Gata4基因snp位点的用途
【专利摘要】本发明公开了GATA4基因SNP位点的用途。本发明公开的用途是rs867858和／或rs904018在制备先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用。本发明首次发现位于GATA4基因SNP位点rs867858和rs904018与先心病室间隔缺损相关。因此可通过GATA4基因SNP位点rs867858和rs904018的基因型来预测患者的先心病室间隔缺损易感风险性。本发明的检测试剂盒具有良好灵敏性、稳定性和特异性。本发明的试剂盒对未出生胎儿进行先心病室间隔缺损易感性的筛查，能有效起到风险预警、早期诊断、降低人口出生缺陷率的作用。
【专利说明】GATA4基因SNP位点的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及GATA4基因SNP位点的用途及相关试剂盒。
【背景技术】
[0002]先天性心脏病(CHDs)是指在胎儿期心脏和(或)胸内大血管就存在严重的结构异常，从而导致一系列血流动力学障碍或功能性障碍的一种出生缺陷性疾病，它是造成发展中国家儿童死亡最常见的原因之一，其国内患病率为0.13% -1.38%,国外统计为0.4%-5%。先天性心脏病有很多类型，包括室间隔缺损(Ventricular septaldefect, VSD)、房间隔缺损(Atrial septal defect, ASD)、动脉导管未闭(Patent ductusafteriosus, PDA)、肺动脉瓣狭窄(Pulmonary stenosis, PS)、主动脉缩窄(Coarctationof aortic, CoA)、大动脉转位(Transposition of the great arteries, TGA)、法洛四联症(Tetralogy of Fallot, T0F)、右室双出口(Double—outlet right ventricle, D0RV)等。其中室间隔缺损居先天性心脏缺损首位。
[0003]室间隔缺损最早是Dalrymple在1847年报道的，它指心室的间隔部分因组织缺损形成异常开口而引起心室间异常血流交通，从而造成血液自左向右分流，导致血流动力学异常的一种先天性心脏缺损。正常情况下，右房收集来自全身各部位的氧含量较低的静脉血(缺氧血)，流经右室然后泵入肺中进行气体交换。经过肺换气后，来自肺脏中的氧含量较高的动脉血(充氧血) 流入左房，再流经左室，然后通过大动脉被泵入到身体的其他区域，以供给身体各部位的正常活动。当出现室间隔缺损时，由于左室的压力高，左室内的充氧血就会通过间隔上的异常开口而进入右室，这就导致额外的血液通过右室泵入肺中，从而造成肺充血。
[0004]单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism, SNP)是指存在于某一(些)群体、正常个体的基因组DNA中单碱基的序列差异，并且在人群中的分布频率至少要在1%以上(Brookes AJ.Gene，1999，234 (2):177—186)，人类遗传基因的多态性在遗传信息上的本质表现，90%以上是由SNP所引起的。因为其多态信息量大，目前已成为继限制性片段长度多态性(RFLP)标志和微卫星即短串联重复(STR)标志后的第三代遗传标志。
[0005]从基础医学到临床医学的各个领域，SNP都存在巨大的应用价值。SNP的研究为基因诊断，尤其是疾病的早期诊断提供更多依据有重要意义。SNP由于其分布广、密度高而被期望在诸如癌症、糖尿病、高血压、忧郁症和哮喘等复杂疾病的研究中起重要作用，这些复杂疾病是多个遗传变异位点与环境因子共同作用的结果，由于发病原因复杂，涉及的基因数量多，已成为国际上疾病基因组学研究的重点。目前已有实验将SNP应用于肿瘤预后及易感性的判断，例如肺癌致癌物的易感性存在个体差异，即肺癌的基因易感性，研究较多的是代谢酶基因多态性，如人细胞色素P450-CYP450和髓过氧化酶MPO等。法国研究者证实，MPO基因启动子(463G / A)多态性导致该基因较低的表达，可以降低肺癌患病的危险性(ChewierI，Stucker !,Houllier AM,et al.pharmacogenetics,2003,13(2):729-739)。日本学者发现了 HER-2基因编码区的一个SNP与胃癌的发展及恶性程度有关(Kuraoka K，Matsumura S, Hamai Y,et al.1ht J Cancer,2003,107(4):593-596)。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是为胎儿先心病室间隔缺损易感性的早期诊断提供一种检测方法及相关试剂盒。
