专利名称：大豆胞囊线虫rna解旋酶cgh-1及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种大豆胞囊线虫RNA解旋酶CGH-I及其编码基因与应用。
背景技术：
大豆起源于中国，是人类蛋白和食用油的重要来源，全世界食用油的31%来自大豆。我国是大豆消费大国，年消费总量超过4000万吨，而国内大豆年总产量却只有不足 1700万吨。因此，必须依靠大量进口来填补空缺。我国大豆生产的主要问题是单产低，2008 年平均单产只有114公斤/亩，仅为世界平均单产的70%，与美国等先进国家相比差距更大。造成我国大豆产量低的原因除了品种和种植等问题外，病虫害是重要原因。大豆胞囊线虫病是世界范围内对大豆生产危害最为严重的病虫害之一。在我国， 大豆胞囊线虫病是仅次于大豆花叶病毒病的第二大病害，它主要分布于东北和黄淮两个大豆主产区。其中尤以多年连作区和干旱及沙碱老豆区最为严重。大豆受胞囊线虫病侵害后， 轻者减产20 % 30 %，严重者减产达70 % 80 %，更为甚者会发生大面积种植地的绝收。 大豆胞囊线虫病由胞囊线虫(Heterodera glycines, Soybean cyst nematode, SCN)弓丨起， 在大豆整个生长过程中均可发生。胞囊线虫寄生于大豆根上，导致主根和侧根发育不良，须根增多，整个根系呈须发状。须根上着生白色至黄白色的大小约0.5毫米的凸起，为线虫的胞囊。受害植株病根的根瘤很少或不结瘤；地上部分生长迟缓，幼苗期子叶及真叶变黄大； 重病苗生长停止，乃至死亡。受害植株一般表现为矮小，叶片发黄，花芽簇生，节间缩短，开花期延迟，结荚少或不能结荚。有鉴于此，胞囊线虫病的防治是大豆生产所长期面临的艰巨任务。使用高毒性的杀虫剂如DDT、呋喃丹、涕灭威等虽然可以杀死线虫，但会造成严重的环境污染，因而已被禁用或限制使用。利用传统的育种程序培育大豆抗性品种遇到的问题是回交程序烦琐，抗性鉴定复杂。通过回交育种方法选育一个品种，至少需要十年时间，大大地限制了抗大豆胞囊线虫新品种的选育。RNA干扰技术(RNAi)的出现使通过转基因技术获得具有广谱抗胞囊线虫的高产大豆品种及其它作物品种成为可能。RNAi现象最先发现于植物中并在非寄生性线虫-秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中得以揭示，随后在植物、果蝇和脊椎动物中动物中被进一步证实。秀丽线虫在摄入含dsRNA的大肠杆菌后，在其肠道中消化，其中的dsRNA可被吸收并在细胞间传递，到达大部分组织和细胞中，造成靶基因所编码mRNA的特异性降解，从而影响目的基因的功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆胞囊线虫RNA解旋酶CGH-I及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，获自大豆胞囊线虫(Heterodera glycines, Soybean cyst nematode),是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大豆胞囊线虫发育相关的由序列1衍生的蛋白质。为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列
权利要求
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大豆胞囊线虫发育相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)至4)中任一所述的DNA 分子1)序列表的序列2自5，末端第499至1839核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码大豆胞囊线虫发育相关蛋白的 DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码大豆胞囊线虫发育相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.含有双链DNA片段A和双链DNA片段B的重组质粒；所述双链DNA片段B与所述双链DNA片段A为反向互补序列；所述双链DNA片段A如序列2的序列2自5’末端523至 1090位核苷酸所示。
6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于所述重组质粒是在载体pZHOl的不同多克隆位点分别插入所述双链DNA片段A和所述DNA片段B得到的重组质粒。
7.如权利要求6所述的重组质粒，其特征在于所述重组质粒为在骨架载体pZHOl的 Xba I和Sal I酶切位点之间插入所述双链DNA片段A、Kpn I和Sac I酶切位点之间插入所述双链DNA片段B得到的重组质粒。
8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求5至7中任一所述重组质粒导入目的植物中，得到大豆胞囊线虫抗性高于所述目的植物的转基因植物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物； 所述双子叶植物优选为大豆。
10.权利要求1所述蛋白，或权利要求2或3所述基因，或权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或权利要求5至7中任一所述重组质粒在培育抗大豆胞囊线虫植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种大豆胞囊线虫RNA解旋酶CGH-1及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大豆胞囊线虫发育相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供了大豆胞囊线虫RNA解旋酶CGH-1及其编码基因，并基于该编码基因设计了RNAi表达载体，将该RNAi表达载体导入植物，可在植物中所述基因的dsRNA，当病虫在摄入转基因植物后，生殖或发育产生严重障碍，从而抑制病虫的侵染和传播。通过本发明的方法可以获得具有很强抗虫活性的转基因植物，为进一步培育广谱抗虫性的大豆新品种奠定基础。
文档编号C12N15/52GK102382804SQ20111031755
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月18日 优先权日2011年10月18日
发明者张劲松, 李海潮, 李金英, 李锦锦, 杨崇林, 王昉, 荆玉栋, 蹇友理, 陈受宜 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所