金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株金黄杆菌（Chryseobacterium?sp.CA49，保藏号为CCTCC?M2012484）及该菌基因组编码的一种羰基还原酶ChKRED20，并利用该菌原始菌株或该种羰基还原酶作为生物催化剂制备阿瑞匹坦手性醇中间体(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。产物的对映体过量值大于99.9%。以ChKRED20粗酶粉可催化高达200g/L的底物，24h内获得99%以上转化率，且辅酶循环体系简单、廉价，产物分离提纯容易，回收率高，极具工业应用前景。
【专利说明】金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产【技术领域】[0001]本发明属于应用微生物与酶工程领域，具体涉及一株金黄杆菌及其基因组编码的一种新型羰基还原酶，并利用该菌或者这种羰基还原酶作为生物催化剂生产阿瑞匹坦手性中间体。【背景技术】[0002]光学活性(R)-l-[3，5_ 二(三氟甲基)苯基]乙醇是Merk公司研发的药物阿瑞匹坦(Aprepitant,商品名“Emend”)的关键手性中间体。阿瑞匹坦的主要功能是预防和治疗化疗引起的急性或延迟性呕吐。[0003]目前制备该手性中间体的主流工艺是化学合成。近年来，随着生物催化技术的不断发展，研究者们积极探索采用酶催化前手性酮的方法生产该中间体，筛选到了一些对映体选择性>99%的微生物菌株，包括Lactobacillus Kefir、Aspergillus niger (Tetrahedron:Asymmetry,2006,17, 2000-2005), Penicillium expansum (Tetrahedron: Asymmetry,2009, 20, 2759-2763), Leifsonia xy I i HS0904 (Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 90, 1897-1904),氧化微杆菌 Microbacterium oxydans C3 (专利号 ZL201010271579.7),以及选择性稍差的热带假丝酵母菌Candida tropicalis20216 (ee 值>92%，Tetrahedron, 2004，60，789-797)等。但是，这些报道都是以微生物菌株全细胞作为生物催化剂，可转化的底物浓度较低，目前仅有Leifsonia xyli HS0904转化的底物浓度较高，最高可转化的底物浓度为51g/L，30h的转化率为91.8% (J.Microbiol.Biotechnol.2013, 23 (3)，343-350)。考虑产物分离纯化成本问题，这些菌株的转化能力与实际应用还有较大的距离。[0004]为获得高效的前手性酮催化工艺，首先应解决高效高选择性酶源问题，从环境中筛选新型微生物菌株作为催化剂是常用的有效途径之一。然而原始菌株直接转化可能存在安全性、遗传稳定性问题，原始菌株可能继续利用醇产物导致产物产量低以及原始菌株内的其他酶可能对底物作用生成副产物等问题，因此将原始菌株的关键羰基还原酶基因克隆并异源表达，以重组菌或者酶用于生物转化则可避免上述问题，且这种催化体系较为简单， 稳定，产物分离提纯容易，易于工业化。
【发明内容】
`[0005]本发明的目的是公开一种新筛选的金黄杆菌CA49(Chryseobacterium sp.CA49), 及其所产高活力高对映选择性羰基还原酶ChKRED20，并利用该菌或者该酶还原底物 3，5-双三氟甲基苯乙酮制备光学纯(R)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，从而以生物催化的方法制备高光学纯度的阿瑞匹坦手性中间体。该菌从果园土壤中富集、分离并经过多轮筛选后获得。关于该菌的保藏信息是:保藏号为CCTCC M2012484 ;分类命名为金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49);于2012年11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，地址是湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。[0006]基于上述发明目的，本发明首先提供一种金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)，保藏编号为 CCTCC M2012484)。
