专利名称:一种用复合酶水解牡蛎蛋白制备活性肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种牡蛎活性肽的制备方法，特别是一种用复合酶水解牡蛎蛋白制备活性肽的方法，属于海洋天然产物与医药技术领域：
。
背景技术：
牡蛎(Oyster)是一种海产贝类。牡蛎在分类上属于软体动物门，瓣鳃纲，异柱目，牡蛎超科，牡蛎科，它是一种食药两用的双壳贝海产品。在我国南北沿海均有养殖，特别是广东省近几年来发展较快，牡蛎肉质乳白、细嫩、营养丰富，除含有丰富的蛋白质、维生素和糖类外，还含有人体必需的十多种氨基酸、矿物质营养成分等。
近代研究表明牡蛎含18种氨基酸、肝糖元、B族维生素、牛磺酸和钙、磷、铁、锌等营养成分，常吃可以提高机体免疫力，其所含牛磺酸可降血脂、降血压。临床上，牡蛎在治疗失眠、慢性中耳炎、小儿多汗症、子宫肌瘤以及小儿遗尿等方面均有突出的疗效(中医药信息，2011，28 (I) : 114-116.)。牡蛎提取物有抗菌作用，对脊髓灰质炎病毒和流感病毒有抑制作用，其水溶性成分尚可提高动物机体免疫力等等。
从牡蛎中提取活性物质的研究过去有报道，并且具有显著医疗保健作用的牡蛎保健食品已经有销售。如深圳海王集团在牡蛎相关产品的开发研究中，已经取得了显著的经济效益和社会效益，为进一步推动该项目的产业化发展，正在努力研发高效的牡蛎保健食品和药品。目前，活性肽的主要生产方法通过酶法制备。中国专利公开号CN 1680578A公开了一种牡蛎活性肽的制备方法，以太平洋牡蛎为原料，利用蛋白酶水解牡蛎蛋白，再用纳滤技术脱盐浓缩，可得到牡蛎活性肽。该方法中使用的为蛋白酶，而酶的选择是生产活性肽的关键，酶的水解能力具有专一性，若想获得具有独特活性的多肽，单用一种酶效果不佳。且该方法属于食品生物技术领域：
，并未涉及到医药领域。
从海洋动植物中筛选抗免疫调节促进剂、免疫调节抑制剂、促进或抑制血管形成、抗肿瘤作用等活性物质是药物研发的一个重要领域，但有关从海洋生物活性肽筛选具有免疫调节作用研究仍未得到足够重视。中国专利公开号CN 101037468A公开了一种牡蛎活性肽的制备方法，以牡蛎为原料，利用酶法水解牡蛎蛋白及利用柱层析技术分离纯化获得高纯度的牡蛎活性多肽，该法所得到的牡蛎活性多肽虽然可以作为药品成分加以开发利用，但因其成本昂贵，难以实现大量生产。
发明内容
本发明的目的是针对上述方法提出的不足，提供了一种能实现规模化生产免疫活性肽的方法。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的
一种用复合酶水解牡蛎蛋白制备活性肽的方法，按照以下步骤制备
1.将牡蛎去壳，捣碎，按照 1:1的重量比例加入蒸馏水，在室温下匀浆，得到牡蛎浆液；[0010]2.向牡蛎浆液加入牡蛎蛋白重量O. 5-2. 0%。的植物蛋白水解复合酶，在40_60°C下进行酶解反应3-5h ；
3.将酶解反应完成后的牡蛎浆液置于90-100°C下灭酶10-15min。
4.酶灭活后的牡蛎浆液保持70°C，加入盐酸调节pH值至3-5 ；
5.牡蛎浆液调节pH值后，加入活性炭溶液进行脱色，脱色时间35min。
6.将脱色后的牡蛎浆液用MWC03000超滤膜，在真空减压下抽滤，得到滤液。
7.将滤液冷冻干燥，即可获得分子量小于3000Da,蛋白质含量为85. 2%,氮含量为12. 7%的牡蛎蛋白多肽。
所述酶解反应所用酶为南宁庞博生物工程有限公司的发明专利植物蛋白水解复合酶，它包含有内切酶和外切酶、风味酶。
内切酶在木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶中选用，或者选用这些内切酶的混合物。其制备方法为以木瓜蛋白酶制备为例，从木瓜树或果实取下新鲜木瓜浆，先用蒸馏水或去离子水冲稀或溶解木瓜胶乳，加入无机酸使杂质沉淀，离心、过滤，经微滤和超滤、浓缩、真空冷冻干燥、粉碎、密封保存备用；菠萝蛋白酶也按照此方法制备；中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶的制备，用已知方法经发酵提取得到；
