一种新型trail融合蛋白的制作方法

一种新型trail融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，提供了一种新型TRAIL融合蛋白，含有TGF?α第三环区的序列，具有极强的特异性肿瘤杀伤作用；并公开了新型TRAIL融合蛋白的编码基因及其表达途径，融合蛋白的生产方法，以及该蛋白质在治疗肿瘤等疾病中的应用。
【专利说明】
一种新型TRAIL融合蛋白
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及新型TRAIL融合蛋白，以及利用基因工程技术生产 该融合蛋白的方法以及其作为药物治疗肿瘤和其它相关疾病的应用。
【背景技术】
[0002] TRAIL(TNF_related apoptosis-inducing ligand,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导 配体)也称为Apo2L(Apo_21igand,凋亡素-2配体），是肿瘤坏死因子超家族的一个成员[1]， 其正式命名为肿瘤坏死因子超家族成员l〇(Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10) JRAIL分子由281个氨基酸残基组成，是一个典型的II型跨膜蛋白，18-38氨基 酸残基形成具有螺旋结构的单次跨膜区，氨基端位于胞浆内，羧基段的39-281氨基酸残基 位于细胞外。TRAIL胞外部分可以被蛋白酶切割，释放进入组织间液和血液中，形成可溶性 的分子形式(sTRAIL) [2]。重组表达的一些人源sTRAIL片段，如对应于胞外95-281、104-281 或114-281的TRAIL序列，都具有诱导细胞凋亡的活性；安进公司和罗氏公司合作开发的 TRAIL(114-281)重组蛋白，称为杜拉乐明（Dulanermin)，已进入临床研究[3]。
[0003] TRAIL作用于至少五个内源性的受体[4]。只有膜受体TRAIL-R1和TRAIL-R2含有胞 内死亡结构域而能向细胞内传递死亡信号，因此，TRAIL只能通过激活这两个死亡受体(也 分别称为DR4和DR5)诱导细胞凋亡。TRAIL只有形成同型三聚体，才具有受体激活活性。应用 死亡受体了1^几-1?1和了1^11^-1?2的激动性单克隆抗体，也能产生一样的生物效应[5,6]。 TRAIL-R3、TRAIL-R4和可溶性受体0PG可能作为拮抗性受体调节TRAIL的活性。
[0004] 死亡受体激动剂具有抑制肿瘤的生理活性，并具有先天的肿瘤特异性和选择性， 它们极可能成为更高效的肿瘤治疗药物。在大量临床前研究中，许多sTRAIL以及TRAIL-R1 和TRAIL-R2的激动性单克隆抗体，展现了良好的抗肿瘤效果，但这些TRAIL受体激动剂在临 床实验中，尽管毒性较低，有很高的安全性，在个别病人有持续的抗肿瘤作用，却没有获得 确定的临床疗效[7-9]。
[0005] 常规的重组sTRAIL临床疗效不佳，可能归因于其药代动力学上有限的剂量暴露， 如杜拉乐明的半衰期在人体少于lh。缺乏疗效也可能是由于TRAIL受体在许多正常细胞和 组织的广泛表达，全身治疗时，大多数sTRAIL结合到正常组织中相对过剩的TRAIL受体上， sTRAIL对肿瘤细胞的吸附量下降，因而活性降低[10]。此外，由于拮抗性受体TRAIL-R3和 TRAIL-R4在肿瘤中的广泛表达，sTRAIL对肿瘤细胞激动性死亡受体的结合进一步被限制， 治疗效果受到严重损害。TRAIL-R1和TRAIL-R2的激动性单克隆抗体，具有很好的药代动力 学特征，对TRAIL受体的结合有很高的类型特异性，但在临床研究中也没有获得更好的疗效
[11]。
[0006] 通过某些方法，提高TRAIL的活性，是增强其临床有效性的发展目标。如通过与白 蛋白融合，可以明显提高TRAIL的血浆半衰期[12];主要针对DR4和DR5的型特异性TRAIL突 变体[13，14 ]，能够提高其对不同肿瘤细胞的杀伤效应;TRAIL可以与针对肿瘤标志物的抗 体或其片段融合[15,16]，这种融合蛋白通过抗原靶向性，促使其对预定的细胞表面目标抗 原结合，导致选择性肿瘤细胞聚集，并通过旁观者效应，即利用表面交联有TRAIL蛋白的细 胞对缺乏抗原的邻近肿瘤细胞的杀伤作用，产生增强的药理活性[17]。但融合的靶向/效应 域的分子可能干扰TRAIL的结构形成和生物活性[18]。
