用于防治阿尔茨海默病的融合蛋白及其制备方法和应用

用于防治阿尔茨海默病的融合蛋白及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于防治阿尔茨海默病的融合蛋白及其制备方法和应用，该融合蛋白包括人p75NTR(p75神经营养因子受体)的胞外域p75NTR?ECD、人IL?33(白细胞介素?33)以及分别连接所述p75NTR?ECD的羧基端和所述人IL?33的氨基端的连接肽；所述p75NTR?ECD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述人IL?33的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明克服了p75NTR?ECD或其融合蛋白p75NTR?ECD?FC的不稳定和具有免疫原性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的缺陷和防治AD的作用机理单一的缺点，同时将IL?33和p75NTR?ECD两者的功能结合在一起并通过提高两者的稳定性和协同作用大大提升防治AD的生物学活性。
【专利说明】
用于防治阿尔茨海默病的融合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种用于防治阿尔茨海默病的融合蛋 白及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病(Alzheimer' s disease， AD)，常称"老年痴呆"症。自从20世纪发现 阿尔茨海默病以来，AD发病率随着老龄化的加剧和相应的老年人口的快速增长而升高，AD 的防治已成为各国政府和医学界关注的焦点。
[0003] AD是一种起病隐匿的渐进性发展的神经系统退行性疾病，其确切的发病机理至今 未明。AD的病因学说有多种，其中主要以β-淀粉样级联学说占主导地位。大脑出现包含淀粉 样邱太(Αβ)淀粉斑的沉积是AD的主要组织病理学特征。淀粉斑的主要成分是Αβ，Αβ由39-43 个氨基酸残基组成，而其中以ΑΜ0和Αβ42为主。Αβ来源于自其前体蛋白（Amyloid precursor protein，ΑΡΡ)，Αβ是APP分别经β-和γ -分泌酶（secretase)水解而成。在病理状 态下，APP代谢异常，导致Αβ生成过多，或者由于Αβ清除障碍导致Αβ聚集、沉淀形成淀粉斑。 神经营养因子受体p75(p75NTR)结合Αβ及其聚合体介导了份定粉肽的神经毒性反应，诱导机 体产生炎症反应，导致神经元病变和凋亡，促进AD的发生和病情进一步恶化。可溶性Αβ或其 寡聚体和不溶性Α?3纤丝和斑块都有神经毒性作用。任何能防止大脑内仙的过度产生和聚集 以及阻断P75NTR结合Αβ介导神经毒性反应的方法都可达到预防AD发生和缓解AD病情或阻 止AD病情恶化的目的。
[0004] P75NTR是Ρ75神经营养因子受体，是相对分子质量为75kD的跨膜糖蛋白，由427个 氨基酸组成，包含一条由28个氨基酸组成的信号肽、富集半胱氨酸的胞外域、疏水性的跨膜 区以及由155个氨基酸组成的富含碱性氨基酸的胞内域。其胞外域(p75NTR extracellular domain，p75NTR-ECD)由4个半胱氨酸富集重复序列区（CRDs)组成，每个重复序列含有40个 氨基酸组成的重复结构和6个半胱氨酸，翻译后经N-与0-糖基化修饰，第2个重复序列是结 合神经营养因子(NTs)和Αβ所必需的。其跨膜区由含有22个氨基酸的单链组成，跟p75NTR的 磷酸化有关。P75NTR被TACE(TNF_alpha converting enzyme)酶所裂解释放其胞外域 P75NTR-ECD。
[0005] 根据游离的p75NTR-ECD可结合Αβ从而阻止p75NTR与Αβ结合产生神经毒性的原理， 在中国专利ZL201010561284.3中，王延江和周新富设计p75NTR-ECD和p75NTR-ECD-FC用于 AD的防治；在申请号为201210053808.7的中国专利申请中，王永堂等人设计p75NTR-ECD-FC 用于促进损伤中枢神经再生与功能恢复。王延江和周新富以及王永堂等人设计和制备的 P75NTR-ECD和p75NTR-ECD-FC存在以下缺陷；（1)他们都使用原核表达系制备目标蛋白，所 制备的产物都未经过翻译后的糖基化修饰，因而未能保持P75NTR-ECD的原有的理化性质和 蛋白质的天然空间构象，所以无法保证其制备的蛋白具有有效的生物活性用于AD的临床治 疗。（2)p75NTR-ECD-FC是p75NTR-ECD与人免疫球蛋白的FC段的融合蛋白，其中的FC段能在 体内诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，导致自身的免疫系统攻击神经元细 胞，促发AD或者促使AD进展和恶化，达不到防治AD的目的。（3)p75NTR-ECD-FC的FC段具有免 疫原性，能诱导机体产生抗FC的抗体，促使ECD生物活性失效或者被快速降解。（4)p75NTR-E⑶和p75NTR-E⑶-FC只含E⑶，只能和Αβ结合，未能诱导机体促进Αβ的降解，所以无法有效 防治AD。
[0006] 白细胞介素-33(11^6^6111^11-33，11^-33)是在2005年发现的白细胞介素-1 (Interleukin-1，IL-1)家族的一个信号素，其基因序列与IL-1家族成员IL-Ιβ和IL-18相 似。IL-33是协调先天性免疫反应及免疫细胞浸润和活化的重要调节因子。IL-33含有270个 氨基酸，包含一个N末端核定位信号、螺旋-转角-螺旋的基元和C端，分子量约18kDa<JL-33 与由ST2和IL-lRAcP组成的异源二聚体受体复合物结合，触发包含髓样分化因子88(MyD88) 和NF-κΒ的细胞内信号通道的级联反应，选择性地激活2型辅助性T细胞、肥大细胞，中性粒 细胞，和选择性激活的巨噬细胞。在中枢神经系统(CNS)，IL-33由少突胶质细胞表达，而ST2 则主要由小胶质细胞和星形胶质细胞表达。IL-33是一种多潜能、多效性的细胞因子，在感 染、炎症和自身免疫性疾病中发挥着十分重要的调节作用。2009年，Chapuis J等人通过遗 传学研究发现AD患者脑内的IL-33表达显著减少，且IL-33基因的三个单核苷酸多态性 (SNPs)与降低AD的发生和进展的风险密切相关（参见"Chapuis J，et al. (2009) Transcriptomic and genetic studies identify IL_33as a candidate gene for Alzheimer's disease.Mol Psychiatry 14(11): 1004-1016."）。2008年Miller,A.M.等人 发现IL-33能对促进AD的发生和进展的重要危险因子动脉粥样硬化起到保护性作用（参见 uMiller,A.M.,Xu,D.,Asquith,D.L.,Denby,L.,Li,Υ., Sattar,N., Baker,A.H.,McInnes, I.B.,Liew,F.Y.,2008.IL-33reduces the development of atherosclerosis .J. Exp .Med. 205,339246."）。这种保护性作用可能与IL-33 通过下调 Αβ 的 分泌有关。2011年Yasuoka，S.等人发现IL-33能以呈剂量依赖性方式诱导小胶质细胞的增 殖和细胞因子IL_10、TNFa和IL-10的产生（参见 "Yasuoka, S.，Kawanokuchi，J.，Parajuli， B.,Jin,S.,Doi,Y.,Noda,M.,Sonobe,Y.,Takeuchi,H.,Mizuno,T.,Suzumura, A., 2011.Production and functions of IL_33in the central nervous system.Brain Res. 1385,8-17."）。因此，研究发现IL-33能够防止AD的发生和阻止AD病情的进展和恶化， 对AD防治具有潜在的治疗作用。
