专利名称：一种油菜种子发育极早期种皮颜色鉴定试剂盒及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，具体地说是涉及一种油菜种子发育极早期种皮颜色快速鉴 定试剂盒及其鉴定方法。
背景技术：
国内外大量研究表明，在相同遗传背景下，黄色种皮油菜(简称黄籽油菜)与黑色种皮 油菜(简称黑籽油菜)相比具有种皮薄、含油量高、油中色素和杂质少、木质素含量低等优 点。油菜黄籽一直是油菜育种家们最关心的问题，尤其是对种子黄籽性状的极早期选择(开 花后10天内)，但油菜种子颜色要到成熟是才能显现出来，以前方法很难做到这一点。无论 是黄籽还是黑籽在种子发育的极早期，种皮都是绿色的，育种者在种子发育的极早期不能 对种皮颜色进行选择，需要在种子成熟后才能对种皮颜色性状进行选择。同时，在油菜杂种 优势利用中，根据杂交亲本之间的种皮颜色的显隐性关系，在种子发育极早期对杂交种的 亲本和杂交种的纯度进行鉴定。通常要鉴定油菜种皮颜色，都要等到种子成熟后才能判断， 虽然我们曾用化学鉴定法(香草醛染色法)能够鉴定油菜种皮的颜色，但至少要在授粉10天 后才能判断，如果能够在开花后10天内就能对种皮颜色进行鉴定，那可以大大减少油菜黄 籽育种的工作量，这样可以加快育种的进程，降低了育种成本，因此油菜种子种皮颜色发育 极早期的快速鉴定试剂盒及鉴定方法对于油菜育种有极其重要的意义。多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，即PCR)，是目前最流行的体外扩 增DNA片段的技术，具有快速、敏感和特异性强等特点，如能将该技术用于油菜种皮颜色的 极早期鉴定，将具有重要的意义和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的种皮颜色极早期鉴定上存在的不足，提供一种快速、 特异性好、灵敏度高的油菜种子发育极早期(开花后4-5天)快速鉴定种皮颜色的试剂盒，以 便应用于油菜的育种；本发明的另一目的是提供利用上述试剂盒鉴定油菜发育极早期的种 皮颜色的方法。一种油菜种子发育极早期种皮颜色鉴定试剂盒，其特征是，所述试剂盒由下列部 件组成
(1)RNA提取A液，内装Trizol液;
(2)RNA提取B液，内装苯酚-氯仿，苯酚、氯仿的体积比为25:24;
(3)RNA提取C液，内装异丙醇；
(4)RNA提取D液，内装75%乙醇；
(5)RNA提取E液，内装DEPC处理后高温灭菌的超纯水；
(6)RT反应F液，内装反应缓冲液Buffer、dNTP、oligo dT引物、RNA酶抑制和反转录 酶M-MLV，各组分的体积配比为
反应缓冲液(5Xmxiffer)2份
dNTP1 份
oligo dT引物1份RNA酶抑制0. 3份
反转录酶M-MLV0. 5份
DEPC处理的超纯水4. 2份；
(7)RT-PCR反应Gl液，内装含Mg2+的反应缓冲液Buffer、dNTP、Taq酶、正向引物F 和反向引物R，各组分的体积配比如下
含mg2+的反应缓冲液(IOXmxiffer) 2份 dNTP0. 3 份
正向引物F1份
反向引物R1份
超纯水13. 3份
Taq 酶0. 4 份；
(8)RT-PCR反应G2液，内装含Mg2+的反应缓冲液，dNTP、Taq酶、内参基因Actin的 正向引物ACTF和内参基因Actin的反向引物ACTR，各组分的体积配比如下
含mg2+的反应缓冲液(IOXmxiffer) 2份 dNTP0. 3 份
正向引物ACTF1份
反向引物ACTR1份
超纯水13. 3份
Taq 酶0. 4 份；
(9)阳性对照Hl液，内装黑籽油菜阳性模板；
(10)阴性对照H2液，内装黄籽油菜阴性模板。
所述正向引物F序列为5’-TCAGCTGCTGCGGTTTCTATC-3’，所述反向 弓 I 物 R 序列为5’-CAGATAGCTTCTGCATTTCCTTG-3’ ；所述正向引物 ACTF 序 列为5，-GACATTCAACCTCTTGTTTGC-3，，所述反向引物 ACTR 序列为 5’-CTGCTCGTAGTCAAGAGCAATG-3’ 。