外切酶在米曲霉或米根霉、黑曲霉等发酵物提取中选用，或者选用这些外切酶的混合物。其制备方法为以大豆或豆柏、麦鼓为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30-50 V，湿度70-90 %的密闭容器中发酵2-5天，提取、再干燥，密封保存备用。
风味酶在乳酸菌或酵母菌等发酵物提取中选用，或者选用这些风味酶的混合物。其制备方法为以大豆或豆柏、麦鼓为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦鼓粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌种，在常温下发酵1-4天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后冻干，粉碎得到风味酶，保存备用。
优选的酶解反应温度为60°C，反应时间为4h。
优选的灭酶温度为95°C，时间为lOmin。
优选将灭酶后的牡蛎浆液调节pH值至4. 5。
所述活性炭溶液的制备方法是将活性炭预热200°C，活化lh，用蒸馏水将所得沉淀配成质量浓度为5%的溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是
1.本发明采用南宁庞博生物工程有限公司的发明专利植物蛋白水解复合酶，可制备优质的具有独特活性的多肽。
2.本发明利用超滤膜进行活性肽的筛分，通过膜的选择性，以膜两侧存在的一定量能量差作为推动力，溶液中各组分透过膜的迁移速率的不同而实现非均相物系的分离。由于超滤膜具有不对称微孔结构，且采用薄层流道和湍流促进结构，减少膜的污染，在分离过程中，使得大分子溶质和微粒(如胶体或淀粉等)随溶液切向流经膜表面，而小分子物质和溶剂则在压力驱动下穿过致密层上的微孔而进入膜的另一侧，因而超滤膜可以长期连续使用并保持较恒定的产量和分离效果。与传统工艺相比较，不仅可以提高产品的纯度、节约溶剂或试剂的耗用量，环境污染小，能够实现连续化分离纯化，缩短生产周期，可实现大规模产业化生产。[0027]3.本发明产品牡蛎活性多肽可抑制小鼠淋巴细胞和人T细胞白血病细胞Jurkat细胞增殖能力，即能降低抗体免疫反应，是一种潜在的免疫抑制剂。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围(其中复合酶以南宁庞博生物工程有限公司的发明专利植物蛋白水解复合酶的部分实施例为原料)。
实施例1 :
内切酶的制备以木瓜蛋白酶制备为例，从木瓜树或果实取下新鲜木瓜浆，先用蒸馏水或去离子水冲稀或溶解木瓜胶乳，加入无机酸使杂质沉淀，离心、过滤，经微滤与超滤、浓缩、真空冷冻干燥、粉碎、得木瓜蛋白酶，密封保存备用。
外切酶的制备以大豆或豆柏、麦鼓为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30°C，湿度90%的密闭容器中发酵3天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存备用。
风味酶的制备以大豆或豆柏、麦鼓为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦鼓粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌种，在常温下发酵2天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后冻干，粉碎得到风味酶，保存备用。
将上述的内切酶、外切酶、风味酶按质量份数64 30 5的比例，并加入I份焦
亚硫酸钠，混合，得到植物蛋白水解复合酶，置于10°c的冰箱保存。