[0007]下述应用都是本发明所要保护的内容:
[0008]UGATA4基因SNP位点rs867858和/或rs904018在制备先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用。其中，GATA4基因SNP位点rs867858的基因型为T / G时，先天性心脏病易感性增加；GATA4基因SNP位点rs904018的基因型为G / G时，先天性心脏病易感性降低。
[0009]2、GATA4基因SNP位点单倍型在制备先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用。其中，单倍型为rs8678586 / rs904018G时，先天性心脏病易感性降低。
[0010]3、GATA4基因SNP位点rs867858在制备女性先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用。其中，GATA4基因SNP位点rs867858的基因型为T / G时，女性先天性心脏病易感性增加。
[0011]4、GATA4基因SNP位点rs904018在制备男性先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用。其中，GATA4基因SNP位点rs904018的基因型为G / G时，男性先天性心脏病易感性降低。
[0012]5、检测GATA4基因SNP位点rs867858和/或rs904018的物质在制备先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用。其中，GATA4基因SNP位点rs867858的基因型为T / G时，先天性心脏病易感性增加；GATA4基因SNP位点rs904018的基因型为G / G时，先天性心脏病易感性降低。
[0013]6、检测GATA4基因SNP位点rs867858的物质在制备女性先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用。其中，GATA4基因SNP位点rs867858的基因型为T / G时，女性先天性心脏病易感性增加。
[0014]7、检测GATA4基因SNP位点rs904018的物质在制备男性先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用。其中，GATA4基因SNP位点rs904018的基因型为G / G时，男性先天性心脏病易感性降低。
[0015]上述任一所述应用中，所述先天性心脏病的类型为室间隔缺损。
[0016]本领域技术人员能通过检测SNP位点的任何方法或技术来检测GATA4基因SNP位点。例如，Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性PCR-HRM或联合应用上述方法。
[0017]本发明还具体提供了一种先天性心脏病易感性的诊断试剂盒。
[0018]该诊断试剂盒，包括检测GATA4基因SNP位点rs867858和/或rs904018的物质。
[0019]其中，所述检测GATA4基因SNP位点rs867858和/或rs904018的物质包括基因组DNA抽提试剂、PCR扩增引物对、PCR反应体系试剂、和HRM荧光染料试剂。
[0020]所述PC`R 扩增引物对如 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQID N0.4 和 SEQ ID N0.5所示。[0021]所述PCR反应体系试剂包括dNTP、MgCl2, realstart酶、PCR反应缓冲液；
[0022]所述HRM 突光染料选自 Eva Green、Syto9、Resol ight 和 SupperGreen ；
[0023]上述试剂盒中，所述先天性心脏病的类型为室间隔缺损。
[0024]上述任一所述试剂盒在制备先天性心脏病易感性的诊断产品中的应用、上述任一所述试剂盒在制备男性先天性心脏病易感性的诊断产品中的应用、或上述任一所述试剂盒在制备女性先天性心脏病易感性的诊断产品中的应用也都是本发明所要保护的内容。
[0025]本发明的优点为:本发明首次发现位于GATA4基因SNP位点rs867858和rs904018与先心病室间隔缺损相关。因此可通过GATA4基因SNP位点rs867858和rs904018的基因型来预测患者的先心病室间隔缺损易感风险性。本发明的检测试剂盒具有良好灵敏性、稳定性和特异性。本发明的试剂盒对未出生胎儿进行先心病室间隔缺损易感性的筛查，能有效起到风险预警、早期诊断、降低人口出生缺陷率的作用。
【具体实施方式】
[0026]以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0027]I材料与方法