一种利用所述试剂盒鉴定油菜发育极早期种皮颜色的方法，按以下步骤进行
(1)取待测的开花4-5天后的去掉种脐的种皮样品，加5倍体积的RNA提取A液，冰浴 勻浆，室温静止2-5min，得勻浆液；
(2)在上述勻浆液中加入0.5倍体积的RNA提取B液，混勻，静止2-5min ；
(3)4-10°C , 12000g 离心 5min ；
(4)取上清液，加入1倍体积的RNA提取C液，混勻，静置5-10min ；
(5)4-100C，12000g 离心 5min ；
(6)弃上清，用RNA提取D液洗涤后，室温干燥或在超净台中吹干，加RNA提取E液溶 解，得RNA溶液；
(7)取所得RNA溶液，加入4倍体积的RT反应F液，42°C保温30min,然后99°C处理5 min,得RT-PCR的模板；
(8)将RT-PCR的模板、阳性对照Hl液、阴性对照H2液分别加到RT-PCR反应Gl液和 RT-PCR反应G2液中，混勻后至于PCR仪上；
(9)进行PCR 扩增先 94°C 3min，再 94°C，30s; 58°C , 30s; 72°C , 30 min, 30 个循环后，72°C延长6 min，反应结束后，得扩增产物。(10)取扩增产物，加1/5倍体积的上样缓冲液(含溴酚蓝)，经1%的琼脂糖凝胶电 泳15-30min后在紫外仪上观察，若与阳性对照同一位置的319 bp处出现明亮的条带，则为 检测阳性，说明该待测样品种子成熟后种皮为黑色，否则为阴性，说明该待测样品种子成熟 后种皮为透明，种子表现出胚的黄色。本发明有如下有益效果本发明依据以油菜黄黑籽种皮中差异表达的基因序列为 基础，设计一对引物，建立了反转录——聚酶链式反应(RT-PCR体系)，在此基础上进行优 化，建立了油菜种皮颜色发育极早期的定性鉴定方法，此方法快速、敏感和特异性强，尤其 能鉴定油菜种子发育的极早期(开花4-5天)的种皮，大大提前了油菜种皮颜色鉴定的时间， 为油菜种皮颜色育种和黄籽育种的选择节约了时间，提高了育种选择的效率，具有很高的 实用价值。
附图是不同种皮颜色油菜材料开花4-5天种皮样品的RT-PCR鉴定结果图。图中ACT: β-Actin基因为内参；B:黑籽种皮阳性对照；Y:黄籽种皮阴性对 照；Lane 1-8 鉴定的甘蓝型油菜种皮样品(种子成熟后1、2、4、6为黄籽，3、5、7、8为黑籽); Lane 9_16 鉴定的芥菜型油菜种皮样品(种子成熟后14为黄籽，9、10、11、12、13、15、16为 黑籽)；Lane 17-18:鉴定的白菜型油菜种皮样品(种子成熟后17为黄籽，18为黑籽)。
具体实施例方式实施例1
油菜种子发育早期种皮颜色鉴定试剂盒由以下各部分组成
(1)RNA提取A液，内装Trizol液，2管，5ml/管。
(2)RNA提取B液，内装苯酚-氯仿，苯酚、氯仿的体积比为25:24，1管，5ml/管。(3) RNA提取C液，内装异丙醇，2管，5ml/管。(4) RNA提取D液，内装75%乙醇，2管，5ml/管。(5) RNA提取E液，内装DEPC处理后高温灭菌的超纯水，1管，Iml/管。(6) RT反应F液，内装反应缓冲液(5XBuffer)、dNTP、oligo dT引物、RNA酶抑 制、反转录酶M-MLV和DEPC处理的超纯水，1管，0. 2ml/管
(7)RT-PCR反应Gl液，内装含Mg2+的反应缓冲液(10XBuffer)、 dNTP、Taq酶、正向引物F、反向引物R和超纯水，1管，0. 4ml/管；所述正向 引物F序列为5’-TCAGCTGCTGCGGTTTCTATC-3’，所述反向引物R序列为 5，-CAGATAGCTTCTGCATTTCCTTG-3，；