[0007]本发明还提供了上述金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)的筛选方法， 所述筛选方法为:于果园采集土样，以3，5-双三氟甲基苯乙酮为唯一碳源，经2轮富集筛选获得可能的产酶菌株。将初筛菌株培养后，以休止细胞为催化剂转化底物，测定产物生成量和产物对映体过量值,并将产物对映体过量值高的菌株进行进一步的鉴定,得到本发明涉及的金黄杆菌。
[0008]本发明还提供一种上述金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)作为生物催化剂在转化底物3，5-双三氟甲基苯乙酮生成(R)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。
[0009]具体地，上述用途的操作方法为:将筛选的金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)培养后，收集菌体，以休止细胞作为催化剂，并添加异丙醇和葡萄糖作为辅酶循环底物，底物3，5-双三氟甲基苯乙酮经生物转化后得到(R)-1-[3，5-二(三氟甲基)苯基] 乙醇，产物的对映体过量值>99%。
[0010]另外，本发明还提供一种羰基还原酶ChKRED20。该酶是从上述金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)中调取出来的。
[0011]本发明还提供一种上述羰基还原酶ChKRED20作为生物催化剂在转化底物3，5-双三氟甲基苯乙酮生成(R)-l_[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。
[0012]其中，从上述金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)中关键羰基还原酶基因ChKRED20的调取和生物转化包括以下步骤:
[0013](I)基因chKRED20的调取和鉴定:
[0014]将上述金黄杆菌CA49(Chryseobacterium sp.CA49)全基因组测序(深圳华大基因公司完成)，根据测序框架图预测的基因功能，调取出40余个可能`具有羰基还原酶功能的基因，将这些基因用常规PCR方法克隆，并连入pET28a ( + )载体，转入大肠杆菌BL21 (DE3) 中以常规方法过量表达。将这些重组菌休止细胞作为催化剂转化3，5-双三氟甲基苯乙酮， 获得R-型醇产物且ee值大于99%的酶有3个(ChKRED08、ChKRED 19, ChKRED20)。在培养基中加入或者不加入3，5-双三氟甲基苯乙酮，以新鲜培养的菌提取总RNA，通过RT-PCR分析，两种情况下均只有ChKRED08和ChKRED20酶的基因表达(总RNA提取和RT-PCR方法均为常规方法)。同时，测定了 ChKRED08和ChKRED20酶的活力，ChKRED20酶活是ChKRED08的 7倍左右。因此,最后确定金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)中关键羰基还原酶基因为chKRED20。
[0015]其中，上述步骤中涉及的chKRED20基因PCR扩增所用引物为:正向5' -GAATTCAT GGGAATTTTAGACAACAAAGTAGC-3'(酶切位点 EcoR I)，反向 5' -GTCGACTTAAACTGCCGTGTAGC CACC-3'(酶切位点 Sal I);
[0016]PCR 条件为，95°C预变性 5min，94°C变性 30s，55。。退火 30s，72。。延伸 Imin, 30 个循环，最后72°C延伸lOmin。PCR产物连入pMD19T载体构建TA克隆，而后将测序正确的质粒以EcoR I和Sal I酶切，将其连入以同样酶消化的pET28a( + )空载体中，构建重组质粒， 并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中，构建重组菌。
[0017]chKRED20基因碱基数为750bp，其序列为(SEQ N0.1)[0018]ATGGGAATTTTAGACAACAAAGTAGCACTTGTTACAGGAGCAGGATCCGGAATCGGATTAGCTGTTGCT CATTCGTATGCAAAAGAAGGCGCCAAAGTTATTGTATCCGATATTAATGAAGATCACGGTAACAAAGCAGTCGAAGA CATTAAAGCACAAGGCGGGGAAGCGTCTTTT GTAAAAGCAGATACTTCAAACCCTGAAGAAGTGGAAGCTTTAGTA AAAAGAACAGTAGAAATCTACGGAAGACTTGATATTGCATGTAATAATGCGGGAATCGGTGGCGAACAGGCGCTGGC AGGCGATTACGGTCTCGACAGCTGGCGAAAAGTATTAAGCATAAATCTTGATGGCGTATTCTACGGGTGCAAATATG