[0028]1.1研究对象
[0029]收集2008年3月至 2009年9月甘肃省人民医院心脏外科203位汉族先心病室间隔缺损的患者为病例组，所有患者均经心外科富有经验的专家通过其病史询问、体格检查、胸部X线检查、12导联心电图检查、彩色多普勒超声心电图检查，最后经手术确诊。正常对照组201例。本研究经医院伦理委员会批准，所有受试者或家属均知情同意。
[0030]1.2主要试剂
[0031]全血基因组DNA提取试剂盒北京百泰克；QuickGene DNA whole blood kit SFujifilm ；Realstart Taq DNA poiymerase 南京 GenScript ；Pfu DNA Polymerase 南京 GenScript ；dNTP Mixture, IOmM each 南京 GenScript ；Taq DNA Polymerase 大连TaKaRa ;dNTP Mixture, 2.5mM each 大连 TaKaRa ;Hot Taq DNA Polvmerase BBI ；Taq DNAPolvmerase BBI ；Taq DNA Polvmerase 北京天根；HotStart Taq PCR MasterMix 北京天根；TrueStart Hot Start Taq DNA Polymerase Fermentas ；EvaGreen Dye (20 X) Biotium ；Fast EvaGreen Master Mix for qPCR and HRM Biotium ；SupperGreen Dye (20X)厦门百维信；LCGreen plus Dye(IOX)Idaho ；Anti—CCP ELISA kit 上海沪峰；Anti—MCV ELISAkit上海沪峰；Roche capillary Roche ；DNA marker BBI ；SDNAClear Nucleic Acid StainBBI ；Agarose上海生工；Water — DEPC上海生工；RF检测试剂盒上海捷门；
[0032]1.3主要仪器
[0033]Rotor一Gene 6000 突光定量 PCR 仪 Corbett (澳大利亚);Lightcyclerl.5 突光定量PCR仪Roche (瑞士)；黑金刚梯度PCR仪北京东胜创新；QuickGene—Mini80核酸提取仪 Fujifilm(日本);Centrifuge5424 台式高速离心机 Eppendorf (德国);PE_2400PCR 仪PE (美国)；2F-258全自动凝胶成像系统上海嘉鹏；微量核酸电泳系统Bio — Rad(美国)；Nanodrop2000微量核酸蛋白检测仪；Thermal scientific (美国)
[0034]实施例1、PCR — HRM检测体系
[0035]1.1基因组DNA的提取(参考试剂盒说明书)
[0036]1.2引物设计与合成
[0037]选择GATA4基因rs867858进行PCR — HRM检测体系的建立。通过美国国家医学图书馆 Pubmed 引擎(http://www.ncb1.nlm.nih.gov / sites / snp)检索到其侧翼序列，在线软件 Primer3 (http://frod0.w1.mit.edu/primer3)进行引物设计。GATA4 基因引物:CCTAGACCGTGGGTTTTGCATTGTGTTTC /://genome, ucsc.edu)验证其特异性后交南京金斯特公司合成，引物浓度调整到20yM-20°C保存。另合成GATA4基因rs904018位点突变基因(长度80bp)作为阳性对照。
[0038]1.3检测体系酶系统的选择
[0039]酶系统分别以不同生物技术公司出售的Taq酶和hot Start Taq酶进行常规PCR反应，以Biotium公司生产的HRM专用试剂盒Eva Green Master Mix作为对照进行比对，在扩增效率好，特异性高的基础上，选择成本较低酶系统。
[0040]1.4检测体系荧光染料的选择
[0041]PCR荧光染料的选择是在PCR扩增体系酶系统确定的基础上进行选择，判断依据是PCR扩增效率(观察荧光扩增曲线的陡度和S曲线)、PCR产物的特异性(观察熔解曲线和熔解峰并进行琼脂糖凝胶电泳验证)。
[0042]1.5检测体系PCR扩增条件的优化
[0043]A.Mg2+ 的优化
[0044]Mg2+浓度从1.5mmol / L(mM)开始到4.0mM，每个梯度增加0.5mM，共有六个梯度即
1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM和4.0mM。最适Mg2+浓度依据PCR扩增效率和产物的特异性进行确定。