[0007] EGFR(epidermal growth factor receptor，表皮生长因子受体）是受体酪氨酸激 酶ErbB家族中的一个类型(ErbBl)，参与调控细胞生长、增殖、分化和迀移等多种重要的生 物事件，在多种肿瘤细胞中过量表达。EGFR与相应配体EGF、TGF-a等结合，可以诱导受体自 身二聚体化，同时由其胞内酪氨酸激酶结构域发生自身磷酸化而活化，激活下游一系列级 联酶促信号传导过程，将生长信号传递至核内。EGFR是一个有确定意义的药物靶点[19];抗 EGFR的单克隆抗体，和特异性靶向EGFR酪氨酸激酶活性的小分子抑制剂如吉非替尼 (gef itinib)以及埃罗替尼（erlotinib)，可以有效地治疗一些EGFR阳性肿瘤的患者。抗 EGFR药物抑制EGFR信号通路，能够增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性[20]。抗EGFR抗体与 sTRAIL形成的重组融合蛋白，靶向EGFR阳性肿瘤细胞，既能迅速灭活EGFR介导的有丝分裂 信号，又能有效地激活TRAIL受体，介导细胞凋亡信号转导，具有很强的抗肿瘤活性[21， 22]。
[0008] EGFR的天然配体EGF、TGF-a等或其有效结合片段，以及设计合成的人工肽片，与强 效的细胞毒素通过融合重组或联结反应，能够生成靶向EGFR阳性肿瘤细胞的细胞毒素或免 疫毒素[23-26]。这些联结/融合物与EGFR结合后进入细胞内，诱导细胞死亡，或通过免疫反 应，杀伤肿瘤细胞。相比于抗体融合，配体融合或联结分子具有更小的分子质量和体积，易 于向肿瘤组织内渗透，可能获得更稳定的疗效，也更利于生产制备。
[0009] 作为EGFR的天然配体的小分子量多肽TGF-a，与EGF有着相似的分子结构与功能； 它们在肽链内部均存在3对二硫键，将约50个氨基酸长度的肽链折叠成三环结构。TGF-a第 三环区（TGF3L)能结合EGFR，但不具有TGF-a和EGF的促细胞分裂增殖活性[27]。人TGF3L与 TNFa融合形成的融合蛋白，对鼠肿瘤L929细胞具有与TNFa相同的毒性作用，而对两种人肿 瘤细胞的细胞毒性明显高于原型TNFa[28]。人TGF3L与超抗原的N-端或C-端融合，均能增加 其免疫治疗活性[24]。
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【发明内容】

[0038] 本发明解决的技术问题，一方面是提供一种包含TRAIL的新型融合蛋白、编码融合 蛋白的基因序列、含有该基因序列的表达载体和/或宿主细胞，并提供一种表达该融合蛋白 的方法;另一方面，提供一种TRAIL融合蛋白作为高效抗肿瘤药物的应用。
[0039]本发明的技术方案，第一方面是提供了一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋 白是包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中所述第一结构域是TGF-a来源的多肽， 而所述第二结构域是结合TRAIL受体的多肽。
[0040]上述融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白基本上由第一结构域和第二结构域 组成，其中所述第一结构域为TGF-α的至少一部分，所述第二结构域为TRAIL蛋白的胞外域 的至少一部分。
[00411上述融合蛋白，其特征在于，其中所述第一结构域是人TGF-α(SEQ. ID. NO. 1)，而所 述第二结构域是人TRAIL( SEQ. ID. NO. 2)。
[0042]上述融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白，其中所述第一结构域为TGF-α第三 环区SEQ.ID.N0.3,所述第二结构域为TRAIL蛋白的胞外域的至少一部分。
[0043] 上述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是SEQ. ID. N0.8，或与SEQ. ID. N0.8具有 至少95 %序列同一性的融合蛋白。
[0044] 本发明的技术方案，第二方面是提供了一种核酸分子、表达载体或宿主细胞。