将牡蛎去壳，捣碎，按照1:1的重量比例加入蒸馏水，在室温下匀浆，得到牡蛎浆液；向牡蛎浆液加入牡蛎蛋白重量O. 5%%。的植物蛋白水解复合酶，在40°C下进行酶解反应3h ;将酶解反应完成后的牡蛎浆液置于90°C下灭酶IOmin ;采用甲醛滴定法测定氨基氮总量，凯氏定氮法测定总氮；酶灭活后的牡蛎浆液保持70°C，加入盐酸调节pH值至3 ；牡蛎浆液调节PH值后，加入活性炭溶液进行脱色，脱色时间35min ;将脱色后的牡蛎浆液用MWC03000超滤膜，在真空减压下抽滤，得到滤液；将滤液冷冻干燥，即可获得分子量小于3000Da的牡蛎蛋白多肽。
将小鼠淋巴细胞和Jurkat细胞调到浓度为IxlO5个/ml后加入96孔板，每孔100μ 1，用无小牛血清的PRM1-1640培养基将PHA浓度配制为浓度为Img ^r1的母液，再用含15%小牛血清PRM1-1640培养基将PHA母液稀释浓度为I μ g .mr1,然后用该培养基把分子量小于3000的牡蛎活性肽冻干粉配成需要的浓度1000 μ g · πιΓ1，每孔加该溶液lOOul，加到孔板后PHA的终浓度为O. 5 μ g · πιΓ1，牡蛎蛋白多肽终浓度500 μ g · πιΓ1,每孔液体终体积200 μ I。每组各做3个复孔，所设的3个空白孔为IOOul细胞悬液和IOOul含15%小牛血清及I μ g -ml-lPHA的1640培养基。将加好样品的96孔板置于CO2培养箱培养48小时，培养条件为37°C、5% C02。于培养结束前4小时加入511^*1111-现1'1'，每孔2(^1。培养结束后用低温孔板离心机(3000r mirTSfC )离心，IOmin ;弃上清,力口 O. 4mol · L—1的盐酸化异丙醇，每孔100 μ I ;待结晶物溶解后，用酶标仪于492nm处测定吸光度。按下列公式计算抑制率生长抑制率=(1-用药平均A值/对照平均A值)X100%。结果表明，牡蛎蛋白多肽对小鼠淋巴细胞生长和Jurkat细胞增殖的抑制作用明显，呈现良好的浓度依赖性。浓度为125ug · πιΓ1时无论是对小鼠淋巴细胞还是Jurkat细胞，抑制率都达到了 40%以上。[0036]实施例2
内切酶的制备取新鲜菠萝及皮，打碎取汁，加入无机酸使杂质沉淀，离心、过滤，经微滤与超滤、浓缩、真空冷冻干燥、粉碎、得菠萝蛋白酶，密封保存备用。
外切酶的制备以大豆或豆柏、麦鼓为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在35°C，湿度80%的密闭容器中发酵5天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存备用。
风味酶的制备以大豆或豆柏、麦鼓为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦鼓粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母 菌等菌种，在常温下发酵3天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后冻干，粉碎得到风味酶，保存备用。
将上述的内切酶、外切酶、风味酶按质量份数40 49 10的比例，并加入I份L-半胱氨酸，混合，得到植物蛋白水解复合酶，置于10°C的冰箱保存。
将牡蛎去壳，捣碎，按照1:1的重量比例加入蒸馏水，在室温下匀浆，得到牡蛎浆液；向牡蛎浆液加入牡蛎蛋白重量1. 0%。的植物蛋白水解复合酶，在50°C下进行酶解反应4h ;将酶解反应完成后的牡蛎浆液置于95°C下灭酶IOmin ;采用甲醛滴定法测定氨基氮总量，凯氏定氮法测定总氮；酶灭活后的牡蛎浆液保持70°C，加入盐酸调节pH值至3. 5 ；牡蛎浆液调节PH值后，加入活性炭溶液进行脱色，脱色时间35min ;将脱色后的牡蛎浆液用MWC03000超滤膜，在真空减压下抽滤，得到滤液；将滤液冷冻干燥，即可获得分子量小于3000Da的牡蛎蛋白多肽。
