一种新型羰基还原酶、其基因及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种来源于金黄杆菌（Chryseobacteriumsp.CA49）的新型羰基还原酶ChKRED03及其编码基因，并利用该羰基还原酶作为生物催化剂催化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮制备光学纯(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，产物的对映体过量值大于99%。除了羰基还原酶ChKRED03纯酶以外，还可以利用相应的重组菌休止细胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形态作为生物催化剂，同样能达到本发明的效果。该酶是一种具有潜力的新型生物催化剂，具有较大的工业应用前景。
【专利说明】一种新型羰基还原酶、其基因及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新的基因及其蛋白质产物，具体涉及一种来源于金黄杆菌(Chryseobacterium sp.CA49)的新型羰基还原酶ChKRED03及其基因，并利用其生物催化生产(S)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，属于应用微生物与酶工程领域。
【背景技术】
[0002]两种光学纯的[3，5- 二(三氟甲基)苯基]乙醇都是合成NK-1受体拮抗剂的中间体，其中R构型是Merk公司研发的药物阿瑞匹坦(Aprepitant,商品名“Emend”)的关键手性中间体，而S构型常用于整合到拮抗剂中用于临床评价(Pollard D, et al.Effectivesynthesis of (S)-3, 5-bistrifluoromethylphenyl ethanol by asymmetric enzymaticreduction.Tetrahedron:Asymmetry, 2006, 17, 554-559)。近年来，以潜手性丽 3, 5_ 双三氟甲基苯乙酮为底物经生物催化过程获得S构型醇迅速发展。目前报道的可以实现该催化过程的的微生物菌株有Saccharomyces Rhodotorula (张芳等，红酵母静息细胞催化 (S)-3，5-双三氟甲基苯乙醇的不对称还原反应.药物生物技术，2007，14 (6):411-414),Candida tropicalisl04 (王普等，一种微生物转化制备(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法.中国专利，CN101519674)等，这些全细胞的生物催化过程往往ee值不高或者底物转化浓度较低；商业酶则有来自 Rhodococcus erythropolis、Candida parapsilosis、Candida boidinii等菌株的乙醇脱氢酶ADH,其中由Merk公司开发的ADH RE (来源于Rhodococcus erythropolis)催化工艺(Pollard D, et al.Effective synthesis of (S)-3, 5-bistrifluoromethylphenyl ethanol by asymmetric enzymatic reduction.Tetrahedron:Asymmetry, 2006, 17, 554-559),已达到 100g/l 的工业化水平，该过程需要添加甲酸脱氢酶FDH用于辅酶循环。开发更多有潜力的催化剂，既可获得具有自主知识产权的生物催化工艺，又能丰富生物催化工具箱。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是公开一种羰基还原酶ChKRED03及其基因，以及利用该酶还原底物3，5-双三氟甲基苯乙酮制备光学纯(S)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的方法。
[0004]本发明所述的羰基还原酶ChKRED03的基因碱基数为735bp，其序列为SEQ IDN0.1，编码244个氨基酸残基，其序列为SEQ ID N0.2。
[0005]羰基还原酶ChKRED03从金黄杆菌(Chryseobacterium sp.CA49)基因组中克隆获得，该菌的保藏编号为CCTCC M2012484 (中国武汉，中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012 年 11 月 27 日)。
[0006]羰基还原酶ChKRED03的基因PCR扩增时设计的引物如下:正向5 ' -gaattcATGAATTTCACAGATAAAAATGTAATCATTAC-3 '(酶切位点 EcoR I),反向5 ' -aagcttTATCTGCGGATCGTTACTCC-3 '(酶切位点 Hind III)。模板为金黄杆菌(Chryseobacterium sp.CA49)基因组DNA。获得的目标基因所编码的蛋白质命名为羰基还原酶ChKRED03。将目标基因连入pET28a ( + )空载体中，构建重组质粒pET28a_ChKRED03，并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中构建重组菌。将上述构建的重组菌以常规方法诱导表达后，经纯化获得纯酶。
[0007]根据本领域技术人员所熟知的知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此，羰基还原酶ChKRED03表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等，表达宿主可以为大肠杆菌，毕赤酵母，链霉菌等。
[0008]本发明还提供了羰基还原酶ChKRED03作为生物催化剂在转化底物3，5_双三氟甲基苯乙酮生成(S)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。其反应式如下:
[0009]
【权利要求】
1.一种羰基还原酶GKRED03的基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。
2.一种羰基还原酶aKRED03，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。
3.如权利要求2所述的羰基还原酶CXKRED03作为生物催化剂在转化底物3，5-双三氟甲基苯乙酮 生成(5.)-1-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。
【文档编号】C12P7/22GK103695443SQ201410012867
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2014年1月12日 优先权日:2014年1月12日
【发明者】吴中柳, 刘艳, 裴小琼 申请人:中国科学院成都生物研究所