[0007] 鉴于目前还没有防治AD的有效药物和有效的治疗手段，以及P75NTR-ECD和 P75NTR-ECD-FC在开发应用于AD防治方面存在缺陷，找到能够用于防治AD的有效药物至关 重要。

【发明内容】

[0008] 为了弥补上述现有技术的不足，本发明提出一种用于防治阿尔茨海默病的融合蛋 白及其制备方法和应用。
[0009] 本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
[0010] -种用于防治阿尔茨海默病的融合蛋白，包括人P75NTR的胞外域p75NTR-ECD、人 IL-33以及分别连接所述p75NTR-ECD的羧基端和所述人IL-33的氨基端的连接肽；所述 p75NTR-ECD的氨基酸序列如SEQIDN0.1所示，核苷酸序列如SEQIDN0.2所示;所述人IL-33的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0011] 一种所述的融合蛋白的构建方法，包括将人P75NTR的细胞外域p75NTR-E⑶的羧基 端和人IL-33的氨基端通过连接肽连接起来的步骤，所述人p75NTR的细胞外域p75NTR-ECD 的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，核苷酸序列如SEQ ID勵.2所示;所述人几-33的氨基酸 序列如SEQ ID N0.3所示，核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0012] -种所述的融合蛋白的表达载体，其以mRNA，DNA质粒载体或病毒载体中的一种作 为载体。
[00?3] -种所述的融合蛋白的DNA质粒载体的制备方法，包括如下步骤：
[0014] (1)克隆得到人P75NTR的细胞外域P75NTR-ECD的基因片段；
[0015] (2)克隆得到人IL-33的基因片段；
[0016] (3)通过PCR反应得到编码p75NTR-ECD-Linker的基因片段，其中p75NTR-ECD的羧 基端与Linker的氨基端连接，所述Linker的基因片段来自PCR反应的反向引物序列；
[0017] (4)通过重叠 PCR反应将p75NTR-ECD-Linker的羧基端与人IL-33的氨基端连接，获 得融合蛋白P75NTR-ECD-IL-33的基因片段，其中，p75NTR-ECD-Linker基因片段的5 '端带有 一酶切位点，IL-33基因片段的3'端带有另一酶切位点；
[0018] (5)将融合蛋白P75NTR-ECD-IL-33的基因片段通过酶切后插入一质粒载体中两个 相应的酶切位点之间，转化宿主菌，提取阳性质粒，对插入的目的基因进行测序，获得含有 编码P75NTR-ECD-IL-33目的基因的DNA质粒载体；
[0019] 或者，步骤(3)和(4)可以分别用（3'）和(4'）替换：
[0020] (3'）通过PCR反应得到编码IL-33-Linker的基因片段，其中IL-33的氨基端与 Linker的羧基端连接，所述Linker的基因片段来自PCR反应的反向引物序列；
[0021] (4'）通过重叠 PCR反应将IL-33-Linker的氨基端与人P75NTR-ECD的羧基端连接， 获得融合蛋白P75NTR-ECD-IL-33的基因片段，其中，IL-33-Linker基因片段的5'端带有一 酶切位点，P75NTR-E⑶基因片段的3'端带有另一酶切位点。
[0022] 一种目标蛋白的制备方法，所述目标蛋白为人P75NTR的胞外域p75NTR-ECD、人IL- 33 或所述的融合蛋白 p5NTR-ECD-IL-33 中的 一种; 包括如 下步骤 ：
[0023] (1)以目标蛋白的基因片段为模板，以一质粒载体为载体，以该质粒载体的两个酶 切位点为目的基因的插入位点，在目标蛋白的氨基端连接Flag标签，若目标蛋白为人 P75NTR的胞外域p75NTR-ECD或人IL-33,则采用PCR反应相应获得带有Flag标签的目标蛋白 的表达质粒：质粒VFlag-p75NTR-ECD或质粒VFlag-IL-33;若目标蛋白为融合蛋白p5NTR-ECD-IL-33,则采用重叠 PCR反应获得带有Flag标签的p75NTR-ECD-IL-33的表达质粒:质粒V Flag-p75NTR-ECD-IL-33;
[0024] (2)将表达质粒转染真核细胞获得表达目标蛋白的稳定细胞系；
[0025] (3)从稳定表达目标蛋白的细胞中提取和初步纯化目标蛋白得到目标蛋白粗溶 液；
[0026] (4)从目标蛋白粗溶液中去除Flag标签获取纯化的目标蛋白。
[0027] -种所述的融合蛋白或所述的融合蛋白的DNA质粒载体在制备防治阿尔茨海默病 的药物中的应用。
[0028] -种用于防治阿尔茨海默病的药物，所述药物为所述的融合蛋白，或者表达所述 的融合蛋白的mRNA脂质体，或者携带表达所述的融合蛋白基因的病毒载体。
[0029] 本发明与现有技术对比的有益效果包括:本发明设计和构建了用于防治阿尔茨海 默病的融合蛋白（也可以命名为P75NTR-ECD-IL-33)，其由p75NTR的胞外域p75NTR-ECD和 IL-33通过连接肽(Linker)连接而成，克服了 p75NTR-ECD或其融合蛋白p75NTR-ECD-FC的不 稳定和具有免疫原性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的缺陷和防治AD的作用 机理单一（只通过和Αβ结合）的缺点，同时将IL-33和p75NTR-ECD两者的功能结合在一起并 通过提高两者的稳定性和协同作用大大提升防治AD的生物学活性。具体来说，具有以下优 点：（l)p75NTR-ECD-IL-33同时具有p75NTR-ECD和IL-33两者的生物学功能。p75NTR-ECD-IL-33中的p75NTR-ECD能与Αβ及其聚合体结合，阻止p75NTR与Αβ及其聚合体结合，保护中枢 神经元免受Αβ的神经毒性的损害。p75NTR-ECD-IL-33中的IL-33能诱导机体降低Αβ的分泌 和促进Αβ的降解，防止AD的发生和阻止AD病情的进展和恶化。（2)p75NTR-ECD-IL-33是融合 蛋白，能有效提高和延长其中包含的P75NTR-ECD和IL-33在体内外的稳定性和半衰期。（3) P75NTR-ECD-IL-33能使其中包含的p75NTR-ECD和IL-33在防止和治疗（即防治)AD方面发挥 协同作用，P75NTR-ECD-IL-33通过p75NTR-ECD结合Αβ使IL-33对Αβ具有精准的靶向性，使 IL-33在Αβ及其寡聚体周围诱导机体直接内吞或者产生Αβ降解酶降解Αβ，从而提高机体对A β的降解效率。结果，使P75NTR-ECD-IL-33融合蛋白的生物学活性较p75NTR-ECD和IL-33单 体大幅度提高。（4)p75NTR-ECD-IL-33可被构建成在真核细胞系和人体内表达，使p75NTR-E⑶-IL-33中的p75NTR-E⑶和IL-33在翻译后得到充分的糖基化修饰因而保持原有的理化 性质和生理状态下的生物学功能。（5)p75NTR-ECD-IL-33消除了p75NTR-ECD-FC中的FC的免 疫原性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，所以预期p75NTR-ECD-IL-33可以作为 预防和治疗AD的安全有效药物，填补了防治阿尔茨海默病至今还没有有效药物的空白。