将小鼠淋巴细胞和Jurkat细胞调到浓度为IxlO5个/ml后加入96孔板，每孔100μ 1，用无小牛血清的PRM1-1640培养基将PHA浓度配制为浓度为Img ^r1的母液，再用含15%小牛血清PRM1-1640培养基将PHA母液稀释浓度为I μ g · ml—1，然后用该培养基把分子量小于3000的牡蛎活性肽冻干粉配成需要的浓度500 μ g -πιΓ1,每孔加该溶液lOOul，加到孔板后PHA的终浓度为O. 5 μ g · πιΓ1，牡蛎蛋白多肽终浓度250 μ g · πιΓ1,每孔液体终体积200 μ I。每组各做3个复孔，所设的3个空白孔为IOOul细胞悬液和IOOul含15%小牛血清及I μ g -ml-lPHA的1640培养基。将加好样品的96孔板置于CO2培养箱培养48小时，培养条件为37°C、5% C02。于培养结束前4小时加入511^*1111-现1'1'，每孔2(^1。培养结束后用低温孔板离心机(3000r mirTSfC )离心，IOmin ;弃上清,力口 O. 4mol · L—1的盐酸化异丙醇，每孔100 μ I ;待结晶物溶解后，用酶标仪于492nm处测定吸光度。按下列公式计算抑制率生长抑制率=(1-用药平均A值/对照平均A值)X100%。结果表明，牡蛎蛋白多肽对小鼠淋巴细胞生长和Jurkat细胞增殖的抑制作用明显，呈现良好的浓度依赖性。
实施例3
内切酶的制备以木瓜蛋白酶制各为例，从木瓜树或果实取下新鲜木瓜浆，先用蒸馏水或去离子水冲稀或溶解木瓜胶乳，加入无机酸使杂质沉淀，离心、过滤，经微滤与超滤、浓缩、真空冷冻干燥、粉碎、得木瓜蛋白酶，密封保存备用。
外切酶的制备以大豆或豆柏、麦鼓为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在50°C，湿度70%的密闭容器中发酵2天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存备用。
风味酶的制备以大豆或豆柏、麦鼓为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦鼓粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌种，在常温下发酵4天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后冻干，粉碎得到风味酶，保存备用。
将上述的内切酶、外切酶、风味酶按质量份数20 70 9的比例，并加入I份
L-半胱氨酸酸盐，混合，得到植物蛋白水解复合酶，置于10°C的冰箱保存。
将牡蛎去壳，捣碎，按照1:1的重量比例加入蒸馏水，在室温下匀浆，得到牡蛎浆液；向牡蛎浆液加入牡蛎蛋白重量1. 0%。的植物蛋白水解复合酶，在60°C下进行酶解反应5h ;将酶解反应完成后的牡蛎浆液置于100°C下灭酶15min ;采用甲醛滴定法测定氨基氮总量，凯氏定氮法测定总氮；酶灭活后的牡蛎浆液保持70°C，加入盐酸调节pH值至4 ;牡蛎浆液调节PH值后，加入活性炭溶液进行脱色，脱色时间35min ;将脱色后的牡蛎浆液用MWC03000超滤膜，在真空减压下抽滤，得到滤液；将滤液冷冻干燥，即可获得分子量小于3000Da的牡蛎蛋白多肽。
将小鼠淋巴细胞和Jurkat细胞调到浓度为IxlO5个/ml后加入96孔板，每孔100μ 1，用无小牛血清的PRM1-1640培养基将PHA浓度配制为浓度为Img ^r1的母液，再用含15%小牛血清PRM1-1640培养基将PHA母液稀释浓度为I μ g · ml—1，然后用该培养基把分子量小于3000的牡蛎活性肽冻干粉配成需要的浓度250 μ g πιΓ1，每孔加该溶液lOOul，加到孔板后PHA的终浓度为O. 5 μ g · πιΓ1，牡蛎蛋白多肽终浓度125 μ g · πιΓ1,每孔液体终体积200 μ I。