[0045]B.退火温度的优化
[0046]退火温度从54°C开始，每次增加1°C，依据PCR扩增效率和产物特异性进行确定。
[0047]C.引物浓度的优化
[0048] 引物浓度从0.2—0.9 μ M选择三个点进行优化，一旦出现扩增效率低，就需要进行上下游引物比例的调整。
[0049]D.模板上样量的优化
[0050]按照模板不超过总体积I / 10的原则，选择0.5—1.0μL进行优化，选择扩增效率最佳的模板浓度。必要时可稀释模板。
[0051 ] Ε.PCR扩增条件的优化
[0052]首先进行两步法和三步法的选择，再依据扩增效率、产物特异性、产物熔解温度和GC含量进行优化,必要时加入Enhancer。
[0053]1.6检测体系HRM熔解条件的优化
[0054]PCR后直接进入HRM。在第一次扩增后进行普通熔解曲线(Melting:70~95°C )，判断PCR产物Tm的范围，以±3°C确定HRM的高分辨熔解范围；第二次根据PCR产物高分辨溶解产生的杂合峰调 HRM 条件(first hold temperature:10 ~120second, second holdtemperature:30 ~6Osecond, HRM:Tm-3<>C~Tm+3<>C )，最后确定 HRM 条件。
[0055]1.7PCR—HRM检测体系的确定与验证
[0056]A.特异性
[0057]PCR扩增产物的特异性通过溶解曲线峰的单一性、琼脂糖电泳和测序进行判断。
[0058]B.批内重复性 [0059]同一标本在同一批检测中重复检测5 — 10次，依据标准化熔解曲线的重合度以及Tm值的变异来判断。(最终以能否正确进行基因分型为标准)
[0060]C.批间重复性(再现性)
[0061]同一标本在不同批次检测中重复检测3次以上，依据标准化熔解曲线和熔解分型的相似程度来判断。(最终以能否正确进行基因分型为标准)
[0062]D.测序验证
[0063]将PCR产物送上海生工生物技术公司测序，测序结果应用Chromas软件分析。
[0064]2、结果:
[0065](I)、酶系统
[0066]以biotium的Eva Green Master Mix作为参照，与天根生物技术公司的普通Taq酶进行比对，发现尽管天根Taq酶扩增效率高，但其PCR产物特异性不如EvaGreen Mix,而且存在引物二聚体。说明在进行PCR — HRM时，最好选择热启动酶，以保证PCR产物的均一性。
[0067]热启动酶realstart在扩增效率、PCR产物的特异性和产量方面都优于Truestart,而后者无论在哪一方面都是低效,不能很好的与EvaGreen染料匹配。
[0068]相对而言，Realstart热启动酶与EvaGreen荧光染料匹配扩增效率、PCR产物特异性，基本一致，但价格方面要低于EvaGreen Mix,所以将Realstart酶系统与EvaGreen匹配组合成PCR-HRM检测系统是最佳选择。
[0069](2)、荧光染料
[0070]三种突光染料EvaGreen、Supper Green和Lc Green与realstart酶系统结合进行PCR — HRM，就其检测效能而言，都能达到HRM技术的检测要求，但三种染料的检测分辨率依次增强，价格也是依次升高。所以同等条件下，Eva Green为最适选择。
[0071]3、检测体系PCR扩增条件
[0072]A.Mg2+ 的优化
[0073]从扩增曲线和熔解曲线可以看出，突光染料EvaGreen除1.5mM的Mg2+不能扩增出产物外，其余浓度均能扩出PCR产物。其中2.5mM和3.0mM的扩增效率、产物特异性和产量接近，处于最佳状态。
[0074]从扩增曲线和熔解曲线可以看出，突光染料Lc Green除2.0mM的Mg2+不能有效扩增出产物，2.5mM的Mg2+扩增效率、产物特异性和产量均优于3.0mM的Mg2+，处于最佳状态。
[0075]从扩增曲线和熔解曲线可以看出，突光染料Supper Green除1.5mM-3.0mM的Mg2+均能有效扩增出产物，但就扩增效率、产物特异性和产量三个方面综合考虑，1.5mM的Mg2+处于最佳状态。
[0076]B.退火温度的优化
[0077]从梯度PCR结果可以看出60°C时目的条带很亮，非特异带没有，仅见引物二聚体。同加入荧光染料进行熔解曲线分析60°C时熔解峰最高，说明此温度为最适退火温度。
[0078]C.引物浓度的优化
[0079]退火温度优化时的引物浓度是0.5 μ M，出现引物二聚体，故上qPCR时调整到0.3 μ M，扩增效果极佳。
[0080]D.模板上样量的优化
[0081]从扩增曲线和PCR产物的特异性来看，IOng模板量是足够进行10 μ L体系的PCR反应。
[0082]Ε.PCR扩增条件的优化