【附图说明】
[0030] 图1是本发明【具体实施方式】中的融合蛋白P75NTR-ECD-IL-33的构建示意图；
[0031]图2是本发明【具体实施方式】中的融合蛋白p75NTR-ECD-IL-33的质粒载体示意图； [0032]图3是本发明【具体实施方式】中SDS-PAGE免疫印迹测定用HEK-293细胞表达系所制 备的融合蛋白P75NTR-ECD-IL-33、蛋白p75NTR-ECD和蛋白IL-33的电泳图。
[0033] 图4是本发明【具体实施方式】中融合蛋白p75NTR-ECD-IL-33、蛋白p75NTR-ECD和IL-33 的体外稳定性测定示意图；
[0034] 图5是本发明【具体实施方式】中融合蛋白p75NTR-ECD-IL-33、蛋白p75NTR-ECD和IL-33 的体内稳定性测定示意图；
[0035]图6是本发明【具体实施方式】中经注射融合蛋白p75NTR-E⑶-IL-33后AD小鼠血液中 Αβ1-42的浓度水平变化图；
[0036]图7是本发明【具体实施方式】中经注射融合蛋白p75NTR-ECD-IL-33后AD小鼠大脑皮 层中Αβ1-42的含量变化图。
【具体实施方式】
[0037] 下面对照附图并结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。
[0038] 本发明设计和构建了用于防治阿尔茨海默病的融合蛋白（也可称为嵌合抗原受体 蛋白（Chimeric antigen receptor Protein，CAR_P)，可命名为p75NTR-ECD_IL_33)。在本 文中"连接肽" "linker"表示的是同一个概念。"人p75神经营养因子受体"可缩写为 "P75NTR" ； "人白细胞介素-33"可缩写为"人IL-33"或"IL-33"。
[0039]本发明提供一种用于防治阿尔茨海默病的融合蛋白，其包括人P75NTR的胞外域 P75NTR-ECD、人IL-33以及分别连接所述p75NTR-ECD的羧基端和所述人IL-33的氨基端的连 接肽;所述p75NTR-ECD的氨基酸序列如SEQIDN0.1所示，核苷酸序列如SEQIDN0.2所示 ； 所述人IL-33的氨基酸序列如SEQIDN0.3所示，核苷酸序列如SEQIDN0.4所示(J具体的： [0040] p75NTR-ECD的氨基酸序列为（250aa):
[0041] Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gin Pro Cys Gly Ala Asn Gin Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gin Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gin Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gin Asp Lys Gin Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gin Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu lie Pro Gly Arg Trp lie Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gin Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gin Asp Leu lie Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gin Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn〇
[0042] p75NTR-ECD 的核苷酸序列（750bp)为：
[0044] 人IL-33的氨基酸序列（269aa)为：
[0045] Lys Pro Lys Met Lys Tyr Ser Thr Asn Lys lie Ser Thr Ala Lys Trp Lys Asn Thr Ala Ser Lys Ala Leu Cys Phe Lys Leu Gly Lys Ser Gin Gin Lys Ala Lys Glu Val Cys Pro Met Tyr Phe Met Lys Leu Arg Ser Gly Leu Met lie Lys Lys Glu Ala Cys Tyr Phe Arg Arg Glu Thr Thr Lys Arg Pro Ser Leu Lys Thr Gly Arg Lys His Lys Arg His Leu Val Leu Ala Ala Cys Gin Gin Gin Ser Thr Val Glu Cys Phe Ala Phe Gly lie Ser Gly Val Gin Lys Tyr Thr Arg Ala Leu His Asp Ser Ser lie Thr Gly lie Ser Pro lie Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gin Ser lie Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu lie Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gin His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gin Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe lie Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu lie Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn lie Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr〇
[0046] 人IL-33的基因核苷酸序列(含终止密码子TAA，810bp):
[0048] 融合蛋白p75NTR-ECD-IL-33的构建方法包括:将人p75NTR的胞外域p75NTR-ECD的 羧基端和人IL-33的氨基端通过连接肽(Linker)连接起来的步骤，具体连接方法如图1所 不。
[0049] 在较优的实施例中，Linker选用柔性连接肽或者刚性连接肽。其中，优选地，柔性 连接肽选择：（Gly Gly Gly Gly Ser)n，n=l~6之间的整数;或者(Gly Gly Gly Gly Thr) n，n = l~6之间的整数。刚性连接肽选择：（Glu Ala Ala Ala Lys)m，m=l~6之间的整数， 或者富含脯氨酸序列(XPro)q，q = 3~10之间的整数，X为任意氨基酸，较优的是X为赖氨酸、 丙氨酸或者谷氨酸中的任一种。