每组各做3个复孔，所设的3个空白孔为IOOul细胞悬液和IOOul含15%小牛血清及I μ g -ml-lPHA的1640培养基。将加好样品的96孔板置于CO2培养箱培养48小时，培养条件为37°C、5% C02。于培养结束前4小时加入511^*1111-现1'1'，每孔2(^1。培养结束后用低温孔板离心机(3000r mirTSfC )离心，IOmin ;弃上清,力口 O. 4mol · L—1的盐酸化异丙醇，每孔100 μ I ;待结晶物溶解后，用酶标仪于492nm处测定吸光度。按下列公式计算抑制率生长抑制率=(1-用药平均A值/对照平均A值)X100%。结果表明，牡蛎蛋白多肽对小鼠淋巴细胞生长和Jurkat细胞增殖的抑制作用明显，呈现良好的浓度依赖性。
实施例4
内切酶的制备中性蛋白酶的制备，用已知方法经发酵提取得到，密封保存备用。
外切酶的制备以大豆或豆柏、麦鼓为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦鼓粉碎，加入米曲霉或米根雷、黑曲霉在30°C，湿度90%的密闭容器中发酵4. 5天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存备用。
风味酶的制备以大豆或豆柏、麦鼓为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦苏粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌种，在常温下发酵3. 5天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后陈干，粉碎得到风味酶，保存备用。
将上述的内切酶、外切酶、风味酶按质量份数10 59 30的比例，并加入I份焦
亚硫酸钠，混合，得到植物蛋白水解复合酶，置于10°c的冰箱保存。
将牡蛎去壳，捣碎，按照1:1的重量比例加入蒸馏水，在室温下匀浆，得到牡蛎浆液；向牡蛎浆液加入牡蛎蛋白重量1. 5%。的植物蛋白水解复合酶，在45°C下进行酶解反应3. 5h ;将酶解反应完成后的牡蛎浆液置于95°C下灭酶15min ;采用甲醛滴定法测定氨基氮总量，凯氏定氮法测定总氮；酶灭活后的牡蛎浆液保持70°C，加入盐酸调节pH值至4. 5 ；牡蛎浆液调节PH值后，加入活性炭溶液进行脱色，脱色时间35min ;将脱色后的牡蛎浆液用MWC03000超滤膜，在真空减压下抽滤，得到滤液；将滤液冷冻干燥，即可获得分子量小于3000Da的牡蛎蛋白多肽。[0056]将小鼠淋巴细胞和Jurkat细胞调到浓度为IxlO5个/ml后加入96孔板，每孔100 μ 1，用无小牛血清的PRM1-1640培养基将PHA浓度配制为浓度为Img ^r1的母液，再用含15%小牛血清PRM1-1640培养基将PHA母液稀释浓度为I μ g · ml—1，然后用该培养基把分子量小于3000的牡蛎活性肽冻干粉配成需要的浓度125 μ g πιΓ1，每孔加该溶液lOOul，加到孔板后PHA的终浓度为O. 5 μ g πιΓ1，牡蛎蛋白多肽终浓度62. 5 μ g-πιΓ1,每孔液体终体积200 μ I。每组各做3个复孔，所设的3个空白孔为IOOul细胞悬液和IOOul含15%小牛血清及I μ g -ml-lPHA的1640培养基。将加好样品的96孔板置于CO2培养箱培养48小时，培养条件为37°C、5% C02。于培养结束前4小时加入511^*1111-现1'1'，每孔2(^1。培养结束后用低温孔板离心机(3000r mirTSfC )离心，IOmin ;弃上清,力口 O. 4mol · L—1的盐酸化异丙醇，每孔100 μ I ;待结晶物溶解后，用酶标仪于492nm处测定吸光度。按下列公式计算抑制率生长抑制率=(1-用药平均A值/对照平均A值)X100%。结果表明，牡蛎蛋白多肽对小鼠淋巴细胞生长和Jurkat细胞增殖的抑制作用明显，呈现良好的浓度依赖性。浓度为125ug · πιΓ1时无论是对小鼠淋巴细胞还是Jurkat细胞，抑制率都达到了 40%以上。
