专利名称:用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对、探针、以及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于病毒检测领域，涉及一种用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对、探针、以及试剂盒。本发明还涉及一种检测猪瘟病毒野毒株的方法以及所述的引物对、探针、或试剂盒在检测猪瘟病毒野毒株中的用途。
背景技术：
猪痕(ClassicalSwine Fever, CSF)是由猪痕病毒(Classical Swine FeverVirus, CSFV)引起的猪的高度致死性、接触性传染病，在世界上许多国家和地区均有发生，国际兽疫局将其定为A类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病，给各国养猪业造成巨大的经济损失。我国政府一直都很重视猪瘟的防制工作，并对猪进行猪瘟兔化弱毒疫苗免疫，但随着猪瘟HCLV疫苗的广泛使用，又由于近年来我国猪瘟的流行特点以散发、慢性猪瘟、持续感染和亚临床症状为主，同时存在着与其它病混合感染的状况，因此对其诊断非常困难。目前尚没有简单快速试剂盒能够检测猪瘟病毒野毒株(除猪瘟疫苗株之外的猪瘟病毒株)感染。
实时荧光定量PCR(FQ_PCR，又称为实时荧光RT-PCR)技术包括探针法、染料法和引物法。探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，以Taqman探针为代表，常用的荧光报告基团是FAM、VIC、JOE、HEX等；染料法是采用一种能够与双链DNA小沟结合的荧光染料，荧光信号强弱与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号换算出PCR反应中的双链DNA数量，常用的染料是SYBR green ;引物法是利用荧光标记的引物实现定量，目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记，在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭，在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。
在荧光定量检测中较常用的是Taqman探针法，根据其3’端标记的荧光淬灭基团的不同又可分为常规Taqm an探针和Taqman-MGB探针两种。常规的Taqman探针5 ’端标以荧光发射基团，3’端标以荧光淬灭基团，该探针在PCR过程中不能被延伸。当探针保持完整时，3’端淬灭基团抑制5’发射基团的荧光发射。在PCR的退火期，探针与引物所含序列内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引物在Taq酶作用下延伸，当到探针处，Taq酶发挥5’ _3’外切核酸酶活性，继而发生置换。切断探针后，发光基团远离淬灭基团，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统便会检测到光密度有所增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，并伴有一个荧光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产物较短时效率较高，故扩增长度一般为50-150bp。
Taqman-MGB探针与普通Taqman水解探针不同之处在于Taqman-MGB探针的3’端连接一个不发光的淬灭基团，同时另增加一个小沟结合物(minor groove binder, MGB)分子，比Taqman探针有三大优势一是显著提高Tm值，可以减少探针设计长度，对AT富含区的探针设计更为有利；二是可以降低背景荧光信号，提高信噪比，使实验结果更精确，分辨率更高；三是提高探针和互补模板的结合特异性，即使一个碱基的不匹配都能精确分辨。
目前检测猪瘟病毒的病原学诊断技术有病毒分离法、免疫荧光技术、兔体交互免疫试验、ELISA抗原捕获、RT-PCR技术和实验动物法等。以上几种方法及其不太成熟的试剂盒通常存在灵敏度低、特异性差、耗时、无法区分免疫群与感染群等诸多问题，不能为我国快速、有效地监控猪瘟疫情提供强有力的技术支持。
公开号为CN101328506A和CN101812539A的专利申请公开了检测猪瘟病毒的试剂盒。但是检测的敏感性有待于进一步提高。此外，CN101328506A中公开的试剂盒生产成本高并且操作繁琐。
因此，亟需一种敏感性高、特异性强、并且快速简便的检测“猪瘟病毒野毒株”的产品和方法。
发明内容
本发明人经过创造性的劳动和大量的试验，得到了能够用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对和探针，并且惊奇地发现，所述引物对和探针检测猪瘟病毒野毒株的特异性强、灵敏度高。由此提供了下述发明
本发明的一个方面涉及一种引物对(包含两条引物)，其中一条引物包含SEQ IDNO :5所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，所述的引物对，其中，一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :10所示。在本发明的一个实施方案中，所述引物对由两条引物组成，其中，一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 10 所示。
5，-AACTGGGCTAGCCATGCCCACAGT-3，(CSF-WF4, SEQ ID NO 5)；
5’ -TGTACTCAGGACTTAGACCACCCA-3’ (CSF-WR2, SEQ ID NO 10)。
上述引物对能够用于检测猪瘟病毒野毒株。
本发明的另一方面涉及一种探针，其包含SEQ ID NO :16所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID N0:16所示。
5’ -CGCCACTACGGCTAGT-3，(CSF-WP3, SEQ ID NO 16)。
本发明的探针能够用于检测猪瘟病毒野毒株。
具体地，所述探针带有可检测的标记。
根据本发明任一项所述的探针，其为自身淬灭探针。
根据本发明任一项所述的探针，其5’端标记有荧光发射基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
