专利名称：一种鸽性别鉴别方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种鸽性别鉴别方法。
背景技术：
鸽早期配对准确是鸽场实用技术之一。鸽是严格的一夫一妻制，如果错配，不仅鸽 间斗殴，而且母鸽不产蛋。目前，除个别品种鸽可根据羽毛自辨雌雄外，绝大多数品种的鸽， 包括乳鸽、青年鸽，乃至成年鸽，不能通过体型、体态、翻肛等形态学方法来进行雌雄鉴别。 虽极富经验的饲养人员可通过体型、体态等来鉴别个别成年鸽雌雄，但准确率不高。鸟类性染色体由ZZ (雄性)和ZW (雌性)组成，并由此近年来研发成了根据ZW染 色体上CHD (Chromo-helicase-DNA binding gene)基因的扩增片段长度不同而鉴定鸟类 性别的PCR方法。目前用于鸟类性别鉴定的PCR引物主要是Griffiths (1998)设计的P2/ P8和Fridolfsson (1999)设计的2550F/2718R，且作为所有鸟类性别鉴定的通用引物；鸟 类性别鉴定，包括鸽的性别鉴定所用基因组DNA模板大多是从血液样本或多根主翼羽羽髓 中提取。以上方法不足之处在于，抽取动物血样或拨取多根主翼羽易对鸟类或鸽造成伤害； 基因组DNA提取方法大多采用常规方法，此方法不仅提取过程繁琐，而且不能确保基因组 DNA提取的一次性成功，而且成本相对较高；PCR鉴定用引物大多采用以上所述二种通用引 物及其它相应引物，但一次性检出率事实上不太理想。
发明内容
本发明目的是针对现有技术的上述不足提供一种鸽性别鉴别方法，该法无需取 血，只需1根含少量羽髓的腹侧羽毛即可鉴定鸽性别，准确率高达100%。本发明的技术方案如下
一种鸽性别鉴别方法，通过比对鸽CHD基因的2550F/2718R引物扩增产物与NCBI登录 的CHD基因序列(AY517718、AY517719)，设计出上游引物SEQ ID NO. 1和下游引物SEQ ID NO. 2，利用此上、下游引物，通过PCR技术从鸽羽髓细胞制备的基因组DNA模板中扩增Z和 W性染色体上的CHD基因片段，经过EB染色，1%琼脂糖凝胶电泳，然后凝胶成像条带分型判 断性别，出现两条带，即628bp和358bp的为雄性；出现三条带，即628bp、420bp和358bp的 为雌性。所述的鸽CHD基因片段扩增的PCR反应体系为双蒸水6. 05μ l、25mM Mg2+L 0 μ 1、 IOXBuffer 1. 0μ l、5mM dNTPO. 4 μ 1、5 μ M 上、下游引物各 0. 5 μ l、Taq 酶 0. 05 μ 1、基因组 DNA 模板 0. 5 μ 1 ；。反应条件为94°C 2 分钟；94°C 30 秒，50°C 30 秒，72°C 40 秒，35 个循环。所述的鸽基因组DNA模板提取方法如下(1)拨取含少量羽髓的鸽腹侧初生羽毛 1根，并取0. 2-5mg羽髓于离心管或PCR管中；(2)向离心管或PCR管中加入微量动物细胞 基因组DNA模板制备液；(3)将所述的装有羽髓和微量动物细胞基因组DNA模板制备液的 离心管或PCR管95°C保温5分钟，16°C保温5分钟；(4)向所述的离心管或PCR管中加入
3蛋白酶K ； (5 )55 °C保温2小时，95 0C保温10分钟，16 °C保温5分钟，离心上清直接用作PCR 的DNA模板。所述的微量动物细胞基因组DNA模板制备液由A液和B液以1 3-10的体积 比混合制得，其中所述的A液为Tris、(NH4)2SO4, MgCl2的混合溶液，三种试剂终浓度均 为0. 1-2. OM ；所述的B液为Triton和β -琉基乙醇的混合稀释液，二种试剂终浓度均为 0. 1-2. 0%。A液、B液的溶剂均为双蒸水。所述的蛋白酶K溶液的终浓度为1. 0-3. Omg/ml。制备基因组DNA模板时加入的蛋白酶K溶液与微量动物细胞基因组DNA模板制备 液的体积之和为 ο μ 1 ；优选所述的微量动物细胞基因组DNA模板制备液体积为8. 8 μ 1，所 述的蛋白酶K溶液(10 mg/ml)的体积为1.2 μ 1。本发明的有益效果本发明鸽CHD基因片段扩增引物是专门针对鸽CHD基因保守 序列而设计，扩增效率高，鸽性别鉴别的一次性成功率可达100% ；而且此对引物在扩增CHD 基因片段作为雌雄鉴别条带的同时，可扩增出一条358bp的非CHD条带，此条带可作为基因 组DNA模板制备效果好坏的参考条带。本发明使用了一种新的基因组DNA模板制备方法，此 方法从鸽微量羽髓细胞中制备DNA模板，不仅取样简单，减少对鸽的伤害；而且基因组DNA 模板制备过程简单易行，提取成本极其低廉，使大规模低成本的基因组DNA模板制备成为 可能；由于基因组DNA模板制备过程简单，制备的基因组DNA模板完整，没有耗损，可确保基 因组DNA模板制备一次性成功。
图1实施例1中乳鸽性别鉴别的PCR产物电泳结果。
具体实施例方式实施例1乳鸽性别鉴别
1. 1乳鸽羽髓细胞基因组DNA模板制备