实施例5
内切酶的制备碱性蛋白酶制备，用已知方法经发酵提取得到，密封保存备用。
外切酶的制备以大豆或豆柏、麦款为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30°C，湿度88%的密闭容器中发酵2. 5天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存备用。
风味酶的制备以大豆或豆柏、麦鼓为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦鼓粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌种，在常温下发酵2. 5天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后冻干， 粉碎得到风味酶，保存备用。
将上述的内切酶、外切酶、风味酶按质量份数75 10 14的比例，并加入I份焦亚硫酸钠，混合，得到植物蛋白水解复合酶，置于10°c的冰箱保存。
将牡蛎去壳，捣碎，按照1:1的重量比例加入蒸馏水，在室温下匀浆，得到牡蛎浆液；向牡蛎浆液加入牡蛎蛋白重量2. 0%。的植物蛋白水解复合酶，在55°C下进行酶解反应4. 5h ;将酶解反应完成后的牡蛎浆液置于95°C下灭酶IOmin ;采用甲醛滴定法测定氨基氮总量，凯氏定氮法测定总氮；酶灭活后的牡蛎浆液保持70°C，加入盐酸调节pH值至5 ;牡蛎浆液调节PH值后，加入活性炭溶液进行脱色，脱色时间35min ;将脱色后的牡蛎浆液用MWC03000超滤膜，在真空减压下抽滤，得到滤液；将滤液冷冻干燥，即可获得分子量小于3000Da的牡蛎蛋白多肽。
将小鼠淋巴细胞和Jurkat细胞调到浓度为IxlO5个/ml后加入96孔板，每孔100 μ 1，用无小牛血清的PRM1-1640培养基将PHA浓度配制为浓度为Img ^r1的母液，再用含15%小牛血清PRM1-1640培养基将PHA母液稀释浓度为I μ g .mr1,然后用该培养基把分子量小于3000的牡蛎活性肽冻干粉配成需要的浓度62. 5μ g · πιΓ1，每孔加该溶液lOOul，加到孔板后PHA的终浓度为O. 5μ g · πιΓ1，牡蛎蛋白多肽终浓度31. 25 μ g · πιΓ1，每孔液体终体积200 μ I。每组各做3个复孔，所设的3个空白孔为IOOul细胞悬液和IOOul含15%小牛血清及I μ g -ml-lPHA的1640培养基。将加好样品的96孔板置于CO2培养箱培养48小时，培养条件为37°C、5% C02。于培养结束前4小时加入511^*1111-现1'1'，每孔2(^1。培养结束后用低温孔板离心机(3000r mirTSfC )离心，IOmin ;弃上清,力口 O. 4mol · L—1的盐酸化异丙醇，每孔100 μ I ;待结晶物溶解后，用酶标仪于492nm处测定吸光度。按下列公式计算抑制率生长抑制率=(1-用药平均A值/对照平均A值)X100%。结果表明，牡蛎蛋白多肽对小鼠淋巴细胞生长和Jurkat细胞增殖的抑制作用明显，呈现良好的浓度依赖性。
实施例6
内切酶的制备以木瓜蛋白酶制备为例，从木瓜树或果实取下新鲜木瓜浆，先用蒸馏水或去离子水冲稀或溶解木瓜胶乳，加入无机酸使杂质沉淀，离心、过滤，经微滤与超滤、浓缩、真空冷冻干燥、粉碎、得木瓜蛋白酶，密封保存备用。
外切酶的制备以大豆或豆柏、麦鼓为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30°C，湿度85%的密闭容器中发酵3. 5天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存备用。