[0050] 在一个更优的实施例中，Linker的氨基酸序列（15aa)如SEQ ID N0.5所示，为:Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser，该Linker基因核苷酸序 列（45bp)如SEQ ID NO.6所示，为：
[0051 ] GGGGGCGGTGGTAGCGGTGGCGGGGGCTCAGGCGGAGGTGGGAGC〇
[0052]选用的该优选Linker中，Gly是非极性的小氨基酸，可以提供融合蛋白的柔性，便 于使融合蛋白在翻译后更好地进行折叠成具有生物学功能活性的天然构象，不影响 P75NTR-ECD-IL-33中p75NTR-ECD和ECD-IL-3的生物学功能；Ser是极性的小氨基酸，能和 H20分子形成氢键，增加连接肽的水溶性和在水溶液中的稳定性，防止Linker干扰融合蛋白 中各个蛋白的生物学功能，当然，在其他实施例中，Ser也可以用苏氨酸Thr代替。
[0053] 相应的，用上述优选的Linker连接的构建的融合蛋白p75NTR-ECD-IL-33的氨基酸 序列（534aa)如SEQ ID勵.7所示，核苷酸序列（含有起始密码子和终止密码子，16056口）如 SEQ ID N0.8所示，分别为：
[0054] Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gin Pro Cys Gly Ala Asn Gin Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gin Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gin Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gin Asp Lys Gin Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gin Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu lie Pro Gly Arg Trp lie Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gin Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gin Asp Leu lie Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gin Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Pro Lys Met Lys Tyr Ser Thr Asn Lys lie Ser Thr Ala Lys Trp Lys Asn Thr Ala Ser Lys Ala Leu Cys Phe Lys Leu Gly Lys Ser Gin Gin Lys Ala Lys Glu Val Cys Pro Met Tyr Phe Met Lys Leu Arg Ser Gly Leu Met lie Lys Lys Glu Ala Cys Tyr Phe Arg Arg Glu Thr Thr Lys Arg Pro Ser Leu Lys Thr Gly Arg Lys His Lys Arg His Leu Val Leu Ala Ala Cys Gin Gin Gin Ser Thr Val Glu Cys Phe Ala Phe Gly lie Ser Gly Val Gin Lys Tyr Thr Arg Ala Leu His Asp Ser Ser lie Thr Gly lie Ser Pro lie Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gin Ser lie Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu lie Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gin His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gin Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe lie Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu lie Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn lie Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr〇

[0056] 本发明还提供一种上述各实施例方式中的融合蛋白的表达载体，该表达载体可以 选择mRNA，DNA质粒载体或病毒载体(包括慢病毒(Lent i virus )，腺病毒(adenovirus )，腺相 关病毒(adeno-associated virus)等）中的一种作为载体。
[0057] 本发明还提供所述的融合蛋白的DNA质粒载体的制备方法，在【具体实施方式】中，包 括如下步骤：
[0058] (1)克隆得到人p75NTR的细胞外域p75NTR-ECD的基因片段；
[0059] (2)克隆得到人IL-33的基因片段；
[0060] (3)通过PCR反应得到编码p75NTR-ECD-Linker的基因片段，其中p75NTR-ECD的羧 基端与Linker的氨基端连接，所述Linker的基因片段来自PCR反应的反向引物序列；
[0061] (4)通过重叠 PCR反应将p75NTR-ECD-Linker的羧基端与人IL-33的氨基端连接，获 得融合蛋白P75NTR-ECD-IL-33的基因片段，其中，p75NTR-ECD-Linker基因片段的5 '端带有 一酶切位点，IL-33基因片段的3'端带有另一酶切位点；
[0062] (5)将融合蛋白p75NTR-ECD-IL-33的基因片段通过酶切后插入一质粒载体中两个 相应的酶切位点之间，转化宿主菌，提取阳性质粒，对插入的目的基因进行测序，获得含有 编码P75NTR-ECD-IL-33目的基因的DNA质粒载体；
[0063]或者，步骤(3)和(4)可以分别用（3'）和(4'）替换：
[0064] (3'）通过PCR反应得到编码IL-33-Linker的基因片段，其中IL-33的氨基端与 Linker的羧基端连接，所述Linker的基因片段来自PCR反应的反向引物序列；
[0065] (4'）通过重叠 PCR反应将IL-33-Linker的氨基端与人p75NTR-ECD的羧基端连接， 获得融合蛋白P75NTR-ECD-IL-33的基因片段，其中，IL-33-Linker基因片段的5'端带有一 酶切位点，P75NTR-E⑶基因片段的3'端带有另一酶切位点。
[0066]在优选的实施方式中：可以选择pcDNA3.1( + )作为所述步骤(5)中的质粒载体;所 述融合蛋白P75NTR-ECD-IL-33的基因片段插入pcDNA3.1( + )的ΚρηΙ和Xba頂每切位点之间。
