专利名称：可利用甲烷的金黄杆菌及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于环境生物技术领域，具体的说涉及一种可利用甲烷的金黄杆菌以及应用。
背景技术：
甲烷氧化菌是一种特殊的、以甲烷为唯一碳源和能源的甲基营养型微生物，分布 范围很广，在酸、碱、盐、高温、低温、贫瘠等很多环境下都发现甲烷氧化菌存在。其特殊的代 谢过程和代谢产物对全球环境具有重大影响，已经引起广泛的关注。甲烷氧化菌不仅在全 球甲烷消耗中起重要作用，而且在碳、氮、氧循环中也发挥着重要作用。甲烷氧化菌是一种革兰氏阴性菌，严格寡营养型。自1906年首次分离出 甲烷氧化菌以来，至今已经发现的甲烷氧化菌共有8个属，主要包括甲基单胞菌属 (Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基孢囊 菌属(Methylocytis)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium) > Methylocaldum和Methylospera。根据代谢途径、膜结构、主要磷脂脂肪酸成分等系列特 征，可将甲烷氧化菌分为I型、II型和X型三大类型。甲烷氧化菌对甲烷氧化途径有两条， 一条是通过由乙醛酸到丝氨酸的途径，另一条是甲醛结合在磷酸核糖上生成6-磷酸阿洛 酮糖的途径。这些菌可以利用任何一条途径来进行同化，总反应式CH4 — CH3OH — HCHO — HCOOH — CO2甲烷氧化菌的特征酶是催化第一步反应的甲烷单加氧酶 (methanemonooxygenase,ΜΜ0)，MMO能断裂非常稳定的C-H键，将分子氧中的一个氧原子插 入C-H中，另一个氧原子则生成水。它有两种不同的类型颗粒状或膜结合甲烷单加氧酶 (particulatemethane monooxygenase, pMMO)禾口可溶性甲烧单力口氧Bl (soluble methane monooxygenase, sMMO)。甲烷氧化菌研究速度过快导致了目前国内外研究报道中对该类细菌的称谓存 在着不统一和歧义。以文献报道为依据，对甲烷氧化菌进行全面介绍最早可追溯到1958 年，Leadbetter总结了自1906年首次发现甲烷氧化菌以来的研究成果，文章之所以提及 甲烷利用细菌而不是甲烷氧化菌，主要是因为当时研究条件以及研究深度和广度的局限， 并不能给出这一类菌的共同特征。在伯杰细菌手册第八版(1984)中，将这一类菌归属于 了甲基单胞菌科，并定义这一类菌仅利用单碳有机化合物作为碳源，属于革兰氏阴性菌。 1996年，Hanson对甲烧氧化菌的称谓进行了统一，即Methane-oxidation bacteria和 Methane-utilizingbacteria 者β^Τ禾尔为 methanotrophs。在伯杰细菌手册关于甲基单胞菌科的描述中发现了另一个重要的信息，“许多细 菌是能利用多碳化合物以及单碳化合物，而不是专依靠甲烷或甲醇作为碳源和能源”。与 传统意义上只以甲烷为唯一碳源和能源的甲烷氧化菌相区别，此类细菌称之为兼性营养 甲烷氧化菌(facultative methanotrophs)。经典生物学研究在培养基优化中很少关注 以甲烷为碳源，目前，已有一些文献报道了非甲烷氧化菌可以消耗甲烷。Wolf早在1979年就发现了可以利用甲烷的酵母菌，目前有许多甲烷利用酵母被分离和纯化，其中包括 Pichiapastoris, Hansensulapolymorpha, Candida spp.，and Trichsporon spp. 0兼性营养甲烷氧化菌可以利用其它碳源，因此更易实现扩大培养。生活垃圾在漫 长的降解过程中富含了丰富的微生物，前期研究表明矿化垃圾具有很好的降解甲烷能力， 从生活垃圾填埋场中提取兼性营养甲烷氧化菌有望在生活垃圾填埋场等人为源甲烷减排 的工程化方面取得新的突破，并为甲烷氧化在温室气体方面的工程应用提供新的平台。
发明内容
