专利名称:一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白的高效表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，具体地说是涉及新型抗凝溶栓双功能融合蛋白——7jC 蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的高效表达。
背景技术：
本发明高效表达的对象是水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p_rPA)，该融合蛋白是通过一个(Gly)3柔性肽基团将重组水蛭素ΠΙ的C末端12肽与rPA基因融合而成的一种同时具有抗凝溶栓双功能的全新蛋白(吴梧桐，余蓉，等溶栓和抗凝双功能融合蛋白、 制备方法及其应，中国专利公开号CN1970574)。该蛋白通过目前最常用的表达系统一大肠杆菌进行表达(余蓉等抗凝、溶栓双功能水蛭素12肽一瑞替普酶融合蛋白的模拟、构建与表达，药物生物技术2007，14 (3) :168-172)。
溶栓药物瑞替普酶(ret印lase，r-PA)是人组织纤溶酶原激活剂(t_PA)的缺失变异体，它是在t-PA分子原结构的基础上，删除了其中的kringle I,Finger,EGF 3个结构域的单链非糖基化蛋白，分子量为39 kDa，含有9对二硫键，为第三代溶栓药物。r-PA起效快，药效强，出血等副作用小。水蛭素是迄今作用最强的特异性凝血酶抑制剂，具有很强的抗凝、抗栓活性，其抗血栓性能优于肝素，对多种血栓疾病具有预防和治疗效果。目前研究已确认，水蛭素从10肽开始具有抗凝活性，以12肽为具有最大活性的最小肽段。水蛭素 12肽其较小的分子量相对于水蛭素全长蛋白来说更有利于减小抗原性的副作用和影响。
由这两者融合而成的新型抗凝溶栓双功能蛋白，具有更长的作用半衰期，方便患者使用，且能有更高选择性地作用于血栓部位、和全身出血性副作用小等特点，作用更为肯定可靠，而其较小的分子量更有利于减小抗原性的副作用和影响。它可以在大肠杆菌中进行表达，但在本发明的优化之前，该融合蛋白在大肠杆菌中表达水平很低，约占全菌总蛋白的12%。经过本发明的优化后，其表达量提高到约四％。本发明的关键是在培养基中添加了钙、镁两种微量元素并且通过摇床转速来控制通风量。事实证明，这两个因素对提高表达量具有显著的影响。大肠杆菌表达体系高效、经济，可用高密度发酵工艺进行大规模培养，因而降低了成本。
发明内容
本发明针对的对象是一种全新的抗凝溶栓双功能融合蛋白——瑞替普酶-水蛭素 12肽融合蛋白(HV12p-rPA)，在大肠杆菌中表达的该融合蛋白，其表达水平的高低直接影响后续的研究及其产业化的进展。本专利针对这些问题，公开了一种高效表达该融合蛋白的方法。
高效表达方法如下
以1%的接种量，将甘油(15%)管保存的菌种接种至新鲜含Am (lOOug/ml)的LB液体培养基中37°C培养12h，使菌种得到活化。再将此活化的菌液转接至蒸馏水配制的LB培养基(含Amp浓度为100ug/ml)中，按照5%的接种量加入菌种，37 °C，200r/min恒温培养3h后， 加入诱导剂IPTG使终浓度为lmmol/L，再以200r/min，39°C恒温诱导4h，结束后，收菌，即 4°C下以8 000r/min离心3min，所得菌体沉淀以PBS (pH7. 4)吹勻洗涤一次后，同条件离心得菌体，可获得高效表达的水蛭素12肽与r-PA融合蛋白，表达量约占总蛋白四％。
其中优化方案如下
采用正交法，选取摇瓶培养条件中七个主要因素进行两水平正交优化实验。该七个因素为培养基的配制、接种量、诱导时间、转速、诱导温度、补料方式、微量元素。借助SDS-PAGE和Bandscan凝胶分析软件，获得该融合蛋白在菌体总蛋白中的表达量百分数，作为考察条件优化的目标量。选用 、(27)安排，进行八次实验，对实验结果进行分析，通过极差分析，显示出微量元素钙、镁的
添加以及摇床转速(即通风量)对表达量结果影响最大。其他因素则是综合发酵工艺的简便以及节约资源的角度来选取。
本发明是通过控制通风量和添加微量元素来提高水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的表达水平，使其表达量提高到约四％。该方法的优点在于方法简便、易行，提高产量， 但不提高成本。大大节省了时间、人力、物力和财力。无论对于实验室规模或商业化生产均有较好的应用价值。