拨取7天左右乳鸽新生腹侧羽毛(含少量羽髓)1根，并取Img左右羽髓于PCR管中； 装有羽髓的PCR管中加入微量动物细胞基因组DNA模板制备液8. 8 μ 1 ； 将装有羽髓和微量动物细胞基因组DNA模板制备液的PCR管置PCR仪中95°C 5分钟， 160C 5分钟，55°C 2小时，95°C 10分钟，16°C 5分钟。并在第一个16°C 5分钟过程中暂 停PCR仪，加入1. 2 μ 1浓度为10 mg/ml的蛋白酶K溶液。离心上清直接用作PCR的DNA 模板；
其中，上述的微量动物细胞基因组DNA模板制备液由A液和B液以1:7. 8的体积比混 合制得，A液为Tris、(NH4)2SO4^MgCl2的混合溶液，三种试剂终浓度均为0. IM ；所述的B液 为Triton和β -琉基乙醇的混合溶液，二种试剂终浓度均为0. 1%，A液、B液的溶剂均为双 蒸水。1.2 PCR 扩增
反应体系双蒸水 6. 05 μ l、25mM Mg2+ 1. 0μ IUOXBuffer 1· 0μ l、5mM dNTP 0. 4μ 1、 5μM上、下游引物(SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2)各0. 5 μ l、Taq酶0. 05 μ 1、DNA模板0. 5 μ 1 ; 反应条件94°C 2分钟；94°C 30秒，50°C 30秒，72°C 40秒，35个循环。
1.3 PCR产物条带分型(见图1)
EB染色，1%琼脂糖凝胶5-lOV/cm电泳，成像系统条带分型。雌性鸽为三条条带，长度 分别是628bp、420bp和358bp ；雄性鸽为二条条带，长度分别为628bp和358bp。
权利要求
一种鸽性别鉴别方法，其特征在于通过比对鸽CHD基因的2550F/2718R引物扩增产物与NCBI登录的CHD基因序列(AY517718、AY517719)，设计上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2，利用此上、下游引物，通过PCR技术从鸽羽髓细胞制备的基因组DNA模板中扩增Z和W性染色体上的CHD基因片段，经过EB染色、1%琼脂糖凝胶电泳，根据带型判断性别，出现两条带，即628bp和358bp的为雄性；出现三条带，即628bp、420bp和358bp的为雌性。
2.根据权利要求1所述的鸽性别鉴别方法，其特征在于所述的鸽Z和W性染色体的CHD 基因片段扩增的PCR反应体系为双蒸水6. 05μ l、25mM Mg2+ 1. 0 μ IUOXBuffer Ι.ΟμΙ、 5mM dNTP 0.4 μ 1、5 μ M所述的上、下游引物各0.5 μ 1、Taq酶0.05 μ 1、鸽基因组DNA模板0.5 μ 1 ；PCR 反应条件为94°C 2 分钟；94°C 30 秒，50°C 30 秒，72°C 40 秒，35 个循环。
3.根据权利要求1或2所述的鸽性别鉴别方法，其特征在于所述的鸽基因组DNA模板 制备方法如下(1)拨取含少量羽髓的鸽腹侧初生羽毛1根，并取0. 2^5mg羽髓于离心管 或PCR管中；(2)向离心管或PCR管中加入微量动物细胞基因组DNA模板制备液；(3)将所 述的装有羽髓和微量动物细胞基因组DNA模板制备液的离心管或PCR管95°C保温5分钟， 16°C保温5分钟；(4)向所述的离心管或PCR管中加入蛋白酶K ； (5) 55°C保温2小时或以 上，95°C保温10分钟，16°C保温5分钟，离心上清直接用作PCR的DNA模板。
4.根据权利要求3所述的鸽性别鉴别方法，其特征在于所述的微量动物细胞基因 组DNA模板制备液由A液和B液以1:3-10的体积比混合制得，其中所述的A液为Tris、 (NH4)2SO4, MgCl2的混合溶液，三种试剂终浓度均为0. 1-2. OM ；所述的B液为Triton和 β -琉基乙醇的混合溶液，二种试剂终浓度均为0. 1-2. 0%。
5.根据权利要求3所述的鸽性别鉴别方法，其特征在于所述的蛋白酶K终浓度为1.0—3. 0mg/mlo
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种鸽性别鉴别方法。通过比对鸽CHD基因的2550F/2718R引物扩增产物与NCBI登录的CHD基因序列，设计出上游引物SEQIDNO.1和下游引物SEQIDNO.2，通过PCR扩增鸽Z和W性染色体上的CHD基因片段(基因组DNA模板从微量羽髓细胞中制备)，经过EB染色，1%琼脂糖凝胶电泳、根据带型判断性别，出现两条带，即628bp和358bp的为雄性；出现三条带，即628bp、420bp和358bp的为雌性。本发明结合动物细胞基因组DNA模板制备新方法及高效率的鸽CHD基因片段扩增引物，鸽性别鉴别的一次性检出率及检出准确率可达100%。
文档编号C12Q1/68GK101935710SQ20101050703
公开日2011年1月5日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者夏银, 李银, 茆骏, 邢光东 申请人:江苏省农业科学院