用于肿瘤细胞培养的三维培养系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于肿瘤细胞培养的三维培养系统。进一步地，本发明涉及含有作为肿瘤组织生长支架的凝胶、培养基、促凝剂和肿瘤组织的三维培养系统。
【专利说明】用于肿瘤细胞培养的三维培养系统
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于肿瘤细胞培养的三维培养系统。进一步地，本发明涉及所述三维培养系统用于肿瘤化疗药物的筛选。
【背景技术】
[0002]目前恶性肿瘤治疗方案首选手术切除原发病灶，但是有些恶性肿瘤患者在就诊时已处于肿瘤晚期，无法行手术治疗，且手术切除原发灶后，肿瘤复发均影响了肿瘤治疗效果，降低了恶性肿瘤患者生存期。化疗治疗是提高肿瘤治疗效果，改善患者预后并延长患者生存期的重要手段之一。目前恶性肿瘤的化疗治疗主要是采取全身应用化疗药物，在应用化疗药物前，通过体外培养肿瘤组织原代细胞，从而筛选出敏感性化疗药物，指导临床制定化疗方案。
[0003]体外细胞培养技术不能完美模拟肿瘤组织的体内环境，且破坏了肿瘤组织的微环境，所应用化疗药物仅针对肿瘤实质细胞，而不能同时作用于肿瘤间质细胞。细胞培养中细胞在二维平面生长，而在体的肿瘤细胞是在三维系统中生长，现有的细胞培养技术不能完全模拟肿瘤组织的在体生长环境及生物动力学变化。
[0004]为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明提供了一种用于培养肿瘤细胞的三维培养系统，利用含有培养基的凝胶构建出肿瘤组织生长的支架。瘤组织固定于凝胶支架中，肿瘤组织块自身构成了与体内完全一致的肿瘤组织生长微环境。而凝胶支架模拟并提供了肿瘤组织在体生长的条件。在三维培养系统中，肿瘤细胞增殖并能够迁移，排除了二维培养系统中的接触抑制效应，该系统中的肿瘤细胞生长，完全反应了肿瘤细胞对干预措施的反应。
[0005]根据本发明提供的三维培养系统与现有技术形比，具有以下优点:
[0006]1、三维培养系统的建立为细胞和组织培养提供了一种三维立体的培养系统，更加符合细胞生长的生物学行为，可促进细胞的聚集，维持组织细胞的椭球形状，并支持肿瘤细胞的正常生长。
[0007]2、本技术利用三维组织培养技术,完好的模拟活体环境。与传统细胞培养技术相t匕，三维组织培养技术，能够模拟肿瘤组织的微环境，更加完美呈现肿瘤组织对化疗药物敏感性。
[0008]3、本系统采集手术切除的肿瘤标本，针对每个个体，每种肿瘤的敏感性进行筛选。做到了个体化，最大程度增加化疗敏感性，减轻化疗药物毒副作用。
[0009]4、本系统能够用于干细胞培养及分化急性和慢性毒性试验；药物预测疗效的筛选；血管生成试验等。
【发明内容】
[0010]本发明提供了一种用于肿瘤细胞培养的三维培养系统，其特征在于，所述三维培养系统含有作为肿瘤组织生长支架的凝胶。
[0011]进一步地，根据本发明所述的用于肿瘤细胞培养的三维培养系统，其特征在于，所述三维培养系统还含有培养基、促凝剂。
[0012]进一步地，根据本发明所述的用于肿瘤细胞培养的三维培养系统，其特征在于，所述三维培养系统进一步含有肿瘤组织。
[0013]进一步地，根据本发明所述的用于肿瘤细胞培养的三维培养系统，其特征在于，所述肿瘤组织固定于凝胶支架中。
[0014]可选地，根据本发明所述的用于肿瘤细胞培养的三维培养系统，其特征在于，所述肿瘤组织是肝癌组织。
[0015]另一方面，本发明提供了一种建立用于肿瘤细胞培养的三维培养系统的方法，其包括步骤:
[0016]a)配制液体凝胶与促凝剂的混合物；
[0017]b)将配置好的凝胶混合物加入培养板中，等待液态凝胶形成半透明状；
[0018]c)将肿瘤组织块放置于半透明的凝胶中，置于孔正中，静置，待组织培养凝胶形成不透明的胶冻状。
[0019]另一方面，本发明提供了根据本发明的用于肿瘤细胞培养的三维培养系统在化疗药物筛选中的用途。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1:肝癌组织三维培养，镜下观察不同处理组，肝癌细胞生长及细胞迁移情况，细胞迁移距离反应了肝癌细胞对化疗药物敏感性。化疗药物敏感，细胞迁移距离短。A为对照组，B-D为不同化疗药物处理组。
[0021]图2:利用三维培养体系，筛选出肝癌组织敏感性化疗药物。
[0022]应当了解，所附附图并非按比例地显示了本发明的基本原理的图示性的各种特征的略微简化的画法。本文所公开的本发明的具体设计特征包括例如具体尺寸、方向、位置和外形将部分地由具体所要应用和使用的环境来确定。
[0023]在这些图形中，贯穿附图的多幅图形，附图标记引用本发明的同样的或等同的部分。
【具体实施方式】
[0024]本发明提供的三维培养系统是利用含有培养基的凝胶构建出肿瘤组织生长的支架。瘤组织固定于凝胶支架中，肿瘤组织块自身构成了与体内完全一致的肿瘤组织生长微环境。而凝胶支架模拟并提供了肿瘤组织在体生长的条件。在三维培养系统中，肿瘤细胞增殖并能够迁移，排除了二维培养系统中的接触抑制效应，该系统中的肿瘤细胞生长，完全反应了肿瘤细胞对干预措施的反应(图1)。
[0025] 实施例1、三维培养系统的建立
[0026]首先配制组织培养用凝胶:将1.5mL含表皮生长因子的促凝剂(Adittivel)加入12mL组织培养用基质胶中，所述基质胶含层黏连蛋白、胶原IV，成纤维细胞生长因子、组织纤维酶原活化因子，缓慢加入，边加边充分混匀，混合液为淡黄色清亮。将1.5mL含有酚酞的指示剂(Adittive2)加入混合液中，边缓慢加入，边混匀。刚加入时，可见局部溶液为粉红色，混匀后成为淡黄色、清亮，各组份混匀后，配置成15mL组织培养凝胶。[0027]将配置好的凝胶加入48孔培养板中，每孔加入250uL凝胶。放置于超净台中，等待液态凝胶形成半透明状。
[0028]提取手术切除的肿瘤组织标本，将组织放置于PBS溶液中，分离成0.5cm3大小组织块。
[0029]将组织块放置于半透明的凝胶中，置于孔正中，静置，待组织培养凝胶形成不透明的胶冻状。
[0030]12mL培养基中加入3mL胎牛血清。每个组织培养孔中加入250uL含胎牛血清的培养基。 [0031]实施例2、三维培养系统中化疗药物敏感性的检测
[0032]利用培养基或PBS配制待测化疗药物，根据药物说明书所示使用浓度，保持培养基体积与化疗药物体积比例大于100。
[0033]将肿瘤组织块在培养系统中培养24h、48h、72h、96h和120h，每天观察细胞生长情况，并测量细胞迁移距离。
[0034]收集相关数据。统计分析不同药物对肿瘤细胞生长和迁移的影响。
[0035]利用上述三维组织培养技术，我们对肝细胞肝癌组织对化疗药物敏感性进行研究(图2)，初步结果显示，该培养系统能够反应肝癌组织对不同化疗药物的敏感性。
【权利要求】
1.一种用于肿瘤细胞培养的三维培养系统，其特征在于，所述三维培养系统含有作为肿瘤组织生长支架的凝胶。
2.根据权利要求1所述用于肿瘤细胞培养的三维培养系统，其特征在于，所述三维培养系统还含有培养基、促凝剂。
3.根据权利要求1或2任一项所述的用于肿瘤细胞培养的三维培养系统，其特征在于，所述三维培养系统进一步含有肿瘤组织。
4.根据权利要求1-3任一项所述的三维培养系统，其特征在于，所述凝胶含有层黏连蛋白、胶原IV，成纤维细胞生长因子、组织纤维酶原活化因子。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用于肿瘤细胞培养的三维培养系统，其特征在于，所述肿瘤组织固定于凝胶支架中。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用于肿瘤细胞培养的三维培养系统，其特征在于，所述肿瘤组织是肝癌组织。
7.一种建立用于肿瘤细胞培养的三维培养系统的方法，其包括步骤: a)配制液体凝胶与促凝剂的混合物； b)将配置好的凝胶混合物加入培养板中，等待液态凝胶形成半透明状； c)将肿瘤组织块放置于半透明的凝胶中，置于孔正中，静置，待组织培养凝胶形成不透明的胶冻状。
8.根据权利要求1-6任一项所述的用于肿瘤细胞培养的三维培养系统、或根据权利要求7所述的方法制备的三维培养系统在化疗药物筛选中的用途。
【文档编号】C12M3/00GK103756904SQ201410012583
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】赵海涛, 李光兵 申请人:赵海涛