图中 1 为中分子量 marker (6 —10 分别表示 97. 4KD、66. 2KD、42. 7KD、31. 0KD、 14. 4KD) ；2-4分别为三次平行实验包涵体表达量；11代表融合蛋白。
具体实施方式
实施例一
①保种取牛奶冻干管中的HrP/BL21表达工程菌，以LB液体培养基配成溶液后，在LB 固体培养基(含lOOug/mL Amp)平板上涂布，37°C培养过夜，挑取平板上菌落接种至LB液体培养基(含100ug/mL Amp)，37°C，200r/min振摇过夜。以15%的甘油保存于_20°C冰箱中备用。
②摇瓶发酵以1%的接种量，将甘油(15%)管保存的菌种接种至新鲜含Amp (lOOug/ml)的LB液体培养基中37°C培养12h，使菌种得到活化。再将此活化的菌液按5%的接种量转接至摇瓶中，摇瓶内为蒸馏水配制的LB培养基，其中含AmplOOug/mLCi^ lmmol/
L、M g 20mmol/L继续培养3h后，加IPTG (lmmol/L)作为诱导剂，39°C下，200r/min诱导 4h。
③收菌诱导结束后，收菌，即4°C下以8 OOOr/min离心;3min，所得菌体沉淀以 PBS (pH7. 4)吹勻洗涤一次后，同条件离心得菌体。
④菌体的破碎以Tris-Cl CpH 8. 0)重悬菌体，250W，kX 10s，冰浴超声累计 5min, 12 000r/min, 4°C离心 20min 得包涵体，_20°C保存。[0017]实施例二
吸取超声裂解后的溶液(未离心)IOOul到EP管中，加入IOOul IXSDS的上样缓冲液。 煮沸3-5分钟后，每个电泳样品各加20ul做SDS-PAGE，以考马斯亮蓝G-25染色6h，脱色后进行扫描，再以bandscan 3. 0软件计算目的蛋白在菌体总蛋白中的表达量。
采用该条件做三次平行试验，结果表达量分别为28. 3%,26. 5%,31. 1% 平均表达量为28. 6%，其SDS-PAGE结果如附图。
权利要求
1.一种高效表达水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的方法，其特征在于 优化表达该融合蛋白的大肠杆菌的培养条件(培养基组成、接种量、诱导时间、摇床转速即通风量、诱导温度和微量元素)，建立了一套使表达量提到高30%的培养条件，即在蒸馏水配制的LB培养基(含Amp浓度为100ug/ml)中，按照5%的接种量加入菌种，37°C，200r/min 恒温培养汕后，加入诱导剂IPTG使终浓度为lmmol/L，再以200r/min，39°C恒温诱导4h， 可获得表达量约为四％的水蛭素12肽与r-PA融合蛋白。
2.按照权利要求
1所述新型双功能HV12p-rPA融合蛋白高效表达方法，其特征在于 表达对象为全新的水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)，其表达形式为包涵体蛋白。
3.按照权利要求
1所述新型双功能融合蛋白(HV12p-rPA)高效表达方法，其特征在于 培养基组成为LB培养基，其中添加了微量元素Ca2+、Mg2+浓度分别为lmmol/L和20mmol/L。
4.按照权利要求
1所述新型双功能融合蛋白(HV12p-rPA)高效表达方法，其特征在于 接种量为5%，诱导时间为4h，摇床转速为200r/min，诱导温度为39°C，诱导剂为IPTG，其浓度为 lmmol/L。
专利摘要
本发明属于生物制药领域，具体涉及到一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白——水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的高效表达。高效表达法通过优化表达HV12p-rPA蛋白的大肠杆菌的7个培养条件，证明摇床转速即通风量和微量元素对表达量提高有显著影响，使其提高到约29%。本方法简单、易行、高效，不提高成本，对实验室规模或商业化生产均有较好应用价值。
文档编号C12R1/19GKCN102250992SQ201110141067
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月30日
发明者余蓉, 杨继虞, 梁兰 申请人:四川大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan