专利名称：基于ssr-pcr的油菜杂交种种子纯度检测方法
技术领域：
本发明属于油菜育种与应用技术领域，具体涉及一种油菜杂交种种子纯度的检测方法。
背景技术：
甘蓝型油菜具有明显的超亲优势，是杂种优势利用最为成功的作物之一。我国从 20世纪80年代开始推广应用第一个甘蓝型油菜杂交品种秦油2号以来，杂交品种得到迅速普及，极大地提高了我国的油菜生产水平。但是，目前油菜杂交制种普遍采用pol-CMS系统，其母本不育系属低温敏感型，若花期遇低温天气，易产生微量花粉，并自交产生不育假杂种，从而导致杂交种种子纯度质量下降，严重时可造成生产上油菜产量大幅度降低。因此，油菜杂交种应用于生产之前必须进行严格的纯度鉴定，特别是针对杂交种中不育母本种子的鉴定，才能保证我国的油菜生产安全。长期以来，油菜杂交种纯度检测主要采用传统的种植鉴定法，即根据形态特征和育性来判断样品的纯度，鉴定周期长，耗费人力、物力巨大，且结果往往受环境和人为的因素影响较大。20世纪80年代开始，生化技术开始被应用于油菜杂交种纯度检测工作，以酯酶同工酶和醇溶蛋白电泳技术为代表的生化标记鉴定技术，不仅大大缩短了鉴定周期，而且鉴定结果准确可靠，已成为油菜杂交种纯度检测的一种主要方法。但是，该类标记技术检测成本相对较高，而且其遗传信息量非常有限，在大部分杂交油菜的父母本间显示不出差异，决定了其只能应用于少数油菜杂交品种的纯度检测；近年来，迅速发展的分子标记技术给油菜杂交种纯度检测工作开辟了新途径，特别是SSR标记技术，不仅操作相对简单，而且具有丰富的遗传信息量，在理论上，只要筛选到合适的引物，可以应用于任何油菜品种的纯度检测，这已成为目前油菜杂交种纯度检测工作的首选分子标记技术，并在部分高校及科研单位得到了应用。然而，现有的油菜杂交种SSR-PCR纯度检测方法操作步骤繁琐，耗费大量人力和时间，且需要具备一定实验技能的人员进行操作；另一方面该方法所需仪器、试剂和耗材非常昂贵，一般规模的种子企业难以构建检测体系和承受检测成本。因此，现有SSR标记检测方法不适合于目前大规模商业化杂交种制种纯度检测需要，更不可能普及应用于小型种子企业。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种快速简便、高通量、检测成本低、检测效率高、检测结果稳定可靠的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法，包括以下步骤(I)DNA提取取数量为N(N的取值根据我国农作物种子检验规程的扦样标准(GB/T3543. 2)确定即可)的待测油菜杂交种样品种子进行发芽培养，将培养后的幼苗进行碱裂解，同时进行超声波破碎处理，再加入提取缓冲液(如Tris-HCl缓冲液溶液)，混勻后即得到所述杂交种样品种子的基因组DNA溶液；Q)PCR扩增利用SSR引物序列对步骤(1)中所述杂交种样品种子的基因组DNA 进行PCR扩增；(3)电泳分离将步骤O)中PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行稳压电泳分离；(4)显带读数将步骤(3)中电泳分离后的凝胶置于凝胶成像系统中成像、读带， 将所述杂交种样品种子的谱带特征与其父母本种子的谱带特征进行比对，统计出所述杂交种样品种子中具有父本谱带特征和母本谱带特征的种子数量n，再根据公式“品种纯度 (%) = (1-n/N) X 100%”即可得到待测油菜杂交种样品的纯度。如果父本谱带特征或母本谱带特征事先未经确认，可以在步骤(1)的样品中同时加入少量的父母本种子进行培养， 以便在最后的显带读数步骤中同时获得父、母本的谱带特征，用于与杂交种种子的谱带特征进行比对。上述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法中，所述超声波破碎处理优选是在加满水的超声波洗涤器中进行，超声波破碎处理时的水温优选控制在65°C 80°C， 超声波破碎的功率优选控制在200W 250W，超声波破碎处理的时间优选为5min 20min。上述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法中，所述SSR引物序列优选包括以下八种引物对中的任意一种引物对1正向引物序列(5'—3'):AAGAACGTCAAGATCCTCTGC ；
反向引物序列(5'—3'):ACCACCACGGTAGTAGAGCG ；
引物对2正向引物序列(5'—3'):AGCCTTGTTGCTTTTCAACG ；
反向引物序列(5'—3'):AGTGAATCGATGATCTCGCC ；
引物对3正向引物序列(5'—3'):AAAGGACAAAGAGGAAGGGC ；
反向引物序列(5'—3')TTGAAATCAAATGAGAGTGACG ；
引物对4正向引物序列(5'—3')GCGTTCTAGGGTTTGTGGGA ；
反向引物序列(5'—3')GAGGAAGTGAGAGCGGGAAATCA ；
引物对5正向引物序列(5'—3')CCAGGTTACTGTTAAAGAATAAGAGAG
反向引物序列(5'—3'):ATCGTCTGCGAGTCTCCTTG ；
引物对6正向引物序列(5'—3'):AAGCTGTTCGATGAAATGCC ；
反向引物序列(5'—3'):ACTTGTTTGCATCCATTGCC ；
引物对7正向引物序列(5'—3'):TCGGGGTTTGTTGTGAGG ；
反向引物序列(5'—3')GAGGAGGATGCTAAGAGTGAGC ；
引物对8正向引物序列(5'—3'):CGGTCAGATTCCAACAGA ；
反向引物序列(5'—3'):GCCATCTCAGAGACGACA。 作为对上述技术方案的进一步改进，利用所述引物对1对品种名称为丰油701、丰油730、湘杂油2号或湘杂油4号的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对 2对品种名称为丰油701或沣油737的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对3对品种名称为沣油737、沣油520、丰油730、沣油5103或沣油827的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对4对品种名称为丰油730或沣油5103的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对5对品种名称为沣油682或沣油823的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对6对品种名称为沣油792的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对7对品种名称为沣油682或沣油823的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对8对品种名称为沣油737、沣油792或湘杂油 4号的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定。上述优选的技术方案中，各个引物对与适宜检测的油菜杂交品种的对应关系可归纳为下表1。表1 :SSR引物核苷酸序列与检测品种的最优化匹配
权利要求
1.一种基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度鉴定方法，包括以下步骤(I)DNA提取取数量为N的待测油菜杂交种样品种子进行发芽培养，将培养后的幼苗进行碱裂解，同时进行超声波破碎处理，再加入提取缓冲液，混勻后得到所述杂交种样品种子的基因组DNA溶液；Q)PCR扩增利用SSR引物序列对步骤(1)中所述杂交种样品种子的基因组DNA进行 PCR扩增；(3)电泳分离将步骤O)中PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行稳压电泳分离；(4)显带读数将步骤(3)中电泳分离后的凝胶置于凝胶成像系统中成像、读带，将所述杂交种样品种子的谱带特征与其父母本种子的谱带特征进行比对，统计出所述杂交种样品种子中具有父本谱带特征和母本谱带特征的种子数量n，再根据公式“品种纯度(％)= (1-n/N) X 100%”即可得到待测油菜杂交种样品的纯度。
2.根据权利要求1所述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法，其特征在于 所述超声波破碎处理是在加满水的超声波洗涤器中进行，超声波破碎处理时的水温控制在65°C 80°C，超声波破碎的功率控制在200W 250W，超声波破碎处理的时间为5min 20mino
3.根据权利要求1或2所述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法，其特征在于，所述SSR引物序列包括以下八种引物对中的任意一种引物对1正向引物序列(5'—3'):AAGAACGTCAAGATCCTCTGC ；反向引物序列(5'—3'):ACCACCACGGTAGTAGAGCG ；引物对2正向引物序列(5'—3'):AGCCTTGTTGCTTTTCAACG ；反向引物序列(5'—3'):AGTGAATCGATGATCTCGCC ；引物对3正向引物序列(5'—3'):AAAGGACAAAGAGGAAGGGC ；反向引物序列(5'—3')TTGAAATCAAATGAGAGTGACG ；引物对4正向引物序列(5'—3')GCGTTCTAGGGTTTGTGGGA ；反向引物序列(5'—3')GAGGAAGTGAGAGCGGGAAATCA ；引物对5正向引物序列(5'—3')CCAGGTTACTGTTAAAGAATAAGAGAG反向引物序列(5'—3'):ATCGTCTGCGAGTCTCCTTG ；引物对6正向引物序列(5'—3'):AAGCTGTTCGATGAAATGCC ；反向引物序列(5'—3'):ACTTGTTTGCATCCATTGCC ；引物对7正向引物序列(5'—3'):TCGGGGTTTGTTGTGAGG ；反向引物序列(5'—3')GAGGAGGATGCTAAGAGTGAGC ；引物对8正向引物序列(5'—3'):CGGTCAGATTCCAACAGA ；反向引物序列(5' —3'):GCCATCTCAGAGACGACA。
4.根据权利要求3所述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法，其特征在于， 利用所述引物对1对品种名称为丰油701、丰油730、湘杂油2号或湘杂油4号的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对2对品种名称为丰油701或沣油737的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对3对品种名称为沣油737、沣油520、丰油 730、沣油5103或沣油827的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对4对品种名称为丰油730或沣油5103的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对5对品种名称为沣油682或沣油823的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对6对品种名称为沣油792的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对7对品种名称为沣油682或沣油823的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对 8对品种名称为沣油737、沣油792或湘杂油4号的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定。
5.根据权利要求1或2所述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法，其特征在于，所述PCR扩增过程中的循环参数为94°C预变性Imin 2min，94°C变性15 20sec， 60°C退火15sec 20sec，72°C延伸30sec 40sec，此后每循环退火温度降低0. 5°C，共计 10 个循环；94°C变性 15sec 20sec，55°C退火 15sec 20sec，72°C延伸 30sec 40sec， 共27个循环；72°C延伸5min 7min，4°C保存。
6.根据权利要求1或2所述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法，其特征在于，所述电泳分离步骤中用到的电泳槽装置为琼脂糖水平电泳槽装置，所述琼脂糖水平电泳槽装置中灌注有质量分数为3. 0% 3. 5%的琼脂糖凝胶，所述稳压电泳时的电压控制在100V 120V。
全文摘要
本发明公开了一种基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度鉴定方法，包括以下步骤取待测油菜杂交种样品种子进行发芽培养，将培养的幼苗进行碱裂解，同时进行超声波破碎处理，加入提取缓冲液后得到基因组DNA溶液；利用SSR引物序列对基因组DNA进行PCR扩增；PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行稳压电泳分离；电泳分离后的PCR扩增产物置于凝胶成像系统中成像、读带，将样品种子的谱带特征与其父母本种子进行比对，统计出样品种子中具有父本谱带特征和母本谱带特征的种子数量，再根据品种纯度公式即可得到待测油菜杂交种样品的纯度。本发明的鉴定方法具有快速简便、高通量、检测成本低、检测效率高、检测结果稳定可靠等优点。
文档编号C12Q1/68GK102321767SQ20111031753
公开日2012年1月18日 申请日期2011年10月18日 优先权日2011年10月18日
发明者惠荣奎, 曲亮, 李莓, 王同华, 范连益, 陈卫江 申请人:湖南省作物研究所