[0067]以下具体描述一个优选的实施方式来说明p75NTR-E⑶-IL-33目的基因的DNA质粒 载体的构建和制备过程：
[0068] (l)p75NTR-E⑶的基因片段（含有起始密码子ATG，未含终止密码子TAA)克隆自 此!1^11呢卩1?661^〇0嫩，克隆所需的引物(5'-3'）如下：
[0069] SEQIDN0·9所示的正向引物F1:ATGGGTGCAGGGGCGACC;SEQIDN0·10所示的反向 引物 R1 :GTTGTCTGTCGTCCCTCGTGTTACTACAG。
[0070] (2)人IL-33的基因片段(未含起始密码子ATG，含有终止密码子TAA)克隆自Human IL33 Gene cDNA。克隆所需的引物（5'-3'）如下：SEQ ID腸.11所示的正向引物卩2: AAACCTAAAATGAAATATTCGACTAACAAAATTAGTACCGCG; SEQ ID N0· 12所示的反向引物R2:
[0071 ] TTATGTCTCGGATAGCTTGAAGAGAATGTTTTCGG。
[0072] (3)通过PCR反应得到编码p75NTR-ECD-Linker的基因片段，其中p75NTR-ECD的羧 基端与Linker的氨基端连接，Linker的基因片段来自PCR反应的反向引物(R3)序列；PCR反 应的引物序列(5'_3'）为：
[0073] SEQ ID从).13所示的正向引物卩3:
[0074] CGCGGTACCATGGGTGCAGGGGCGACC
[0075] Κρη頂每切位点
[0076] SEQ ID从).14所示的反向引物1?3:
[0077] GCTCCCACCTCCGCCTGAGCCCCCGCCACCGCTACCACCGCCCCCGTT
[0078] Linker核苷酸序列
[0079] GTCTGTCGTCCCTCGTG。
[0080] (4)通过重叠 PCR反应将p75NTR-ECD-Linker的羧基端与IL-33的氨基端连接， p75NTR-ECD-Linker基因片段的5'端带有ΚρηΙ酶切位点，IL-33基因片段的3'端带有Xbal酶 切位点。重叠 PCR反应的两对引物序列(5 ' -3 '）为：
[0081] 正向引物F4(同SEQ ID N0.13所示的正向引物F3): CGCGGTACCATGGGTGCAGGGGCGACC
[0082] Κρη頂每切位点
[0083] SEQ ID从).15所示的反向引物尺4:
[0084] CGCGGTACTAATTTTGTTAGTCGAATATTTCATTTTAGGTTTGCTCAGGC
[0085] IL-33基因片段负链3'端序列
[0086] GGAGGTGGGAGC
[0087] p75NTR-ECD-Linker基因片段负链5 '端序列
[0088] SEQ ID从).16所示的正向引物卩5:
[0089] GCTCCCACCTCCGCCTGAGCAAACCTAAAATGAAATATTCGACTAACA [0090] p75NTR-ECD-Linker基因片段正链3，端序列
[0091 ] AAATTAGTACCGCG
[0092] IL-33基因片段正链5'端序列
[0093] SEQ ID从).17所示的反向引物尺5:
[0094] ACGTCTAGATTATGTCTCGGATAGCTTGAAGAGAATGTTTTCGG
[0095] Xba頂每切位点
[0096] (5)将重叠 PCR目标产物（即融合蛋白p75NTR-ECD-IL-33的基因片段，其IL-33基因 片段末端带有终止密码子TAA)经ΚρηΙ和Xbal酶切后后插入pcDNA3.1( + )的ΚρηΙ和Xbal酶切 位点之间。转化宿主菌DH5a(由ThermoFisher公司提供），提取阳性质粒，对插入的目的基因 进行测序，确定目的基因序列的正确性，最后获得含有编码P75NTR-E⑶-IL-33目的基因的 重组 pcDNA3.1( + )质粒 Vp75NTR-ECD-IL-33。
[0097] 通过DNA质粒载体可以制备得到mRNA和病毒载体。在一个优选的实施方式中，上述 得到的质粒Vp75NTR-ECD-IL-33经过Xbal、或Drall、或Apal、或Pmel单酶切线性化后，经体 外转录（例如可以使用mRNA转录试剂盒（Amb i ο η的mME S S AGE mMACH丨ΝΕΚΠΓ7 Transcription Kit，AM1344))可以得到编码p75NTR-ECD-IL-33的mRNA。质粒Vp75NTR-ECD-IL-33也可用于制备表达p75NTR-ECD-IL-33的病毒载体(包括慢病毒(Lentivirus)，腺病毒 (adenovirus)，腺相关病毒（adeno-associated virus)等）。
[0098] 本发明还提供一种目标蛋白的制备方法，所述目标蛋白为人P75NTR的胞外域 P75NTR-ECD、人IL-33或所述的融合蛋白p5NTR-ECD-IL-33中的一种。在优选的实施例中，目 标蛋白的制备方法包括如下步骤：
[0099] (1)用于制备p75NTR-ECD、IL-33和p75NTR-ECD-IL-33的表达质粒的构建和制备： 为了方便提取和纯化目标蛋白，分别在p75NTR-ECD、IL-33和p75NTR-ECD-IL-33的氨基端连 接Flag标签（优选的，本例中采用的Flag标签的氨基酸序列如SEQ ID N0.18所示： AspTyrLysAspAspAspAspLys，核苷酉爱序列如SEQ ID Ν0· 19 所不： GATTACAAAGATGACGATGATAAA;或者在其他优选实施例中，还可以选择Flag标签的氨基酸序 列如SEQ ID N0.20所不：AspTyrLysAspHisAspGlyAspTyrLysAspHisAspIleAspTyrLysAspAs pAspAspLys，核苷酸序列如SEQ ID N0.21所示：
[0100] GACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAG)， 分别获得都带有 Flag 标签的 p75NTR-ECD(PCR 技术）、IL-33(PCR 技术）和 p75NTR-ECD-IL-33 (重叠 PCR技术）的表达质粒：质粒VFlag-p75NTR-ECD，质粒VFlag-IL-33和质粒VFlag-P75NTR-E⑶-IL-33;也即以目标蛋白的基因片段为模板，以一质粒载体为载体，以该质粒载 体的两个酶切位点为目的基因的插入位点，在目标蛋白的氨基端连接Flag标签，若目标蛋 白为人P75NTR的胞外域p75NTR-ECD或人IL-33，则采用PCR反应相应获得带有Flag标签的目 标蛋白的表达质粒：质粒VFlag-p75NTR-ECD或质粒VFlag-IL-33 ;若目标蛋白为融合蛋白 P5NTR-ECD-IL-33，则采用重叠 PCR反应获得带有Flag标签的p75NTR-ECD-IL-33的表达质 粒:质粒VFlag-p75NTR-ECD-IL-33。在本例中，选择pcDNA3.1( + )为载体，以ΚρηΙ和Xbal酶切 位点为目的基因的插入位点，分别如下：
[0101] a、制备质粒 VFlag-p75NTR-ECD-IL-33 时，按构建和制备质粒 Vp75NTR-ECD-IL-33 的方法获得，其中两个正向引物更换如下：
[0102] P75NTR-ECD的基因片段克隆时的正向引物F1换成F6(如SEQ ID从).22所示）：
[0103] ATGGATTACAAAGATGACGATGATAAAGGTGCAGGGGCGACCGGT [0104] Flag标签正链5'端序列