[0045] 上述核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有编码本发明第一方面所述融合蛋 白的基因序列，优选SEQ ID N〇:7所示的基因序列。
[0046] 上述表达载体，其特征在于，所述表达载体包含本方面所述的核酸分子，连接于载 体的启动子用于核酸分子编码蛋白的表达。
[0047] 上述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有本方面所述的核酸分子或表达载 体。
[0048]本发明的技术方案，第三方面是提供了一种采用如下步骤生产目的蛋白或多肽的 方法：（1)扩增适宜的宿主细胞；（2)诱导宿主细胞表达融合蛋白；（3)分离制备融合蛋白； 和/或(4)对融合蛋白进行体外复性，以获取生物活性蛋白；其特征在于，该步骤（1)中的宿 主细胞是本发明第二方面所述的宿主细胞。
[0049] 本发明的技术方案，第四方面是提供了一种制备抗肿瘤药物的方法，其特征在于， 制备的抗肿瘤药物包含本发明第一方面所述融合蛋白。
[0050] 本发明的技术方案，第五方面是提供了 一种制备抗肿瘤药物的方法，其特征在于， 制备的抗肿瘤药物包含本发明第二方面所述核酸分子、表达载体或宿主细胞。
[0051] 本发明技术方案，第六方面提供了新型融合蛋白在预防和治疗肿瘤相关疾病、 TRAIL相关疾病中的应用。
[0052] 发明详述：
[0053]本发明的目的是提供一种新型TRAIL融合蛋白，提供一种制备新型TRAIL融合蛋白 及其编码基因、表达载体的方法，提供所述融合蛋白编码基因和表达载体的表达步骤，以及 提供一种新型TRAIL融合蛋白的使用方法。
[0054]本发明发现，TRAIL蛋白与TGF-a第三环区（TGF3L)连接，形成新的融合蛋白，具有 比TRAIL蛋白更强的肿瘤细胞杀伤作用；这种增强作用主要体现在对TRAIL敏感的肿瘤细 胞，而对TRAIL毒性不敏感的正常细胞仍然没有活性。对许多TRAIL敏感的人肿瘤细胞，该融 合蛋白的特异性肿瘤杀伤作用可以提高百倍，甚至千倍;对鼠肿瘤L929细胞，该融合蛋白的 肿瘤杀伤作用仍可以提高百倍以上。极高活性的TRAIL融合蛋白，有可能克服目前TRAIL和 同类药物在临床研究应用中出现的疗效不确定的缺点，发挥其应有的高效抗肿瘤作用。 [0055]新的TRAIL融合蛋白的活性，可能由TGF3L与EGFR的结合作用介导。但本发明不把 其具体活性机制作为发明的基础或限定条件。
[0056]本发明所述新的TRAIL融合蛋白，含有TRAIL的功能性结构域，和TGF-α第三环区 (TGF3L)或结构域。TRAIL的功能性结构域指能结合TRAIL受体的结构域。由已知晶体结构可 知，TRAIL的功能性结构域，位于其胞外结构区，起始于约120位氨基酸残基左右，至羧基端 终末281位氨基酸残基；用于重组表达，含有功能性结构域的TRAIL片段，常见有114-281， 104-281，95-281或含更多氨基端序列的TRAIL分子片段，主要是其胞外结构区。TGF-α第三 环区（TGF3L)，为其两端半胱氨酸残基涵盖的由10个残基数组成的片段，融合表达时，经常 采用含两端延伸序列，残基数15-20长度的分子。二者融合时，可以使其序列直接连接，也可 以通过一个间隔序列间接连接。二者的连接顺序可变，即TGF3L可位于TRAIL结构域的氨基 端或羧基端。融合蛋白中两种结构域可以是单拷贝数，也可以分别包含更多的拷贝数。 TGF3L可根据需要进行适合的氨基酸残基取代、缺失或添加;TRAIL结构域也可以是其氨基 酸残基取代、缺失或添加的变异体，甚至是含TRAIL结构域的TRAIL环化变构体（中国专利申 请2011800680194)，因此获得对各受体亚型的不同亲和力，或获得其它需要的特征，只要这 些变体提供与野生型蛋白质类似水平的药理学活性，均被包括在本发明中。
[0057]本发明的融合蛋白可以进一步包括有助于蛋白质纯化、增加重组蛋白的表达、或 者增加重组蛋白的溶解性的一个或多个另外的多肽结构域。这种纯化/表达/促进溶解性的 结构域，包括但不限于金属螯合肽，如组氨酸标签。在纯化结构域和TGF3L/TRAIL之间可包 含可切割的间隔序列，如TEV、因子Xa或肠激酶识别序列，可利于纯化后标签的去除。