[0083]PCR扩增条件为预变性96 °C 3min,变性95 °C 6sec,退火60 °C 6sec,延伸72°C 15sec35 个循环。
[0084]4、检测体系HRM熔解条件
[0085]通过不同的变性时间(holdl)和杂合退火时间(hold2)的摸索，发现变性时间大于30sec足以使PCR产物完全变性，除非PCR产物Tm值和产量均很高，适当地延长时间。杂合退火时间30seC足够形成容易辨认的杂合，提高温度虽然能形成更多的杂合，但杂合峰不易辨认。故最终以变性 时间和杂合退火时间均为30sec作为首选。HRH的温度范围，在预实验时进行70— 90°C的Melting寻找到PCR产物的Tm之后。
[0086]5、PCR — HRM检测体系验证
[0087]A.批内重复性
[0088]以富士核酸提取试剂盒提取的129号标本为例对新建PCR — HRM检测体系进行批内重复性试验(重复五次)，熔解曲线进行标准化后完全重合，说明重复性极好，相对百泰克试剂盒而言，重合度更高，因此分辨率也就更高。Tm值的均值80.60 ± 0.049.[0089]B.批间重复性(再现性)
[0090]以富士核酸提取盒提取的四个标本为例对新建的PCR — HRM检测体系进行批间重复性试验(重复三天)，熔解曲线的熔解峰型和标准化溶解曲线图形基本没有变化，基因分型结果完全一致。
[0091]C.测序验证
[0092]随机抽取三种基因分型样本每种各两例进行测序验证，结果与PCR — HRM技术基因分型结果完全一致。
[0093]由此，我们可以获得一种检测试剂盒，包括基因组DNA抽提试剂、PCR反应体系试剂和Eva Green荧光染料试剂，所述PCR反应体系包括dNTP、MgCl2, realstart酶、PCR反应缓冲液和针对SNP位点的特异性引物对。
[0094]实施例2
[0095]2.1基因组DNA的提取(参考试剂盒说明书)；
[0096]2.2引物设计与合成
[0097]针对GATA4基因SNP位点rs867858、rs904018应用第一章建立的PCR — HRM检测体系进行类风湿关节炎患者的基因多态性检测。通过美国国家医学图书馆Pubmed引擎(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/sites / snp)检索到每个位点的侧翼序列,输入在线软件Primer3 (http://frod0.w1.mit.edu/primer3)进行引物设计。通过UCSC—PCR(http://genome, ucsc.edu)验证其特异性后交上海生工生物技术公司合成，引物浓度调整到20μΜ-20?保存。各位点引物序列及PCR产物如下:
[0098]GATA4rs867858 位点
[0099]体及位置:8ρ23.I
[0100]位点多态性:A / C
[0101]引物:P1CCTAGACCGTGGGTTTTGCATTGTGTTTC(SEQIDN0.1)Tm:67°C GC%:48.3[0102]P2GATGCCGTCATTCGGGCTGGAG (SEQ ID N0.2) Tm:65.5°C GC%:63.6
[0103]PCR 产物:如 SEQ ID N0.3 所示。IOlbp Tm:90.9°C GC%:61.4%
[0104]GATA4 基因 rs904018
[0105]染色体及位置:8ρ23.I
[0106]位点多态性:A / G
[0107]引物:P1CCCTGCATCCCTAATACCAA(SEQID N0.4) Tm:56°C GC%:50
[0108]P2TAGCTCCCCAGGAAGTGTTC(SEQ ID N0.5) Tm:57.9°C GC%:55
[0109]PCR 产物:如 SEQID N0.6 所示。80bp Tm:82.5°C GC%:47.5
[0110]2.3PCR—HRM技术检测基因多态性
[0111]采用实施例1建立的PCR—HRM检测体系作为基础进行基因多态性检测，引物浓度为0.3 μ M，反应体系12 μ L，金斯特Taq酶系统组成为:0.2U热启动酶，2.5mM的Mg+，0.2mM的 dNTP, IXPCR Buffer，20 X EvaGreen，模板 0.5 μ L0 扩增条件为预变性 96°C 3min，变性95°C 6sec,退火60°C 6sec,延伸72°C 15sec35个循环。EvaGreen Mix扩增条件为预变性960C 3min，变性 96°C 6sec，退火 60°C 6sec，延伸 72°C 15sec35 个循环。高 GC 的 IL-6R-183扩增条件为预变性96°C 3min，变性95°C lOsec，退火60°C lOsec，延伸72°C 15sec35个循环。高分辨熔解选择HRM通道，按Rotor gene60(K)仪器默认条件进行。熔解温度范围按不同扩增子Tm±3°C确定。