[0105] 重叠 PCR的正向引物F4换成F7(如SEQ ID从).23所示）：
[0106] CGCGGTACCATGGATTACAAAGATGACGATGATAAAGGTGCAGG [0107] Κρη頂每切位点Flag标签序列
[0108] b、制备质粒V Flag-p75NTR-ECD时，PCR引物为：
[0109] 正向引物F8(如SEQ ID从).24所示）：
[0110] CGCGGTACCATGGATTACAAAGATGACGATGATAAAGGTGCAGGGGCG
[0111] Κρη頂每切位点Flag标签序列
[0112] ACCGGT
[0113] p75NTR-ECD基因正链5'端序列
[0114] 反向引物R8(如SEQ ID从).25所示）：
[0115] ACGTCTAGATTAGTTGTCTGTCGTCCCTCGTGTTACTACAG
[0116] Xba頂每切位点p75NTR-ECD基因负链5'端序列
[0117] c、制备质粒V Flag-IL-33时，PCR引物为：
[0118] 正向引物F9(如SEQ ID从).26所示）：
[0119] CGCGGTACCATGGATTACAAAGATGACGATGATAAAAAACCTAAAAT [0120] Κρη頂每切位点Flag标签序列
[0121] GAAATATTCGACTAACAAAATTAGTACCGCG
[0122] IL-33基因片段正链5'端序列
[0123] 反向引物R9(如SEQ ID从).27所示）：
[0124] ACGTCTAGATTATGTCTCGGATAGCTTGAAGAGAATGTTTTCGG
[0125] Xba頂每切位点IL-33基因片段负链5'端序列
[0126] (2)将表达质粒转染真核细胞获得表达目标蛋白的稳定细胞系。优选采用哺乳动 物细胞，本例中更优选采用人HEK-293细胞，具体：
[0127] HEK-293 细胞用含 10%(v/v)FBS(Gibco)，100μg/ml 青霉素，100μg/ml 链霉素的 DMEM(Gibco)完全培养基，置于37 °C，5 % (体积分数)C02的培养箱培养。当细胞长到80 %满 时进行细胞传代。做质粒转染前，将HEK-293细胞植于60-mm细胞培养皿，用含10%(v/v)FBS (Gibco)的DMEM(Gibco)培养基培养，第二天，当细胞长到80%满时用于质粒转染。转染时， 分别将 8 · Oyg 质粒 VFlag-p75NTR-ECD、质粒 VFlag-IL-33 和质粒 VFlag-p75NTR-ECD-IL-33 用 0卩1:;[-]\^]\1(6;[13(30)稀释至0.51111并轻柔揽勾为稀释液4。将2(^11^。0€6(^&111；[1162000 (1]1￥；[1：1'08611)用(^1:;[-]\^1[(6;[1300)稀释至0.51111并轻柔搅勾为稀释液13，在室温下（20-25 <€， 本例中的室温为25°C，下同）孵育5分钟。将稀释液A和稀释液B混合并轻柔搅匀为脂质体转 染混合液，在室温下放置20分钟。将脂质体转染混合液均匀加入60-_细胞培养皿内的培养 基内并轻柔混匀。细胞继续培养24小时后，将培养基更换为含10% (v/v)FBS(GibC0)，100μ g/ml青霉素，100μg/ml链霉素，500μg/ml硫酸新霉素(Clontech)的DMEM(Gibco)筛选培养基 继续进行筛选培养。每隔3天换一次筛选培养基，每隔6天细胞传代一次，3周后收集细胞，其 中部分细胞用含5%(v/v)二甲基亚砜(Sigma-Aldrich)的完全培养基混匀置于液氮罐中保 存分别作为表达 P75NTR-ECD、IL-33 和 p75NTR-ECD-IL-33 的稳定细胞系 CLp75NTR-ECD，CL IL-33和CLp75NTR-ECD-IL-33，剩余细胞分别用于目标蛋白 p75NTR-ECD、IL-33和p75NTR-ECD-IL-33的提取和纯化。
[0128] (3)从稳定表达目标蛋白的细胞中提取和初步纯化目标蛋白得到目标蛋白粗溶 液。本例中，具体为：使用S i g m a - A1 d r i c h提供的提取和纯化带有F1 a g标签蛋白的试剂盒 ANTI-FLAG￡M2Affinity Gel(Sigma-Aldrich，A2220)从稳定表达目标蛋白的细胞中提 取和纯化目标蛋白p75NTR-ECD、IL-33和p75NTR-ECD-IL-33。按产品说明书的操作程序进行 操作。用含有每lml裂解液ΙΟμΙ蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich，P8340)的CelLytic Μ细胞裂 解液(Sigma-Aldrich，C2978)裂解所收集的细胞，收集裂解上清液。用抗Flag抗体M2的亲和 树脂(ANTI-FLAG M2affinity resin)填充层析柱制备亲和层析柱，用平衡液预平衡层析 柱。将裂解上清液上柱，用10-20倍层析柱体积的TBS缓冲液(50mM Tris HCl，with 150mM NaCl，pH 7.4)洗层析柱将非目标蛋白洗脱掉。用pH 3.5的0.1M甘氨酸盐酸溶液将目标蛋白 洗脱进预先装有15_25μ1 pH 8.0的1M Tris缓冲液的预冷冻的小管内分别获得p75NTR-ECD、IL-33和p75NTR-ECD-IL-33的目标蛋白粗溶液。取小量样品测定蛋白质含量。将目标蛋 白粗溶液直接用于进一步纯化或者置于_70°C冷柜冻存备用。
[0129] (4)从目标蛋白粗溶液中去除Flag标签获取纯化的目标蛋白。本例中，具体为:使 用 Sigma-Aldrich 提供的重组牛肠肠激酶 Enterokinase(Sigma_Aldrich，E4906)酶切去除 目标蛋白p75NTR-ECD、IL-33和p75NTR-ECD-IL-33的氨基端的Flag标签。将目标蛋白粗溶液 用含有500mM Tris-HCl，pH 8.0,2.0mM CaCl2和l%(v/v)TWEEN20的溶液调至浓度为 1.5mg/ml，pH值7.0-8.0作为反应溶液，再加入0.02单位/mg融合蛋白的肠激酶并混匀，于室 温下放置16小时。反应结束后，使用Sigma-Aldrich提供的去除肠激酶试剂盒ENTER0KINASE REMOVAL KIT(Sigma-Aldrich，PRK-E)将反应混合物中的肠激酶去除掉，获得纯化的目标蛋 白p75NTR-ECD、IL-33和p75NTR-ECD-IL-33的溶液。取少量的样品测定蛋白质含量和纯度。 将目标蛋白溶液分装并置于_70°C冷柜或者液氮罐冻存。
[0130] -、目标蛋白的鉴定如下：
[0131] 1、N-末端氨基酸序列的测定：将目标蛋白p75NTR-ECD、IL-33和p75NTR-ECD-IL-33 经SDS-PAGE电泳转移至PVDF膜上，用岛津PPSQ-31A蛋白自动测序仪对目标蛋白N-末端氨基 酸序列进行测定。测定结果显示，目标蛋白P75NTR-ECD N-末端氨基酸序列测定结果为： GlyAlaGlyAlaThrGlyArg，序列与天然蛋白人p75NTR-ECD的N-末端氨基酸序列相同。目标蛋 白IL-33的N-末端氨基酸序列测定结果为:LysProLysMetLysTyrSer，序列与天然蛋白IL-33 的N-末端氨基酸序列相同。目标蛋白p75NTR-ECD-IL-33的N-末端氨基酸序列测定结果为： GlyAlaGlyAlaThrGlyArg，序列与融合蛋白p75NTR-ECD-IL-33的N-末端氨基酸序列相同。