[0058] 制备新型TRAIL融合蛋白，需要首先获得编码TRAIL结构域和TGF3L的基因克隆。通 常，根据已知的基因序列设计PCR引物，用从相应组织或细胞中提取的RNA，进行反转录PCR 可直接获得cDNA克隆；更简单的，可以人工合成与天然编码DNA序列相同的基因序列；也可 以按照其氨基酸序列，用公知的设计方法，依宿主的基因偏好，合成不同密码子偏好的基因 序列；也容易从其它商业途径获得所需的基因克隆。上述二者的编码基因可以依照需要进 行编码突变，以获得不同的变异体。
[0059] 可以按公知的方法，构建编码本发明所述融合蛋白的表达载体。用常规的分子生 物学手段，首先将编码TRAIL结构域和TGF3L的基因直接共码连接。它们的连接顺序可以根 据需要进行调整。上述基因片段也可以通过含有编码间隔序列的基因片段连接。上述获得 的融合蛋白编码基因，按公知的方法插入合适的表达载体，得到表达上述融合蛋白的重组 载体。也可以将需要的基因片段按合适的顺序依次连接到表达载体上。上述表达载体包括 但不限于原核表达载体和各种真核表达载体。可选择各种商品化的表达载体，如表达载体 PQE系列，pET系列等，也可采用自行改造或构建的表达载体。
[0060] 按公知的方法将重组载体转入宿主细胞，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、 其它原核细胞、各种真核生物细胞。在合适的条件下进行诱导表达，表达的宿主细胞经破碎 裂解，收取融合蛋白产物。细菌表达的TRAIL融合蛋白通常以包涵体形式存在，可经过体外 复性获得活性产物。表达产物可以通过公知的方法纯化。
[0061] TRAIL融合蛋白可以在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行化学修饰。 通过体内或体外的多肽化学衍生，形成如乙酰化、磷酸化、羧基化或糖基化修饰。这些修饰 通常不改变蛋白的一级结构，而能够改善其抗蛋白水解性能或其它理化性能。另外，用D-氨 基酸、非天然氨基酸或非氨基酸类似物替代或添加，获得修饰的融合蛋白，也包含在本发明 范围内。
[0062]本发明的TRAIL融合蛋白，具有与TRAIL蛋白类似的肿瘤杀伤频谱，但由于其极强 的活性，可用于临床肿瘤患者的治疗。该融合蛋白也可能用于其它TRAIL相关的疾病的治 疗。
[0063]本发明的TRAIL融合蛋白作为药物施用的典型方法，为肠胃外的途径，通过静脉 内、皮下、肌肉内或者腹膜内注射，或通过输注或任何其它可接受的全身给药方法。通过静 脉输注的施用方法是优选方案。另外，已知多种蛋白质口服的治疗性递送方法，也可以应用 于本发明的治疗性融合蛋白。
[0064] 融合蛋白可配制于无毒、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，或与其它合 适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受 的载体或添加剂。这类载体包括但不限于:盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油及其组合。锌离子 可以稳定TRAIL的三聚体分子，是一种合适的添加剂;一些还原性分子如巯基乙醇，可以保 持TRAIL分子内巯基免被氧化，以维持其生物活性，也是一类合适的添加剂。药物剂型应与 给药方式相匹配。本发明的TRAIL融合蛋白也可以被制成针剂形式，用例如生理盐水或含有 葡萄糖和其他辅剂的水溶液，通过常规方法进行制备。其它形式的药物组合物，也可通过常 规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液等宜在无菌条件下制造。配制好的药物组合物可 以通过前述途径进行给药。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师 技能范围之内的。此外，本发明的TRAIL融合蛋白还可与其他治疗剂一起使用。
[0065] 本发明也可考虑通过基因治疗方法施用融合蛋白，例如，施用编码融合蛋白的核 酸。本发明所述融合蛋白的编码核酸序列已完全公开，通过重组DNA方法获得及改造这种核 酸的方法完全在本领域技术人员的能力之内。为了在特定细胞获得重组蛋白质产量的最大 化，进行密码子优化，同样也完全在本领域技术人员的能力之内。基因治疗方法在本领域中 也是熟知的
[0066]有益技术效果：
[0067] 本发明的优点在于，相对于TRAIL与抗体、与白蛋白、与TGF-α全蛋白形成的融合蛋 白，这种新型TRAIL融合蛋白分子量小，容易穿透肿瘤组织，可能获得更有效的治疗效果。且 较小的分子量更容易采用原核表达系统生产，有效降低其生产成本。