[0112]2.4基因分型及测序验证
[0113]基因分型依靠仪器分析软件HRM标准化图形，参考熔解图和扩增图进行判断，对不同类型熔解曲线的标本随机抽样2— 3份进行测序验证，必要时双相测序或复查。
[0114]2.5统计学处理与分析
[0115]将检测数据输入Spssl3.0软件，并进行数据处理与统计分析。计算各SNP的基因型频率和基因频率以及单倍型和单倍组合，并应用在线分析软件SHESiS(http://analysis, bio-χ.cn/myAnalysis.php)与对照组进行病例-对照分析。此外，还进行性别分层分析。
[0116]结果:
[0117]一、
[0118]GATA4两个位点在病例组和对照组基因型分布、等位基因分布、Hardy—Weinberg遗传平衡(HWE)分析和单倍型分析分别见表1.1、表1.2、表1.3、表1.4和表1.5。rs867858位点基因型T / G在对照病例中分布有统计学意义，rs904018位点基因型GG和等位基因频率在病例对照中均有统计学意义。在不同遗传模式下两个SNP位点的基因型和等位基因分析中我们发现，rs867858位点在显性遗传模式下据有统计学意义，同时rs904018位点在显性遗传模式因为具有统计学意义。HWE分析显示GATA4两个位点基因型频率在对照组中达到遗传平衡，说明对照组具备群体代表性，病例组本身属于与选择的人群不做HWE的检测。单倍型分析显示单倍型C-G频率在两组之间具有统计学差异降低CHD患病风险(OR=0.748，P=0.039)
[0119]表1.1rs867858位点基因型和等位基因的分布
[0120]
【权利要求】
1.GATA4基因SNP位点rs867858和/或rs904018在制备先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用。
2.GATA4基因SNP位点单倍型在制备先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用。
3.GATA4基因SNP位点rs867858在制备女性先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用； 或，GATA4基因SNP位点rs904018在制备男性先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于:所述先天性心脏病的类型为室间隔缺损。
5.检测GATA4基因SNP位点rs867858和/或rs904018的物质在制备先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用； 或检测GATA4基因SNP位点rs867858的物质在制备女性先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用； 或检测GATA4基因SNP位点rs904018的物质在制备男性先天性心脏病易感性的诊断试剂盒中的应用。
6.一种先天性心脏病易感性的诊断试剂盒，包括检测GATA4基因SNP位点rs867858和/或rs904018的物质。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述检测GATA4基因SNP位点rs867858和/或rs904018的物质包括基因组DNA抽提试剂、PCR扩增引物对、PCR反应体系试剂、和HRM荧光染料试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述PCR扩增引物对如SEQID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.4 和 SEQID N0.5 所示。
9.根据权利要求6-8任一所述的试剂盒，其特征在于:所述PCR反应体系试剂包括dNTP、MgCl2, realstart 酶、PCR 反应缓冲液； 所述 HRM 突光染料选自 Eva Green、Syto9、Resolight 和 SupperGreen ； 所述先天性心脏病的类型为室间隔缺损。
10.权利要求6-9中任一所述试剂盒在制备先天性心脏病易感性的诊断产品中的应用或在制备男性先天性心脏病易感性的诊断产品中的应用或在制备女性先天性心脏病易感性的诊断产品中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103667440SQ201310398808
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】谢小冬, 苏刚, 李培强, 吴骅, 李炯, 李静 申请人:谢小冬