AGTTAGAACAAATGGAAAAAAACGGGGGCGGCGTTATTGTGAATATGGCCTCTATTCATGGTATTGTTGCTGCACCG CTTTCCTCAGCCTACACTTCTGCAAAGCACGCAGTGGTAGGGCTTACTAAAAATATAGGAGCAGAATACGGACAGAA AAATATCCGTTGCAATGCGGTGGGGCCTGCTTATATTGAAACCCCGCTGTTGGAAAGCCTGACAAAGGAAATGAAGG AAGCACTGATTTCAAAACATCCGATGGGAAGACTGGGAAAACCTGAAGAAGTAGCAGAACTGGTGTTGTTCCTGAGT TCAGAAAAATCATCTTTTATGACGGGAGGCTATTATCTTGTAGATGGTGGCTACACGGCAGTTTAA ；[0019]chKRED20基因编码249个氨基酸，序列为(SEQ N0.2):[0020]MGILDNKVALVTGAGSGIGLAVAHSYAKEGAKVIVSDINEDHGNKAVEDIKAQGGEASFVKADTSNPEE VEALVKRTVEIYGRLDIACNNAGIGGEQALAGDYGLDSWRKVLSINLDGVFYGCKYELEQMEKNGGGVIVNMASIHG IVAAPLSSAYTSAKHAVVGLTKNIGAEYGQKNIRCNAVGPAYIETPLLESLTKEMKEALISKHPMGRLGKPEEVAELV LFLSSEKSSFMTGGYYLVDGGYTAV。[0021](2)重组菌生物催化:[0022]挑取单克隆至LB(含卡那霉素50 μ g/ml)培养基中，37°C过夜培养，以1%的接种量转接至TB (含卡那霉素50 μ g/ml)培养基中，37°C培养3h，加入0.5mM IPTG诱导后，30°C 继续培养至20~36h。8000rpm，4°C离心收集菌体，用pH值为7.0,0.1M浓度的磷酸钾缓冲溶液洗涤2次，获得湿菌体。[0023]取上述新鲜培养的湿菌体重悬于上述缓冲液，加入底物3，5-双三氟甲基苯乙酮， 加入1%~3% (w/v,占总转化体系的质量体积百分数)葡萄糖和/或5%异丙醇(v/v，占总转化体系的体积百分数)作为辅酶循环底物。转化体系中菌体浓度为50~150g/L，底物终浓度为I~150g/L，转化温度为30°C，转速为230rpm，转化时间为I~24h。[0024](3) ChKRED20酶的辅酶依赖型和比活力测定[0025]ChKRED20酶的纯化采用镍柱亲和层析(Bio-Rad)。将上述步骤(2)诱导培养20~ 36h后的菌体以13，000rpm，4°C离心收集，重悬于Buffer A (50mM磷酸盐缓冲液，pH8.0， 300mM NaCl，IOmM咪唑)，超声破碎(超声10s，间隔30s，30次)，之后以13，OOOrpm，4°C离心 20min，将上清液加入已用Buffer A平衡的柱料中，轻微混匀30min，用含有20mM咪唑的 Buffer A漂洗杂蛋白，再用含250mM咪唑的Buffer A的缓冲液洗脱目的蛋白，最后电泳鉴定纯度，并用BCA Protein Assay kit测定蛋白`浓度。[0026]辅酶依赖型的确定:磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.0)，加有0.2mg/ml纯酶，IOmM底物和20mM NADH或者NADPH，30°C反应2h。等体积乙酸乙酯萃取，测定产物的转化率。以NADH 为辅酶时，转化率为76% ;以NADPH为辅酶时，转化率为56% ;两者的ee值均大于99.9%，因此该酶以NADH为辅酶时转化率更高。[0027]比活力测定反应条件:1ml磷酸钾缓冲液(0.1Μ，ρΗ7.0)加有0.2mg纯酶，IOmM底物和40mM NADH，30°C反应lmin。等体积乙酸乙酯萃取，测定产物的生成量。酶活力单位定义为:lmin内催化生成I μ mo I产物所需的酶量。ChKRED20纯酶的比活力达到43U。[0028](4)粗酶粉生物催化:[0029]表达ChKRED20酶的大肠杆菌重组菌的菌体培养、获得湿菌体的步骤同步骤(2)。
[0030]取新鲜培养的湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液(pH7.0,0.1M)，湿菌体终浓度为50~ 150g/L,以超声破碎机破细胞，13，OOOrpm离心后取上清液冷冻于_80°C过夜，而后用冷冻干燥机干燥至粉状，制成粗酶粉。转化体系为:磷酸钾缓冲液(0.1M，PH7.0)，粗酶粉，底物 3，5-双三氟甲基苯乙酮，异丙醇(辅酶循环底物，用量为40%，v/v), Na-NAD (200mg/L);转化条件:30°C, IOOrpm, 24h。