[0068] 本发明的另一个优点是，这种新型TRAIL融合蛋白相对于重组sTRAIL，应该还具有 EGFR靶向的特点，拥有双靶向功能，具有极高的生物活性。
【附图说明】：
[0069]图1.人重组TRAIL的原核表达。
[0070] 重组TRAIL在E.coli TG1中进行表达，收取未诱导全菌样品（_)、IPTG诱导全菌样 品（ + )、诱导菌可溶性上清样品（S)、和不溶性包涵体样品（I)，在13%SDS-PAGE凝胶中进行 电泳分离检测。诱导后融合蛋白以包涵体形式在宿主菌内有效蓄积。Μ为蛋白电泳marker及 其分子量(kD);箭头所指为表达产物TRAIL条带位置。
[0071] 图2.TGF3L-TRAIL融合蛋白的表达。
[0072]融合蛋白在E.coli TG1中表达样品：收取未诱导全菌样品（_)、经IPTG诱导全菌样 品( + )、诱导上清样品（S)、诱导包涵体样品（I)，在13%SDS-PAGE凝胶中进行电泳检测。融合 蛋白以包涵体形式高效表达。Μ为蛋白电泳marker及其分子量(kD);箭头所指为融合蛋白条 带位置。
[0073]图3.重组可溶性TRAIL和新型TGF3L-TRAIL融合蛋白作用于人胚肺成纤维细胞 HELF，各自的细胞杀伤活性量效曲线的比较。
[0074] 图4.重组可溶性TRAIL和新型TGF3L-TRAIL融合蛋白作用于人表皮癌细胞A431，各 自的细胞杀伤活性量效曲线的比较。
[0075] 图5.重组可溶性TRAIL和新型TGF3L-TRAIL融合蛋白作用于人宫颈癌细胞Hela，各 自的细胞杀伤活性量效曲线的比较。
[0076] 图6.重组可溶性TRAIL和新型TGF3L-TRAIL融合蛋白作用于人肝癌细胞Bel-7402， 各自的细胞杀伤活性量效曲线的比较。
[0077] 在实施例、权利要求和叙述中所涉及的序列如下：
[0078] 1 ·人TGF-α氨基酸序列（SEQ · ID · N0 · 1)
[0079] 2 ·人TRAIL氨基酸序列（SEQ· ID · NO · 2)
[0080] 3 · TGF-a第三环区氨基酸序列（SEQ· ID·NO· 3)
[0081 ] 4.人TRAIL114-281在表达载体中的编码核酸序列（SEQ. ID.NO.4)
[0082] 5 ·人TRAIL114-281 表达产物氨基酸序列（SEQ· ID·NO· 5)
[0083] 6.人TGF-a第三环区及其下游编码基因的序列（SEQ. ID.NO.6)
[0084] 7 ·融合蛋白 TGF3L-TRAIL基因编码序列（SEQ· ID · NO · 7)
[0085] 8 ·融合蛋白 TGF3L-TRAIL氨基酸序列（SEQ· ID · NO · 8) 实施例：
[0086] 下面通过具体实施例进一步阐明本发明的内容，但这些实施例并不限制本发明的 保护范围。常规质粒构建所涉及的PCR、酶切、连接等实验，以及蛋白质表达所涉及的转化、 细菌培养等实验为本领域研究人员所熟悉，所以具体相关实验细节没有详细注明，具体可 参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著)所述常规实验条 件。
[0087]实施例1:蛋白表达载体构建
[0088]以含有人TRAIL cDNA序列的质粒pMD-TRAIL(北京义翘神州生物技术有限公司）为 模板，用引 物TL5 ataggatccGTGAGAGAAAGAGGTCCTC和TL3 atactcgagTTAGCCAACTAAAAAGGCCC 扩增编码人 TRAIL 的 114-281 片段。经 BamHI 和 Xhol 双酶 切，插入PQE30的BamHI和Sail酶切位点，构建成pQE30-TRAIL表达载体，翻译阅读框 (SEQ. ID. N0.4)含有载体的His-Tag编码。
[0089]设计合成的引物TGFL5 ataggatccGTTTGCCACTCTGGTTACGTTGG，TGFL CCACTCTGGTTACGTTGGTGCTCGTTGCGAACACGCTGACCTGCTG和TGFL3 ataagatctACCACCCAGCAGGTCAGCGTGTTC经混合PCR扩增，获得含有编码TGF-α第三环区及其 下游序列的基因（SEQ.ID.N0.6);基因片段经Bgin酶切，与BamHI酶切的TRAIL114-281连 接；再经TGFL5和TL3引物扩增，获得的编码TGF-α第三环区与TRAIL 114-281融合基因 (SEQ. ID. N0.7)用BamHI和Xhol双酶切，插入pQE80L的BamHI和Sail酶切位点，构建成 PQE80L-TGL3-TRAIL表达载体。融合蛋白（SEQ. ID. N0.8)中，TGF序列与TRAIL结构域由GGRS 四个氨基酸残基组成的短间隔序列连接;表达产物含有载体编码的His-Tag。