风味酶的制各以大豆或豆柏、麦款为原料，按常规的方法，格大豆或豆柏、麦款粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母茵等菌种，在常温下发酵1. 5天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后冻干，粉碎得到风味酶，保存备用。
将上述的内切酶、外切酶、风味酶按质量份数50 34 15的比例，并加入I份焦亚硫酸钠，即称取50kg木瓜蛋白酶,34kg外切酶，15kg风味酶及Ikg焦亚硫酸钠,混合,得IOOkg植物蛋白水解复合酶， 置于10°C的冰箱保存。
将牡蛎去壳，捣碎，按照1:1的重量比例加入蒸馏水，在室温下匀浆，得到牡蛎浆液；向牡蛎浆液加入牡蛎蛋白重量1. 5%。的植物蛋白水解复合酶，在60°C下进行酶解反应4h ;将酶解反应完成后的牡蛎浆液置于95°C下灭酶IOmin ;采用甲醛滴定法测定氨基氮总量，凯氏定氮法测定总氮；酶灭活后的牡蛎浆液保持70°C，加入盐酸调节pH值至4. 5;牡蛎浆液调节PH值后，加入活性炭溶液进行脱色，脱色时间35min ;将脱色后的牡蛎浆液用MWC03000超滤膜，在真空减压下抽滤，得到滤液；将滤液冷冻干燥，即可获得分子量小于3000Da的牡蛎蛋白多肽。
将小鼠淋巴细胞和Jurkat细胞调到浓度为IxlO5个/ml后加入96孔板，每孔100 μ 1，用无小牛血清的PRM1-1640培养基将PHA浓度配制为浓度为Img ^r1的母液，再用含15%小牛血清PRM1-1640培养基将PHA母液稀释浓度为I μ g .mr1,然后用该培养基把分子量小于3000的牡蛎活性肽冻干粉配成需要的浓度31. 25 Ug -πιΓ1,每孔加该溶液lOOul，加到孔板后PHA的终浓度为O. 5μ g πιΓ1，牡蛎蛋白多肽终浓度15. 625 Ug πιΓ1，每孔液体终体积200 μ I。每组各做3个复孔，所设的3个空白孔为IOOul细胞悬液和IOOul含15%小牛血清及I μ g -ml-lPHA的1640培养基。将加好样品的96孔板置于CO2培养箱培养48小时，培养条件为37°C、5% C02。于培养结束前4小时加入511^*1111-现1'1'，每孔2(^1。培养结束后用低温孔板离心机(3000r mirTSfC )离心，IOmin ;弃上清,力口 O. 4mol · L—1的盐酸化异丙醇，每孔100 μ I ;待结晶物溶解后，用酶标仪于492nm处测定吸光度。按下列公式计算抑制率生长抑制率=(1-用药平均A值/对照平均A值)X100%。结果表明，牡蛎蛋白多肽对小鼠淋巴细胞生长和Jurkat细胞增殖的抑制作用明显，呈现良好的浓度依赖性。
实施例7:
内切酶的制备碱性蛋白酶制备，用已知方法经发酵提取得到，密封保存备用。
外切酶的制备以大豆或豆柏、麦款为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦鼓粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30°C，湿度88%的密闭容器中发酵2. 5天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存备用。
风味酶的制备以大豆或豆柏、麦鼓为原料，按常规的方法，将大豆或豆柏、麦鼓粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌种，在常温下发酵2. 5天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后冻干，粉碎得到风味酶，保存备用。
将上述的内切酶、外切酶、风味酶按质量份数75 10 14的比例，并加入I份焦
亚硫酸钠，混合，得到植物蛋白水解复合酶，置于10°c的冰箱保存。