[0132] 2、Western Blot的免疫鉴定：将目标蛋白p75NTR-ECD、IL-33和p75NTR-ECD-IL-33 经SDS-PAGE电泳转移至PVDF膜上，用特异性识别p75NTR-ECD的抗体Anti-p75NGF Receptor antibody [NGFR5]-N_terminal (由 Abeam 提供，ab 192774)和特异性识别 IL-33 抗体 Anti-IL33antibody (由Abeam提供，ab83873)做免疫印记鉴定。测定结果显示，Anti_p75NGF Receptor antibody抗体特异性识别目标蛋白p75NTR-ECD和p75NTR-ECD-IL-33，Anti-IL33antibody抗体特异性识别目标蛋白IL-33和p75NTR-ECD-IL-33。结果如图3所示。
[0133] 二、目标蛋白p75NTR-ECD-IL-33体外稳定性测定：
[0134] 差示扫描量热法(DSC)是一种用于直接鉴定蛋白质生物分子在自然状态下的稳定 性的技术，溶液中的蛋白质生物分子在其自然(折叠)和变性(展开)构象之间保持平衡，其 热跃迀中点（Tm)越高，分子就越稳定。将目标蛋白p75NTR-ECD、IL-33和p75NTR-ECD-IL-33 通过差示扫描量热仪MicroCal VP-Capillary DSC系统进行测定其Tm值。测得：目标蛋白 P75NTR-ECD-IL-33的Tm值为78 · 0 °C，蛋白 p75NTR-ECD的Tm值为66 · 0 °C，蛋白 IL-33的Tm值为 56.0°C。测定结果显示，重组融合蛋白p75NTR-ECD-IL-33能显著提高蛋白p75NTR-ECD和IL- 33的稳定性。结果如图4所不。
[0135] 三、目标蛋白p75NTR-ECD-IL-33体内稳定性测定：
[0136] 目标蛋白p75NTR-ECD-IL-33体内稳定性测定通过测定外源蛋白P75NTR-ECD-IL-33在体内的半衰期来实现。取AD小鼠20只，其中5只为空白对照组，5只为p75NTR-E⑶组(腹 膜内注射300ng p75NTR-ECD)，5只为IL-33组（腹膜内注射300ng IL-33)，5只为p75NTR-ECD-IL-33组（腹膜内注射300ng p75NTR-ECD-IL-33)。在小鼠注射样品2、4、6、8、12、16、20、 24小时后分别通过尾静脉取静脉血，用Biosensis公司的ILISA试剂盒NGFR/p75ECD RapidTM enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)Kit(Biosensis，BEK-2219-1P)测 定 P75NTR-ECD 和 p75NTR-ECD-IL-33 的血液浓度，用 Boster 公司的 ILISA 试剂盒他11^1111^-33PicoKine? ELISA 1(^(8〇8七6141(0929)测定11^-33和口75犯1?4〇)-11^-33的血液浓度。计 算 p75NTR-ECD、IL-33 和 p75NTR-ECD-IL-33 的半衰期。测得:p75NTR-ECD 的半衰期为 8 小时， IL-33的半衰期为6小时，p75NTR-ECD-IL-33的半衰期为18小时。测定结果显示，重组蛋白 P75NTR-ECD-IL-33显著地提高p75NTR-ECD和IL-33在体内的稳定性。结果如图5所示。
[0137] 四、目标蛋白p75NTR-ECD-IL-33防治AD的生物学功能活性测定：
[0138] 目标蛋白p75NTR-ECD-IL-33体内生物学功能测定通过测定外源蛋白p75NTR-ECD-IL-33在体内促进机体降低Αβ的分泌和促进如的降解来实现。取AD小鼠20只，其中5只为空 白对照组，5只为p75NTR-ECD组(连续3天，每天腹膜内注射300ng p75NTR-ECD)，5只为IL-33 组(连续3天，每天腹膜内注射300ng IL-33)，5只为p75NTR-ECD-IL-33组(连续3天，每天于 腹膜内注射300ng p75NTR-E⑶-IL-33)。在小鼠开始注射样品1周后分别取尾静脉血和大脑 皮层。大脑皮层用干冰速冻，然后用含有蛋白酶抑制剂的匀浆缓冲液(250mM蔗糖，20mM pH 7.4Tris-HCl，ImM EDTA和ImM EGTA)和杜恩斯匀浆器匀浆，使用二乙胺提取可溶性Αβ。静脉 血和可溶性Αβ溶液用Thermo Fisher公司提供的ILISA试剂盒Amyloid beta 42ELISA Kit, Mouse(Novex，KMB3441)测定Αβ1-42的血液和大脑皮层中的含量。测定结果显示，相对于 P75NTR-ECD和IL-33,使用重组融合蛋白p75NTR-ECD-IL-33更显著地促进Αβ在体内的降解 和清除。重组融合蛋白 P75NTR-ECD-IL-33 融合 p75NTR-ECD 和 IL-33 后对 p75NTR-ECD 和 IL-33 在防治AD方面的生物学功能活性具有显著协同和促进作用。结果如图6和图7所示。
[0139] 本发明还提供一种以上各实施方式中所述的融合蛋白在制备防治阿尔茨海默病 的药物中的应用以及用于防治阿尔茨海默病的药物;所述药物可以为以上各实施方式中所 述的融合蛋白本身，或者表达所述的融合蛋白的mRNA脂质体，或者携带表达所述的融合蛋 白基因的病毒载体。所述药物的临床使用方法可以为:可经腹膜内、静脉或者脑内直接注射 重组融合蛋白P75NTR-ECD-IL-33，或者可经静脉或者脑内施用表达融合蛋白p75NTR-ECD-IL-33的mRNA脂质体或者携带p75NTR-ECD-IL-33基因的病毒载体（包括慢病毒 (Lentivirus)，腺病毒(adenovirus)，腺相关病毒(adeno-associated virus)等）。
[0140] 通过上述实验和测定，本发明实施例中得到的p75NTR-E⑶-IL-33的优点包括：
[0141] (l)p75NTR-ECD-IL-33 同时具有 p75NTR-ECD 和 IL-33 两者的生物学功能。p75NTR-ECD-IL-33中的p75NTR-ECD能与Αβ及其聚合体结合，阻止p75NTR与Αβ及其聚合体结合，保护 中枢神经元免受Αβ的神经毒性的损害。p75NTR-ECD-IL-33中的IL-33能诱导机体降低Αβ的 分泌和促进仙的降解，防止AD的发生和阻止AD病情的进展和恶化。
[0142] (2)p75NTR-ECD-IL-33是融合蛋白，能有效提高和延长其中包含的p75NTR-ECD和 IL-33在体内外的稳定性和半衰期。
[0143] (3)p75NTR-ECD-IL-33能使其中包含的p75NTR-ECD和IL-33在防止和治疗AD方面 发挥协同作用，P75NTR-ECD-IL-33通过p75NTR-ECD结合Αβ使IL-33对Αβ具有精准的靶向性， 使IL-33在Αβ及其寡聚体周围诱导机体直接内吞或者产生Αβ降解酶降解Αβ，从而提高机体 对Αβ的降解效率。结果，使p75NTR-ECD-IL-33融合蛋白的生物学活性较p75NTR-ECD和IL-33 单体大幅度提高。
[0144] (4)p75NTR-ECD-IL-33被构建成在真核细胞系和在人体内表达，使p75NTR-ECD-IL-33中的p75NTR-E⑶和IL-33在翻译后得到充分的糖基化修饰因而保持原有的理化性质 和生理状态下的生物学功能。