本发明针对现有技术中甲烷生物甲烷无法工程化方面存在的不足，提供一种可利 用甲烷的金黄杆菌JT03及用途，所述金黄杆菌JT03可以利用淀粉等经济型碳源快速生长， 在此基础上实现高效地甲烷氧化，为甲烷生物氧化强化填埋场甲烷减排的工程化提供了非 常重要的生物基础。。本发明的技术方案是可利用甲烷的金黄杆菌，其保藏号为CCTCC NO.M2010100，其16S rDNA序列如SEQ ID NO 1 所示。可利用甲烷的金黄杆菌的菌落直径0. 8-1. 2mm,圆形凸起或扁平，黄色或白色或 桔黄色，透明有光泽；菌体杆状或椭圆形，不运动，好氧、化能异养型细菌；细胞宽0. 4 0.6^111，长1.0 1.311111;革兰氏染色阴性。本发明所述可利用甲烷的金黄杆菌可用于制备甲烷生物吸收剂、垃圾处理或制备 生物催化剂。本发明的菌株名为金黄杆菌(Chryseobacterium sp.) JT03 (保藏号为CCTCCNo. M2010100，保藏单位为中国典型培养物保藏中心-武汉大学保藏中心，保藏日期为2010年 4月25日)，从生活垃圾填埋场中分离得到的。该菌可高效利用甲烷，具有极高应用价值。 菌株DNA的测序委托大连宝生物公司完成，金黄杆菌JT03的16S rDNA部分碱基序列长度 为664bp(SEQ ID NO 1)，碱基序列在GenBank核酸序列数据库进行比较发现与金黄杆菌属 (Chryseobacterium sp.)的3个菌株的同源性在99%以上。通过对该菌株进行的一系列生 理生化以及工艺优化试验表明，本发明提供的可利用甲烷的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)JT03CCTCC N0.M2010100，可有效解决人为源甲烷的减排，主要特点如下(1)金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)JT03的发现克服了专一营养甲烷氧化菌 菌体密度低，菌体难于扩大培养等应用难题。(2)用金黄杆菌(Chryseobacterium sp. ) JT03的完整细胞作为生物催化剂，脱离 环境体系后仍可维持较高的甲烷氧化活性；适用于高浓度甲烷氧化，血清瓶中浓度为40% (ν/ν)的甲烷可完全降解。(3)该菌脱离环境体系后，在培养84h后可恢复活性，与已报道的甲烷氧化菌比 较，延迟时间缩短了约Mh。该菌脱离环境耐受性强，适合填埋后期寡养环境下的甲烷氧化， 该菌体的液体培养浓度高于以报道的多数甲烷氧化菌，对甲烷有较高的亲和性。(4)金黄杆菌(Chryseobacterium sp. ) JT03的扩大培养所需的培养基简单，成本 低。特别适用于生活垃圾填埋场、水稻田等甲烷人为源，可以广泛推广。本发明所述金黄杆菌(Chryseobacterium sp. ) JT03是从生活垃圾填埋场分离得到，在脱离垃圾填埋场环境后仍保持较高的甲烷氧化活性，可应用于生活垃圾填埋场、水稻 田等人为源甲烷的减排，在温室气体减排领域具有广阔的应用前景；本发明所述金黄杆菌 (Chryseobacterium sp.) JT03也可在NMS培养基上培养，可利用多碳化合物为碳源快速增 殖，易于扩大化培养；所述金黄杆菌在利用多碳化合物增殖后仍具有高效降解甲烷的能力。下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式不限于 此。
图1金黄杆菌Chryseobacterium sp. JT03菌株的电镜扫描照片；图2金黄杆菌JT03切胶回收目的片段的DNA电泳，其中M =DL 2，OOODNAMarker ； 1 JT03PCR产物；+ 正对照；-负对照；图3金黄杆菌Chryseobacterium sp. JT03菌株以甲烷为碳源的生长曲线；图4不同碳源培养的Chryseobacterium sp. JT03菌株对甲烷降解效果图；图5是不同碳源培养的Chryseobacterium sp. JT03菌株代谢过程二氧化碳生产 效果图。
具体实施例方式1.实验材料NMS 培养基的组成如下(g/L) =KH2PO4L Og · Λ Na2HPO4 · 12Η20 2. 9g · Λ MgSO4 ·7Η20 0. 32g ·ΙΛ (NH4) 2S043. Og · Γ1，微量元素溶液 10mL，蒸馏水 990mL，pH 6. 8。微量 元素溶液组成如下(mg/L) =ZnSO4 ·7Η20 0. 287 ；MnSO4 ·7Η200· 223 ；H3BO3O. 062 ；Na2M0O4 ·2Η20 0. 048 ；COCl2 · 6Η20 0. 048 ；KI 0. 083 ；CaCl2 · 2Η20 3. 5。垃圾颗粒选自生活垃圾填埋场矿化垃圾，本实施例选取上海老港垃圾填埋场(上 海市南汇区老港东部)已填埋10年的垃圾，取4mm筛下和2mm筛上垃圾颗粒，先在甲烷和 空气混合气中密闭驯化2周菌株的复壮。2.菌种富集与优化实验1)富集培养称取矿化垃圾Ig放入100ml匪S培养基中，置于30°C、160rpm摇床 振荡2h。