[0031]粗酶粉用量为10g/L，底物3，5-双三氟甲基苯乙酮浓度为200g/L，转化24h可实现转化率>99%, ee值>99.9%。
[0032]本发明涉及的金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)可高效转化3，5_双三氟甲基苯乙酮生成R-醇，其关键羰基还原酶基因chKRED20与NCBI数据库中其他基因的相似度最高70%，氨基酸序列的最高相似度为76%，与已报道的功能蛋白(NCBI登录号为: BAD99642)的最高相似度为51%，为(R)-l_[3，5_ 二(三氟甲基)苯基]乙醇生物催化合成提供了可供选择的新型酶源。
[0033]该蛋白在大肠杆菌中过量表达后制成粗酶粉，10g/L的酶量便可在24h内转化高达200g/L的底物，且转化率为99%以上，ee值大于99.9%。粗酶转化工艺简单，以廉价异丙醇和少量NAD+作为辅酶循环，产物易于分离纯化，回收率高达90%以上，极具工业应用前
旦
o
[0034]凡是与ChKRED20氨基酸相似度高于51%且具有催化3，5_双三氟甲基苯乙酮生成 (R)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇功能的酶均属于本发明的保护范围。
[0035]图1是ChKRED20蛋白纯化后SDS-PAGE图。`【专利附图】
【附图说明】
[0036]以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。
【具体实施方式】
[0037]实施例1:菌株筛选
[0038]于某果园采集土样，以3，5-双三氟甲基苯乙酮(2g/L)为唯一碳源并添加无机盐于 30°C，230rpm 培养 7 ~10 天。无机盐为:Na2HP042g/L，KH2PO41 g/L, NH4Cl0.4g/L， MgCl20.4g/L。从富集液中取出1%加入到上述相同培养基中再次富集培养7~10天。而后将培养液稀释IO4倍，并涂布至筛选平板上(上述无机盐+3，5-双三氟甲基苯乙酮lg/L + 酵母粉0.5g/L +琼脂粉15g/L)，30°C培养I~3天，每支平板上可见许多微生物单菌落，这些菌株为可能的产酶菌株。
[0039]将富集平板中的单菌落用无菌牙签逐一接入24孔筛选板各孔(Costar，美国)进行培养(每孔装有发酵培养基1ml，发酵培养基组分:蛋白胨5g/L，牛肉膏1.5g/L，酵母粉
1.5g/L, NaC15g/L,葡萄糖 10g/L), 30。。, 240rpm 培养 24h。6000rpm 离心收集菌体，用磷酸钾缓冲液(pH7.0,0.1M)洗涤2次，再加入Iml缓冲液重悬菌体，而后加入底物3，5-双三氟甲基苯乙酮5mg, 30°C, 270rpm进行生物催化筛选试验。转化36h后，以200 y I乙酸乙酯萃取。以气相手性柱分析产物的对映体过量值，得到产(R)-醇菌株5株。其中I株为本发明涉及的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.CA49),产物对映体过量值大于99%。
[0040]实施例2:筛选菌株的鉴定
[0041]为确定该菌株分类地位并详细了解其性能，对该菌株进行了初步鉴定。该菌株的菌落为圆型，光滑，随培养时间不同，菌落呈浅黄色到金黄色。
[0042]16S rRNA鉴定:基因组DNA为模板，以细菌通用引物27f和1492r扩增16S rRNA 序列，并将PCR产物直接送样测序，获得的部分序列(1381bp)如下(SEQ N0.3):
[0043]AGCTGAGCGGTAGAGTTTCTTCGGAGACTTGAGAGCGGCGTACGGGTGCGGAACACGTGTGCAACCTGC CTTTATCAGGGGGATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCCCATAATATATAGAGTGGCATCACTTTATATTGAAA ACTGAGGTGGATAAAGATGGGCACGCGCAAGATTAGATAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGTCGATGATCTTTA GGGGGCCTGAGAGGGTGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAAT ATTGGACAATGGGTTAGCGCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGAAGGACGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTG TACAGGGATAAACCTATTTACGTGTAAATAGCTGAAGGTACTGTACGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGATCTGTAAGTCAG TGGTGAAATCTCACAGCTT AACTGTGAAACTGCCATTGATACTGCAGGTCTTGAGTAAGGTAGAAGTGGCTGGAAT AAGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTACTTAGAACACCAATTGCGAAGGCAGGTCACTATGTCTTAACTGAC GCTGATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGCTAACTCGTT TTTGGGCTTTCGGGTTCAGAGACTAAGCGAAAGTGATAAGTTAGCCACCTGGGGAGTACGAACGCAAGTTTGAAACT CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGATTATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAAG GCTTAAATGGGAATTGATCGGTTTAGAAATAGACCTTCCTTCGGGCAATTTTCAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAG CTCGTGCCGTGAGGTGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCCTGTTACTAGTTGCTACCATTAAGTTGAGGA CTCTAGTAAGACTGCCTACGCAAGTAGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGCCTTGGGC CACACACGTAATACAATGGCCGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCAAATCTCGAAAGCCGGTCTCAGT TCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATA CGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC`GTCAAGCCATGGAAGTCTGGGGTACCTGAAGTCGGTGACCGTAAAAGGAG CTGC
[0044]经NCBI的 blast 比对，该菌与 Chryseobacterium taiwanense, Chryseobacterium sp.MG-2011-139-ER、Chryseobacterium sp.HNRl2 等菌株的同源性大于 99%,初步可确定为 Chryseobacterium sp.金黄杆菌属，实验室自编号为 Chryseobacterium sp.CA49, 2012 年 11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M2012484。
[0045]实施例3:金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)原始菌株生物催化
[0046]菌株培养:将少量金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)斜面种子接种于发酵培养基中(组分同实施例1 )，30°C，230rpm培养16~24h制备种子液，以0.5%~2%的接种量转接至发酵培养基中扩大培养，培养条件:30°C，230rpm，24~48h。
[0047]休止细胞转化:将第I步培养的菌体以13，OOOrpm离心收集，用pH值为7.0,0.1M 浓度的磷酸钾缓冲溶液洗涤2次。转化体系包括磷酸盐缓冲液(pH值7.0,0.1M)、菌体、底物和辅酶循环底物。辅酶底物为5%~10% (v/v)的异丙醇和2%~5% (v/w)的葡萄糖。菌体浓度为50~200g/L，底物终浓度为I~50g/L，转化温度为30°C，转速为230rpm，转化时间为5~24h。以下为几种原始菌株休止细胞转化的具体实施例:
[0048](I)取菌体0.5g重悬于IOml缓冲液,加入底物3，5_双三氟甲基苯乙酮IOmg,并加入异丙醇0.5ml (5%)和葡萄糖0.2g (2%)，30°C，230rpm转化5h。以IOml乙酸乙酯萃取，取有机相气相色谱(SGE，澳大利亚，AC-5,30mX0.22)测定转化率为95.6%，气相手性柱 (CHIRASIL-DEX CB，瓦里安 25mX0.25)测定产物 ee 值大于 99%。[0049].夕入CF,印人、,'O,[0050]产物数据如下:[0051]无色液体，[a]D25=+21.6(c=l，乙腈)；[0052]ee>99%(CHIRASIL-DEX CB,柱温:120 °C，进样器:260 °C,检测器:280 °C， t=8.403min);[0053]IH NMR (600MHz, CDCl3): δ 7.84 (s, 2H, Ar-H)，7.78 (s, 1H, Ar-H)，5.04 (q, J=6.54Hz ，1H, -CH)，1.99 (br, 1H, OH)，1.55 (d, J=6.54Hz, 3H, -CH3)[0054](2)取菌体1.0g重悬于IOml缓冲液中，加入底物lOOmg，葡萄糖和异丙醇添加量同上，转化条件和分析方法也同上。底物的转化率为91.5%，产物对映体过量值大于99%。[0055](3)取菌体1.5g重悬于IOml缓冲液中，加入底物500mg，并加入异丙醇1.0ml (10%)和葡萄糖0.5g (5%)，30°C，230rpm转化24h。以IOml乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为90.8%，产物对映体过量值大于99%。[0056]实施例4:羰基还原酶ChKRED20重组菌全细胞生物催化[0057]羰基还原酶ChKRED20重组菌的培养方法和菌体收集方法见说明书
【发明内容】
部分。[0058](I)取菌体0.5g，重悬于IOml磷酸盐缓冲液，加入底物IOmg和0.1g葡萄糖，30°C， 230rpm转化2h。以IOml乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为30.1%，产物对映体过量值大于99.9%。[0059](2)取菌体0.5g，重悬于IOml磷酸盐缓冲液，加入底物10mg，0.2g葡萄糖和0.5ml 异丙醇，30°C，230rpm转化lh。以IOml乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为 29.5%，产物对映体过量值大于99.9%。[0060](3)取菌体1.0g,重悬于IOml磷酸盐缓冲液，加入底物500mg和0.2g葡萄糖， 30°C，230rpm转化24h。以IOml乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为88.2%，产物对映体过量值大于99.9%。[0061](4)取菌体1.0g,重悬于IOml磷酸盐缓冲液，加入底物500mg和0.5ml异丙醇， 30°C，230rpm转化24h。以IOml乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为79.1%，产物对映体过量值大于99.9%。[0062](5)取菌体1.5g,重悬于IOml磷酸盐缓冲液,加入底物1500mg和0.5ml异丙醇， 30°C，230rpm转化24h。以IOml乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为46.1%，产物对映体过量值大于99.9%。[0063]实施例5:羰基还原酶ChKRED20纯酶生物催化[0064]转化体系:磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.0)，纯酶浓度2g/L，底物3，5_双三氟甲基苯乙酮，异丙醇40% (V/V)，Na-NAD200mg/L，30°C生物转化。反应`结束后用等体积乙酸乙酯萃取，气相色谱分析转化率和ee值，结果见表1。
[0065]表1羰基还原酶ChKRED20纯酶对不同浓度底物转化
[0066]
【权利要求】
1.一种保藏号为 CCTCC M2012484 的金黄杆菌 CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)。
2.一种从权利要求1所述的金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)中调取出来的羰基还原酶ChKRED20，其特征在于其核苷酸序列为如SEQ N0.1所示，其氨基酸序列为如 SEQ N0.2 所示。
3.权利要求1所述的金黄杆菌CA49作为生物催化剂在转化底物3，5-双三氟甲基苯乙酮生成(R)-l_[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。
4.权利要求2所述的羰基还原酶ChKRED20作为生物催化剂在转化底物3，5-双三氟甲基苯乙酮生成(R)-l_[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK103497911SQ201310399109
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】吴中柳, 刘艳, 汤脱险, 裴小琼 申请人:中国科学院成都生物研究所