[0090] 实施例2:融合蛋白原核表达
[0091] 将相关重组质粒转化到E.coli TG1感受态，得到目的工程菌株。具体实施例均采 用实验室小规模摇瓶表达。在含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C条件下振荡活化过夜， 之后将过夜培养物按1:100转到新的含有氨苄青霉素的LB培养基(500mL)中，37°C振荡培养 至合适对数生长期，经ImM IPTG诱导表达约4小时。
[0092] 菌液于4°C条件下，7000rpm离心5min后弃上清，收集菌体，用10mL体积的roS重悬 后，加入Triton X-100使其终浓度为1%，混匀，反复冻融裂解，超声破菌20min。裂解液于4 °C，12000rpm离心5min后弃上清，得包涵体，-20 °C保存。
[0093]实施例3:包涵体的洗涤与溶解
[0094]将包涵体沉淀用包涵体洗液A(50mM Tris-HCl，pH 7.6,3%Triton X-100和20mM EDTA)重悬，于4°C，12000rpm离心5min，重复洗涤两次;再用包涵体洗涤液B(含50禮1^8_ HCl，pH 7.6,0.5%Triton X-100，1M NaCl，2M尿素）重复洗涤两次。用包涵体溶解液A(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10M尿素，ΙΟπιΜβ-巯基乙醇，pH 9.0)溶解包涵体，离心收取上清，用 含有50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 9.0的缓冲液迅速稀释至尿素浓度为3M，以待下一步 纯化。
[0095]实施例4:蛋白纯化与复性
[0096]采用固定化Ni2+螯合层析法纯化变性蛋白。层析柱用10倍柱体积的结合缓冲液 (50mM Tris-HCl，100mM NaCl，3M尿素 ，pH 9.0)平衡，样品用含有50-500mM咪唑的结合缓冲 液进行梯度洗脱。
[0097] 洗脱样品中加入硫酸铵至70%饱和度，于4°C，12000rpm离心15min，沉淀用溶解缓 冲液B(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，5M盐酸胍，30mM DTT，pH 8.0)重新溶解。澄清溶液分6 次缓慢加入到约为其4倍体积的复性液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，0.5M尿素，0.4]?1^-Arg，2mM DTT，lmM ZnS04，pH 9.7)中，两次之间间隔1小时。在200倍体积的透析复性液 (50mM Tris-HCl，100mM NaCl，2mM DTT，pH 8.0)中进行透析，换液3-4次，间隔4-10小时。于 4°C，12000rpm离心15min，得到复性蛋白上清。
[0098]实施例5:蛋白电泳与定量
[0099] SDS-PAGE凝胶按常规方法配制。复性蛋白溶液40μ1，加入10μ1的5 X SDS上样缓冲 液（300mM Tris-HCl(pH 6·8)、20%β-巯基乙醇、20%SDS、25%甘油、0.05%溴酚蓝），沸水 浴5min，制备完成后置于-20°C保存。
[0?00] 蛋白样品上样，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)作为标准品，进行 13 % SDS-PAGE。考马斯亮蓝R-250染色，对脱色后的凝胶蛋白条带用QuantiScan软件进行灰 度扫描，依据BSA定量的标准曲线计算融合蛋白含量。
[0101] 实施例6:细胞培养与活性测试
[0102] 各细胞株在含有10%胎牛血清(杭州生物工程材料有限公司），100U/mL青霉素和 100yg/mL链霉素的RPMI-1640培养基(美国Gibico公司）中培养，温度为37°C，二氧化碳浓度 为5% 〇