(8)RT-PCR反应G2液，内装含Mg2+的反应缓冲液(10 XBuffer)，dNTP、Taq酶、内参 基因Actin的正向引物ACTF、内参基因Actin的反向引物ACTR和超纯水，1管，0. 4ml/管; 所述正向引物ACTF序列为5' -GACATTCAACCTCTTGTTTGC-3'，反向引物ACTR序列为5'-CTGCTCGTAGTCAAGAGCAATG-3'；
(9)阳性对照Hl液，内装黑籽油菜阳性模板，1管，0.02ml/管。(10)阴性对照H2液，内装黄籽油菜阴性模板，1管，0. 02ml/管。
(11)长方形盒子，大小为8 cm X 6 cm X 5cm;内含一块大小为8 cm X 6 cm硬纸板， 上有孔径为1. 5cm的孔8个，上有孔径为0. 75cm的孔6个，上述各小管分别放置于对应的 孔内。
10 μ L体系的RT反应F液的组分及各组分的体积如下
反应缓冲液(5Xmxiffer)2μ L
dNTP1 μ L
oligo dT 引物IyL
RNA酶抑制0. 3 μ L
反转录酶M-MLV0. 5 μ L
DEPC处理的超纯水4. 2 μ L
20 μ L体系的RT-PCR反应Gl液的组分及各组分的体积如下
含mg2+的反应缓冲液(10 X Bbuffer) 2μ L
dNTP0. 3 μ L
正向引物FIuL
反向引物RIuL
超纯水13.3yL
Taq 酶0. 4 μ L
20 μ L体系的RT-PCR反应G2液的组分及各组分的体积如下
含mg2+的反应缓冲液(10XBbuffer) 2μ L
dNTP0. 3 μ L
正向引物ACTFIuL
反向引物ACTRIuL
超纯水13.3yL
Taq 酶0. 4 μ L
实施例2
油菜种子发育早期种皮颜色的鉴定方法，使用实施例1中的试剂盒，按下列步骤进行 (1)取去掉种脐部分后的新鲜种皮0. 05、. Ig,加入500 μ L的RNA提取A液，冰浴勻 浆，室温静止2 5min。(2)在上述勻浆液中加入250 μ L的RNA提取B液，混勻，静止2_5min。(3)4_10°C，12000g 离心 5min。(4)取上清液500 μ L，加入500 μ L的RNA提取C液，混勻，静置5-10 min。(5)4-10°C,12000g离心5min。去掉上清液，用250 μ L的RNA提取D液洗涤2次 后，室温干燥或在超净台中吹干，加15 30 μ L的RNA提取E液溶解，得RNA溶液。(6)取IyL的上述RNA溶液，加入9μ L的RT反应F液，42°C保温30 min，然后 99°C处理5 min，得RT-PCR的模板。(7)分别将2 μ L的RT-PCR的模板、阳性对照Hl液和阴性对照Η2液加到18 μ L 的RT-PCR反应Gl液和RT-PCR反应G2液中，混勻后置于PCR仪上。(8)进行 PCR 扩增先 94°C 3min，再 94°C，30s; 58°C , 30s; 72°C , 30 min, 共30个循环后，72 °C延长6 min，反应结束后，得扩增产物。
(9)取8-10 μ L扩增产物，力卩2 μ L上样缓冲液(含溴酚蓝)，混勻，经1%的琼脂糖 凝胶电泳15-30min后在紫外仪上观察，若与319 bp处出现明亮的条带(与阳性对照同一 位置的)则为检测阳性，说明该待测样品种子成熟后种皮为黑色，否则为阴性，说明该待测 样品种子成熟后种皮为透明，种子表现出黄色(见图1)。
权利要求
1. 一种油菜种子发育极早期种皮颜色鉴定试剂盒，其特征是，所述试剂盒由下列部件 组成(1)RNA提取A液，内装Trizol液;(2)RNA提取B液，内装苯酚-氯仿，苯酚、氯仿的体积比为25:24;(3)RNA提取C液，内装异丙醇；(4)RNA提取D液，内装75%乙醇；(5)RNA提取E液，内装DEPC处理后高温灭菌的超纯水；(6)RT反应F液，内装反应缓冲液Buffer、dNTP、oligo dT引物、RNA酶抑制和反转录 酶M-MLV，各组分的体积配比为反应缓冲液(5Xmxiffer)2份dNTP1 份oligo dT引物1份RNA酶抑制0. 