根据本发明任一项所述的探针，其中，所述荧光发射基团选自FAM、VIC、J0E、和HEX ;所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQjP MGB。
根据本发明任一项所述的探针，其3’端结合有小沟结合物(MGB)。
所述引物和探针可以根据本领域的现有技术合成，也可以委托专业的公司制备。
本发明的还一方面涉及一种组合物，其含有本发明的引物对和/或者本发明任一项所述的探针。[0024]所述组合物能够用于检测猪瘟病毒野毒株。
本发明的还一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明的引物对和本发明任一项所述的探针。
根据本发明任一项所述的试剂盒，其还包含RT-PCR反应缓冲液、反转录酶和Taq酶；具体地，所述反转录酶为高效反转录酶(仅在5分钟内就可从高拷贝基因中生产大量的cDNA，普通反转录酶需半小时)，所述Taq酶为热启动Taq酶。
根据本发明任一项所述的试剂盒，其中，所述引物对溶于RT-PCR反应缓冲液，其浓度为 IOpmoL/ μ L。
根据本发明任一项所述的试剂盒，其还包含RNA提取试剂。
根据本发明任一项所述的试剂盒，其还包含阳性对照和阴性对照，其中，所述阳性对照为猪瘟石门标准毒株，经灭活后得到；所述阴性对照为猪瘟疫苗株，经灭活后得到。
在本发明一个具体的实施方案中，所述的试剂盒，包含a)裂解液、b)洗液、c)洗脱液、d)吸附柱和收集管、e)阴性对照、f)阳性对照、g)RT-PCR反应液、h)酶混合液、j)荧光探针、k)无菌无核酸酶水；RT-PCR反应液含有上游引物CSF-WF和下游引物 CSF-WR，上游引物 CSF-WF 序列为5’ -AACTGGGCTAGCCATGCCCACAGT-3’ ；下游引物CSF-WR 序列为5’ -TGTACTCAGGACTTAGACCACCCA-3’ ；荧光探针含有探针 CSF-WP，序列为5’ -FAM-CGCCACTACGGCTAGT-MGB-3’，其5’端标记FAM荧光激发基团，3’端标记自身不发光的淬灭基团，同时另增加一个小沟结合物(minor groove binder,MGB)分子,与CSFV 5’非编码区基因高度保守区的特异性核苷酸片段反向互补。在该具体的实施方案中，对于每个反应，
所述的RT-PCR反应液包括反应缓冲液(含MgC12和dNTP) 12. 5μ L和IOpmoL/μ L (单个引物的浓度)弓丨物(CSF-WF和CSF-WR)1. 8 μ L ;
所述的荧光探针包括IOpmoL/ μ L探针CSF-WP O. 6 μ L和ROX染料O. 5 μ L ;
所述的酶混合液包括高效反转录酶O. 5 μ L和热启动Taq酶O. 5 μ L。
本发明的试剂盒能够用于检测猪瘟病毒野毒株。
本发明的还一方面涉及一种检测猪瘟病毒野毒株的方法，包括使用本发明的引物对、本发明任一项所述的探针、本发明的组合物、或者本发明任一项所述的试剂盒的步骤。
在本发明一个具体的实施方案中，所述的检测猪瘟病毒野毒株的方法，包括下述步骤
I)病毒RNA的提取；
2)进行FQ-PCR反应设被检样品RNA、阴性对照和阳性对照总体积为N，则反应体
系配制如下
权利要求
1.一种引物对和探针的组合产品，其中，所述引物对的一条引物的核苷酸序列如SEQID NO :5所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQID NO : 10所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 16 所示。
2.根据权利要求
1所述的引物对和探针的组合产品，其中，所述探针为自身淬灭探针。
3.根据权利要求
2所述的引物对和探针的组合产品，其中，所述探针的5’端标记有荧光发射基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
4.根据权利要求
3所述的引物对和探针的组合产品，其中，所述荧光发射基团选自FAM、VIC, JOE和HEX ;所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ和MGB。
5.一种组合物，其含有权利要求
1 一 4中任一项所述的引物对和探针的组合产品。
6.一种试剂盒，其包含权利要求
1 一 4中任一项所述的引物对和探针的组合产品。
7.根据权利要求
6所述的试剂盒，其还包含RT-PCR反应缓冲液、反转录酶和Taq酶。
8.根据权利要求
7所述的试剂盒，其中，所述反转录酶为高效反转录酶，所述Taq酶为热启动Taq酶。
9.根据权利要求
7所述的试剂盒，其中，引物对溶于RT-PCR反应缓冲液，其浓度为IOpmoL/u L0
10.根据权利要求
6所述的试剂盒，其还包含RNA提取试剂。
11.根据权利要求
6所述的试剂盒，其还包含阳性对照和阴性对照，其中，所述阳性对照为猪瘟石门标准毒株，经过灭活后得到；所述阴性对照为猪瘟疫苗株，经灭活后得到。
12.权利要求
1一 4中任一项所述的引物对和探针的组合产品、权利要求
5所述的组合物或者权利要求
6 — 11中任一项所述的试剂盒在制备检测猪瘟病毒野毒株的试剂中的用途。
专利摘要
本发明属于病毒检测领域，涉及一种用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对、探针、以及试剂盒。具体地，所述引物对其中一条引物包含SEQ ID NO5所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO10所示的核苷酸序列。本发明还涉及一种检测猪瘟病毒野毒株的方法以及所述的引物对、探针、或试剂盒在检测猪瘟病毒野毒株中的用途。本发明的优点是快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、检测成本低、时间短(加上核酸提取，仅需1.5小时)、检测效率高、准确性高、假阳性低等。本发明试剂盒能检测猪瘟病毒野毒株，不能检测到疫苗株和其它非猪瘟病毒野毒株，为猪瘟疫情的监测、防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。
文档编号C12Q1/68GKCN102212617 B发布类型授权 专利申请号CN 201110124916
公开日2013年4月10日 申请日期2011年5月16日
发明者孙明, 陈西钊, 陈南华, 乔明明, 陈曦, 田克恭 申请人:北京世纪元亨动物防疫技术有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (4),