DE3)和 BL21 (DE3) (plysS) 2。除 Ε. coli TBI 感受 态细胞制作按照《分子克隆实验指南》中氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的说明完成 外，E. coliTOPIO、E. coli DH5a、E.coli JM109、Ε· coli BL21 (DE3)、Ε. coli BL21(DE3) (PlysS)感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。经过氨苄青霉素筛选和利用步
7骤一中步骤1提供的引物进行菌落PCR鉴定，得到含有pMAL-h印C的大肠杆菌ΤΒ1、Τορ10、 JM109、BL21(DE3)和 BL21 (DE3) (plysS)，SP TBl/pMAL-h印C、ToplO/pMAL-h印C、JM109/ pMAL-h印C、BL21 (DE3) /pMAL-h印C、BL21 (DE3) (plysS) /pMAL-hepC 和 DH5 α /pMAL-hepC 作 为表达MBP-H印C的工程菌。以质粒 pMAL-c2x 转化大肠杆菌 TBl、ToplO、JM109、BL21 (DE3)、BL21 (DE3) (plysS) 和 DH5 α，得到空载体对照 TBl/pMAL-c2x、ToplO/pMAL-c2x、、JM109/pMAL-c2x、BL21 (DE3) / pMAL-c2x、BL21 (DE3) (plysS)/pMAL_c2x 和 DH5 α /pMAL_c2x。以下操作对上面的工程菌平行进行。将空载体对照和工程菌分别在含氨苄青霉素抗性的LB培养基(NaCl 10g/L,酵母 提取物为5g/L，蛋白胨10g/L，l% (质量百分比)乙醇，0.6mg/L氯霉素，含100yg/L氨苄 青霉素)37摄氏度培养2. 5小时后，加入终浓度为0.24mM IPTG 15摄氏度诱导25小时。 10000rpm，8分钟离心收集菌体并用20mmol/L Tris-HCl (pH 7. 5)洗涤两次，重悬至OD6tltl约 为8. 000附近。将上面OD6tltl约为8. 000重悬液进行超声破碎(输出功率为300W，每次超声 3秒和间歇3秒的处理198次)，12000rpm, 30分钟离心，超声破碎后离心所得的上清液即为 粗酶液。酶活力(单位为IU/L)的检测采用232nm的光吸收法，IIU的酶活定义为30摄氏 度每分钟产生1 μ mol不饱和键的反应效力。取硫酸乙酰肝素底物溶液0. 5ml (25g/L硫酸 乙酰肝素，40mM NaCl, 3. 5mM CaCl2,17mM Tris_HCl，pH 7. 5)，加入上步中所得的粗酶液，其 他体积以Tris缓冲液补充，最终的反应体积为1. 5ml，测单位时间内在232nm的吸光度变 化ΔΑ232。消光系数ε = 38001^。比酶活(单位为IU/mg蛋白)的定义为酶活力与粗酶 液蛋白浓度(单位为mg/L)的比值。蛋白浓度监测采用常规的Bradford法。结果如表1 所示，空载体对照菌株 TBl/pMAL-c2x、ToplO/pMAL_c2x、JM109/ pMAL-c2x、BL21 (DE3)/pMAL_c2x、BL21 (DE3) (plysS) /pMAL-c2x 和 DH5 α /pMAL-c2x 诱导培 养后无酶活，工程菌只有ToplO表达出了有活性的可溶性MBP-H印C融合蛋白。并且经过测 序，ToplO/pMAL-h印C表达出的融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No :2所示；并且该 融合蛋白MBP-H印C中的MBP的氨基酸序列如SEQ ID No 2的自氨基酸第1-367所示；该融 合蛋白中的H印C的氨基酸序列如SEQ ID No 2的自氨基酸第394-1028所示。表1融合质粒pMAL-h印C宿主优化结果
权利要求
一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2的第1 1028所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有肝素酶III活性的由a)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)1)编码序列是序列表中序列1；2)在高严谨条件下与序列表中序列1的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述蛋白的 核苷酸序列；3)与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有95%以上的同源性且编码权利要求1所 述蛋白的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体或转基因细胞系。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是通过以下步骤构建的将序列表中序列1所示的DNA片段插入质粒pMAL-c2x的多克隆位点，得到重组表达载体。
6.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是含有权利要求4或5所 述的重组载体的重组大肠杆菌。
8.—种生产肝素酶的方法，是将权利要求6或7所述的重组菌诱导培养，表达得到肝素酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述诱导培养条件是0.Ol-ImM的IPTG， 10-42°C诱导培养15-28小时；优选是0. 24mM的IPTG，15°C诱导培养24小时。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述诱导培养的培养基的溶剂是水，溶 质是10g/L NaCl，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，(质量百分比)乙醇，0.6mg/L氯霉 素和lOOyg/L氨苄青霉素。
全文摘要
本发明公开了一种肝素酶III融合蛋白及其编码基因与表达方法。本发明提供的融合蛋白(命名为MBP-HepC)，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2的第1-1028所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有肝素酶III活性的由a)衍生的蛋白质。上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。将上述基因导入重组大肠杆菌中表达的蛋白肝素酶酶活可达1776.3IU/L发酵液，表达量可达240mg/L发酵液，比酶活可达7.39IU/mg。本发明还可通过亲和分离实现了该融合蛋白的一步纯化。
文档编号C12N1/15GK101942025SQ20101025991
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者冯权, 叶逢春, 张翀, 李晔, 蒋培霞, 邢新会 申请人:清华大学;北京思清源生物科技有限公司