[0103] 将待测蛋白用培养基等比稀释成一系列浓度。
[0104] 将细胞消化成为单个细胞后，按一定浓度加入96孔培养板（100μL孔），置于37°C， 5%C02的孵箱培养24小时。加入不同浓度待测蛋白，作用72小时后弃去培养液，每孔加入 lOOyL含0.5mg/ml MTT的RPMI-1640培养基。置于37°C，5%C02的孵箱培养4小时，弃去培养 液，每孔加入DMSO 150yL，常温下震摇lOmin，使蓝色结晶完全溶解，用Bi〇-Rad450型酶标仪 测定每孔吸光度，检测波长570nm、参考波长655nm〇
[0105] 按公式计算各孔的抑制百分率，及每组剂量中的平行孔抑制百分率的平均数和标 准差：
[0106] 未加细胞未加药为本底，即为100%抑制；只加细胞未加药物的为阴性对照，即为 0%抑制。
[0107] 待测品抑制率％ =(阴性对照0D-待测化合物00)八阴性对照0D-本底0D) X 100%
[0108] 设TRAIL( 114-281)实验组，和融合蛋白实验组。
[0109] 表1.重组可溶性TRAIL与TGF3L-TRAIL融合蛋白的体外抗肿瘤活性(3-5次平行实 验IC50的平均值与标准差，nM)，以及融合蛋白活性相对TRAIL的增强倍数(各平行实验增强 倍数的平均值）。
【主权项】
1. 包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中所述第一结构域是TGF-α来源的多 肽，而所述第二结构域是结合TRAIL受体的多肽。2. 权利要求1所述的融合蛋白，基本上由第一结构域和第二结构域组成，其中所述第一 结构域为TGF-α的至少一部分，所述第二结构域为TRAIL蛋白的胞外域的至少一部分。3. 权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一结构域是人TGF-a，而所述第二结构域是 人TRAIL。4. 权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一结构域为TGF-a第三环区，具有 SEQ.ID.NO. 3所示的氨基酸序列，所述第二结构域为TRAIL蛋白的胞外域的至少一部分。5. 权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白是SEQ. ID.N0.8所不的氣基酸序列。6. 权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与SEQ.ID.NO. 8具有至少95%序列同 源性。7. -种核酸分子，其特征在于所述的核酸分子含有编码权利要求1中所述的融合蛋白 的核苷酸序列。8. -种表达载体，其特征在于所述表达载体含有权利要求7所述的核酸序列。9. 一种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞包含权利要求7所述的核酸分子。10. -种生产方法。所述的生产方法包括以下步骤： A. 获得编码权利要求1中所述融合蛋白的基因序列 B. 将步骤A中所得的序列插入到合适的载体中，得到相应的核酸构建体 C. 将步骤B所得的核酸构建体转染到适宜的宿主细胞 D. 在适宜的培养条件下，培养步骤C中的宿主细胞，并从中分离出表达的新型融合蛋 白。11. 药物组合物，其包含权利要求1所述的融合蛋白。12. 权利要求1所述的融合蛋白作为预防和治疗肿瘤相关疾病药物的应用。13. 权利要求12所述肿瘤是乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、口腔癌、宫颈癌、 胰腺癌、皮肤癌、肾癌等之一。14. 编码权利要求1所述融合蛋白的编码基因，作为治疗肿瘤药物的使用方法。
【文档编号】C12N15/62GK106046170SQ201610221487
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年4月11日 公开号201610221487.5, CN 106046170 A, CN 106046170A, CN 201610221487, CN-A-106046170, CN106046170 A, CN106046170A, CN201610221487, CN201610221487.5
【发明人】王楠, 闫征, 王燕
【申请人】中国医学科学院药物研究所