将牡蛎去壳，捣碎，按照1:1的重量比例加入蒸馏水，在室温下匀浆，得到牡蛎浆液；向牡蛎浆液加入牡蛎蛋白重量2. 0%。的植物蛋白水解复合酶，在50°C下进行酶解反应5h ;将酶解反应完成后的牡蛎浆液置于90°C下灭酶15min ;采用甲醛滴定法测定氨基氮总量，凯氏定氮法测定总氮；酶灭活后的牡蛎浆液保持70°C，加入盐酸调节pH值至4. 5;牡蛎浆液调节PH值后，加入活性炭溶液进行脱色，脱色时间35min ;将脱色后的牡蛎浆液用MWC03000超滤膜，在真空减压下抽滤，得到滤液；将滤液冷冻干燥，即可获得分子量小于3000Da的牡蛎蛋白多肽。
将小鼠淋巴细胞和Jurkat细胞调到浓度为IxlO5个/ml后加入96孔板，每孔100 μ 1，用无小牛血清的PRM1-1640培养基将PHA浓度配制为浓度为Img ·πι1-1的母液，再用含15%小牛血清PRM1-1640培养基将PHA母液稀释浓度为I μ g ·πι1-1，然后用该培养基把分子量小于3000的牡蛎活性肽冻干粉配成需要的浓度15. 625μ g · ml_l，每孔加该溶液lOOul，加到孔板后PHA的终浓度为O. 5μ g ·πι1-1，牡蛎蛋白多肽终浓度7. 8125yg*ml-l,每孔液体终体积200 μ I。每组各做3个 复孔，所设的3个空白孔为IOOul细胞悬液和IOOul含15%小牛血清及I μ g -ml-lPHA的1640培养基。将加好样品的96孔板置于CO2培养箱培养48小时，培养条件为37°C、5% C02。于培养结束前4小时加入5mg ·ι 1-1ΜΤΤ，每孔20 μ I。培养结束后用低温孔板离心机(3000r · min-1,4。。)离心，IOmin ;弃上清,力口 O. 4mol · L-1的盐酸化异丙醇，每孔100 μ I ;待结晶物溶解后，用酶标仪于492nm处测定吸光度。按下列公式计算抑制率生长抑制率=(1-用药平均A值/对照平均A值)X100%。结果表明，牡蛎蛋白多肽对小鼠淋巴细胞生长和Jurkat细胞增殖的抑制作用明显，呈现良好的浓度依赖性。
权利要求
1.一种用复合酶水解牡蛎蛋白制备活性肽的方法，其特征是，按照以下步骤制备①将牡蛎去壳、捣碎，按照1:1的重量比例加入蒸馏水，匀浆，得到牡蛎浆液；②将牡蛎浆液进行酶解反应，所述酶解反应所用酶为植物蛋白水解复合酶；所述植物蛋白水解复合酶加入量为牡蛎蛋白重量的O. 5-2.0%;所述酶解反应温度为40-60°C，反应时间3-5h ；③酶解反应结束后给牡蛎浆液灭酶；④灭酶后的牡蛎浆液用盐酸调节PH值；将灭酶后的牡蛎浆液调节pH值至3-5；⑤将调节PH值后的牡蛎浆液进行脱色；⑥将脱色后的牡蛎浆液用抽滤膜进行抽滤，得到滤液；所述抽滤膜规格为MWC03000；⑦将所得滤液冷冻干燥，即可获得分子量小于3000Da的牡蛎蛋白多肽。
2.根据权利要求
1所述的用复合酶水解牡蛎蛋白制备活性肽的方法，其特征是，所述匀浆在室温下进行。
3.根据权利要求
1所述的用复合酶水解牡蛎蛋白制备活性肽的方法，其特征是，所述灭酶温度为90-100°C，时间10-15min。
4.根据权利要求
1所述的用复合酶水解牡蛎蛋白制备活性肽的方法，其特征是，所述脱色采用的脱色剂为活性炭溶液。
5.根据权利要求
1所述的用复合酶水解牡蛎蛋白制备活性肽的方法，其特征是，所述抽滤是在真空减压条件下进行的。
专利摘要
本发明公开了一种用复合酶水解牡蛎蛋白制备活性肽的方法。该方法是将牡蛎去壳，捣碎，加蒸馏水，匀浆，酶解，灭酶，调节pH值，真空减压抽滤及冷冻干燥后，获得一种分子量小于3000Da的活性肽。本发明制备出的牡蛎活性多肽纯度高，能降低抗体免疫反应，是一种潜在的免疫抑制剂。
文档编号C12P21/06GKCN102250997 B发布类型授权 专利申请号CN 201110127482
公开日2013年4月10日 申请日期2011年5月17日
发明者李超柱, 陈艳辉, 黎丹戎 申请人:钦州学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (4), 非专利引用 (2),