取菌悬液2ml作为种子接入分装了 20ml匪S培养基的100ml血清瓶中，加盖橡胶 塞密封；用20ml甲烷气置换瓶内20ml空气，然后在30°C、160rpm条件下振荡培养一周。2)纯菌分离用已冷却的无菌蒸馏水对菌液进行10倍系列稀释，制成稀释度为 10-1、10-2的稀释液。采用倾注法进行匪S培养基培养。将平板倒置于真空干燥器中，并 向干燥器中通入一定量的甲烷，然后用保鲜膜封口。将干燥器置于生化培养箱中，30°C培养 4 5天。将长势好的菌种进行多次传代，纯化。3)优化实验利用纯菌株制备一定浓度的菌悬液，加入到装有一定量匪S培养基 的血清瓶中；用甲烷置换瓶内空气，之后具塞密封。在30°C、160rpm条件下振荡培养。间隔 一段时间检测菌液浓度以及生物气浓度。随着甲烷的消耗，需定期补充一定体积的氮气，以 消除瓶中负压。3菌种鉴定实验使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (Code No. D310)进行PCR扩增目的片段。取5 μ 1进行3 %琼脂糖凝胶电泳，使用TaKaRaAgarose GelDNAPurification Kit Ver. 2. O (Code No. DV805A)切胶回收目的片段进行DNA测序。DNA 的测序委托大连宝生物公司完成。Wkq Forward,Seq Reverse、Seqhternal为引物进行 DNA测序。4检测方法菌液的OD值采用UV2000分光光度计检测，波长为560nm。活细胞浓度采用平板 菌落计数法确定。菌体干重通过一定体积的菌液在80°C下烘干至恒重，用精密电子天平称 量。每个实验最少做2组平行试验，确保RSD小于5%。甲烷的检测采用气相色谱(安捷伦6890N)。色谱条件⑶X不锈钢柱(IOmX 2mm)， 进样口温度、柱温以及检测器(TCD)温度分别为80、50、120°C，氢气为载气，流速为25ml/ min,进样量 0. 5ml。实施例1.金黄杆菌Chryseobacterium sp. JT03的纯化与鉴定该菌株属革兰氏阴性、菌落圆形凸起或扁平，黄色、白色或桔黄色，边缘光滑，透明 有光泽，菌落直径Imm左右；菌体杆状或椭圆形、不运动，好氧、化能异养型细菌。细胞宽约 0. 4 0.6 μ m，长约1.0 1.3μπι。扫描电镜照片见图1。对菌株JT03的PCR产物进行3 %琼脂糖凝胶电泳(图2)，可以看到PCR产物的凝 胶条带非常清晰。菌株DNA的测序委托大连宝生物公司完成，金黄杆菌JT03的16S rDNA 碱基测定的长度为664bp，碱基序列在GenBank核酸序列数据库进行比较发现与金黄杆菌 属(Chryseobacterium sp.)的3个菌株的同源性在99%以上。表 IChryseobacterium sp. JT03 的理化特性
权利要求
1.一种可利用甲烷的金黄杆菌，其特征在于，其保藏号为CCTCCNo. M2010100。
2.根据权利要求1所述的可利用甲烷的金黄杆菌，其特征在于，其16SrDNA序列如SEQ ID NO 1 所示。
3.根据权利要求1或2所述的可利用甲烷的金黄杆菌，其特征在于，菌落直径 0. 8-1. 2mm,圆形凸起或扁平，黄色或白色或桔黄色，透明有光泽；菌体杆状或椭圆形，不运 动，好氧、化能异养型细菌；细胞宽0.4 0.6μπι，长1.0 1.3μπι;革兰氏染色阴性。
4.权利要求1所述的可利用甲烷的金黄杆菌在制备甲烷生物吸收剂中的应用。
5.权利要求1所述的可利用甲烷的金黄杆菌在垃圾处理中的应用。
6.权利要求1所述的可利用甲烷的金黄杆菌在制备生物催化剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种可以利用甲烷的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)JT03，该菌株保藏号为CCTCC No.M2010100。其可用于制备甲烷生物吸收剂、垃圾处理剂、生物催化剂。该金黄杆菌克服了甲烷氧化菌菌体密度低，菌体难于扩大培养等应用困难，对甲烷有较高的亲和性。特别适用于生活垃圾填埋场、水稻田等甲烷人为源，可以广泛推广。
文档编号C12R1/01GK102071161SQ20101026011
公开日2011年5月25日 申请日期2010年8月23日 优先权日2010年8月23日
发明者全学军, 张丽杰, 赵天涛, 赵由才, 邓郁平 申请人:重庆理工大学