[0145] (5)?75阶1?40)-几-33消除了？75阶1?40)4(：中的？(：的免疫原性和抗体依赖性细 胞介导的细胞毒作用(ADCC)，所以p75NTR-ECD-IL-33可以作为预防和治疗AD的安全有效药 物。
[0146] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应 当视为属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于防治阿尔茨海默病的融合蛋白，其特征在于，包括人P75NTR的胞外域 P75NTR-ECD、人IL-33以及分别连接所述p75NTR-ECD的羧基端和所述人IL-33的氨基端的连 接肽;所述p75NTR-ECD的氨基酸序列如SEQIDN0.1所示，核苷酸序列如SEQIDN0.2所示 ； 所述人IL-33的氨基酸序列如SEQIDN0.3所示，核苷酸序列如SEQIDN0.4所示。2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于:所述连接肽为柔性连接肽， 所述柔性连接肽的氨基酸序列为(Gly Gly Gly Gly Y)n，其中，η为1~6之间的整数，Y 表示Ser或者Thr;优选地:所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;相应地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO .8所示。3. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于:所述连接肽为刚性连接肽，所述刚性连 接肽为(Glu Ala Ala Ala Lys)m，其中，m为1~6之间的整数;或者所述刚性连接肽为富含 脯氨酸序列(X Pro)q，其中q为3~10之间的整数，X为任意氨基酸，其中，X优选赖氨酸、丙氨 酸或者谷氨酸中的任一种。4. 一种权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白的构建方法，其特征在于：包括将人 P75NTR的细胞外域p75NTR-ECD的羧基端和人IL-33的氨基端通过连接肽连接起来的步骤， 所述人P75NTR的细胞外域p75NTR-E⑶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述人IL-33的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4 所示。5. -种权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白的表达载体，其特征在于:所述表达载体 以mRNA，DNA质粒载体或病毒载体中的一种作为载体。6. -种权利要求1 -3任意一项所述的融合蛋白的DNA质粒载体的制备方法，其特征在 于，包括如下步骤： (1) 克隆得到人P75NTR的细胞外域p75NTR-E⑶的基因片段； (2) 克隆得到人IL-33的基因片段； (3) 通过PCR反应得到编码p75NTR-ECD-Linker的基因片段，其中p75NTR-ECD的羧基端 与Linker的氨基端连接，所述Linker的基因片段来自PCR反应的反向引物序列； (4) 通过重叠 PCR反应将p75NTR-ECD-Linker的羧基端与人IL-33的氨基端连接，获得融 合蛋白P75NTR-ECD-IL-33的基因片段，其中，p75NTR-ECD-Linker基因片段的5 '端带有一酶 切位点，IL-33基因片段的3'端带有另一酶切位点； (5) 将融合蛋白P75NTR-E⑶-IL-33的基因片段通过酶切后插入一质粒载体中两个相应 的酶切位点之间，转化宿主菌，提取阳性质粒，对插入的目的基因进行测序，获得含有编码 P75NTR-ECD-IL-33目的基因的DNA质粒载体； 或者，步骤(3)和(4)可以分别用(3'）和(4'）替换： (3'）通过PCR反应得到编码IL-33-Linker的基因片段，其中IL-33的氨基端与Linker的 羧基端连接，所述Linker的基因片段来自PCR反应的反向引物序列； (4'）通过重叠 PCR反应将IL-33-Linker的氨基端与人p75NTR-ECD的羧基端连接，获得 融合蛋白P75NTR-ECD-IL-33的基因片段，其中，IL-33-Linker基因片段的5'端带有一酶切 位点，P75NTR-E⑶基因片段的3'端带有另一酶切位点。7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于:选择pcDNA3.1 ( + )作为所述步骤(5)中的 质粒载体;所述融合蛋白P75NTR-ECD-IL-33的基因片段插入pcDNA3.1( + )的ΚρηΙ和Xbal酶 切位点之间。8. -种目标蛋白的制备方法，其特征在于:所述目标蛋白为人p75NTR的胞外域p75NTR-ECD、人IL-33或权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白p5NTR-ECD-IL-33中的一种;包括如 下步骤： (1)以目标蛋白的基因片段为模板，以一质粒载体为载体，以该质粒载体的两个酶切位 点为目的基因的插入位点，在目标蛋白的氣基端连接Flag标签，若目标蛋白为人p75NTR的 胞外域P75NTR-ECD或人IL-33,则采用PCR反应相应获得带有Flag标签的目标蛋白的表达质 粒:质粒VFlag-p75NTR-ECD或质粒VFlag-IL-33;若目标蛋白为融合蛋白p5NTR-ECD-IL-33， 则采用重叠 PCR反应获得带有Flag标签的p75NTR-ECD-IL-33的表达质粒：质粒V Flag-P75NTR-E⑶-IL-33; (2)将表达质粒转染真核细胞获得表达目标蛋白的稳定细胞系； (3) 从稳定表达目标蛋白的细胞中提取和初步纯化目标蛋白得到目标蛋白粗溶液； (4) 从目标蛋白粗溶液中去除Flag标签获取纯化的目标蛋白； 优选所述质粒载体为pcDNA3.1 ( + )，以ΚρηΙ和Xbal酶切位点为目的基因的插入位点； 优选所述真核细胞为哺乳动物细胞;进一步优选所述哺乳动物细胞为人HEK-293细胞； 优选所述Flag标签的氨基酸序列如SEQ ID NO. 18所示，核苷酸序列SEQ ID NO. 19所 示;或优选所述Flag标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，核苷酸序列SEQ ID NO.21所 不。9. 一种权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白或由权利要求6制备得到的融合蛋白的 DNA质粒载体在制备防治阿尔茨海默病的药物中的应用。10. -种用于防治阿尔茨海默病的药物，其特征在于:所述药物为权利要求1-3任意一 项所述的融合蛋白，或者表达权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白的mRNA脂质体，或者携 带表达权利要求1-3任意一项所述的融合蛋白基因的病毒载体。
【文档编号】C12N15/85GK106046171SQ201610365327
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】麦俊波
【申请人】深圳麦迪科生物技术有限公司