3份反转录酶M-MLV0. 5份DEPC处理的超纯水4. 2份；(7) RT-PCR反应Gl液，内装含Mg2+的反应缓冲液Buffer、dNTP、Taq酶、正向引物F 和反向引物R，各组分的体积配比如下含mg2+的反应缓冲液(IOXmxiffer) 2份 dNTP0. 3 份正向引物F1份反向引物R1份超纯水13. 3份Taq 酶0. 4 份；(8) RT-PCR反应G2液，内装含Mg2+的反应缓冲液，dNTP、Taq酶、内参基因Actin的 正向引物ACTF和内参基因Actin的反向引物ACTR，各组分的体积配比如下 含mg2+的反应缓冲液(IOXmxiffer) 2份 dNTP0. 3 份正向引物ACTF1份反向引物ACTR1份超纯水13. 3份Taq 酶0. 4 份；(9)阳性对照Hl液，内装黑籽油菜阳性模板；(10)阴性对照H2液，内装黄籽油菜阴性模板。
2.根据权利要求1所述的油菜种子发育极早期种皮颜色鉴定试剂盒，其特征是，所述正向引物F序列为5’-TCAGCTGCTGCGGTTTCTATC-3’， 所述反向引物R序列为5’-CAGATAGCTTCTGCATTTCCTTG-3’ ；所述正向引 物ACTF序列为5，-GACATTCAACCTCTTGTTTGC-3，，所述反向引物ACTR序列为 5’-CTGCTCGTAGTCAAGAGCAATG-3’ 。
3. 一种利用权利要求1所述试剂盒鉴定油菜发育极早期种皮颜色的方法，其特征是， 按以下步骤进行(1)取待测的开花4-5天后的去掉种脐的种皮样品，加5倍体积的RNA提取A液，冰浴 勻浆，室温静止2-5min，得勻浆液；(2)在上述勻浆液中加入0.5倍体积的RNA提取B液，混勻，静止2-5min ；(3)4-10°C , 12000g 离心 5min ；(4)取上清液，加入1倍体积的RNA提取C液，混勻，静置5-10min ；(5)4-100C，12000g 离心 5min ；(6)弃上清，用RNA提取D液洗涤后，室温干燥或在超净台中吹干，加RNA提取E液溶 解，得RNA溶液；(7)取所得RNA溶液，加入4倍体积的RT反应F液，42°C保温30min,然后99°C处理5 min,得RT-PCR的模板；(8)将RT-PCR的模板、阳性对照Hl液、阴性对照H2液分别加到RT-PCR反应Gl液和 RT-PCR反应G2液中，混勻后至于PCR仪上；(9)进行PCR 扩增先 94°C 3min，再 94°C，30s; 58°C , 30s; 72°C , 30 min, 30 个 循环后，72°C延长6 min，反应结束后，得扩增产物；(10)取扩增产物，加1/5倍体积的上样缓冲液(含溴酚蓝)，经1%的琼脂糖凝胶电泳 15-30min后在紫外仪上观察，若与阳性对照同一位置的319 bp处出现明亮的条带，则为检 测阳性，说明该待测样品种子成熟后种皮为黑色，否则为阴性，说明该待测样品种子成熟后 种皮为透明，种子表现出胚的黄色。
全文摘要
本发明涉及一种鉴定试剂盒，具体公开了一种在油菜种子发育极早期快速鉴定种皮颜色的鉴定方法。本发明的试剂盒及鉴定方法是依据在油菜黄黑籽发育极早期差异表达基因的序列设计的一对引物为主体的基础上而产生的。本发明采用反转录——聚酶链式反应(RT-PCR)技术，对油菜发育早期(开花4-5天后)种皮(去掉种脐部分)的特异RNA核酸片段进行的定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高，可以广泛应用于油菜种皮颜色育种中的极早期选择，从而提高育种效率，加快育种进程，节约育种成本，提高科学管理效率，具有很高的使用价值。
文档编号C12Q1/68GK102134587SQ20101052622
公开日2011年7月27日 申请日期2010年11月1日 优先权日2010年11月1日
发明者严明理, 刘丽莉, 向建华, 屠波, 谭勇俊, 陆赢 申请人:湖南科技大学