筛查方法

专利名称：筛查方法
技术领域：
本发明涉及对活体患者进行阿尔茨海默症(Alzheimer' s disease, AD)或早期阿尔茨海默症的临床诊断。特别地，本发明提供了一种筛查方法，其可用于对活体人对象进行阿尔茨海默症的辅助诊断或者用于鉴定人对象针对阿尔茨海默症的易患性。
背景技术：
随着预期寿命的增长，阿尔茨海默症(AD)正在成为西方国家的主要健康问题。虽然已针对这种疾病进行了旨在发现可靠的治愈方法或预防措施的深入研究，但是至今尚未取得成功。在设计和测试任何治疗药剂中一个最大的问题是缺乏临床诊断标准，所述临床诊断标准能够尽早地鉴别出AD患者以便进行任何有意义的干预。除了严重痴呆患者以外，目前可用的临床诊断工具还不能对阿尔茨海默症进行可靠地临床诊断。目前，还没有公认的用于阿尔茨海默症活体患者临床诊断的“金标准”诊断测试。 最常利用的临床诊断标准是NINCDS/ADRDA标准(McKhann，G.等人(1984) Neurology 34: 939-944)，其最初设计用于研究目的。尽管这些标准具有高的灵敏度，但是特异性低。在这种情况下，“灵敏度”定义为在患有阿尔茨海默症的患者中满足标准的几率，而“特异性” 定义为在未患阿尔茨海默症的患者中不满足标准的几率。由于其特异性低，因此NINCDS/ ADRDA标准对于临床诊断目的来说并不理想。此外，由于NINCDS/ADRDA需要将患者的痴呆作为AD诊断的标准之一，因此它们不适于作为用于旨在寻找预防性或治疗性疗法的临床试验的诊断标准，所述疗法如果在发生显著痴呆之前使用的话可以在最佳时机见效。阿尔茨海默症的“确切”诊断仅可通过针对阿尔茨海默症特征性病理的组织学检查(淀粉样蛋白斑块和缠结的积聚)在对象死后获得，但这种方法显然不适用于对活体对象进行AD临床诊断。近年来愈加广泛接受的是，阿尔茨海默症的病理基础是不同的神经元类群异常地再进入(re-entry)细胞分裂周期(Nagy Z, Esiri MM和 Smith AD (1998) Neuroscience 84 731 739)。在健康的老年个体中，在这种细胞周期再进入之后可发生迅速的细胞周期阻滞和再分化。相反，在患有阿尔茨海默症的个体中，调控机制似乎失效，并且神经元进入细胞周期的后期从而导致AD相关病理的积聚和/或神经元死亡(Nagy Z，Esiri匪和Smith AD(1998)Neuroscience 84:731739)。一些研究表明，阿尔茨海默症中细胞周期调节失控发生在 G1/S 转换检验点(具体参见 Arendt T，Rodel L, Gartner U 和 Holzer M(1996) Neuroreport 7 3047 9)。认为阿尔茨海默症可起因于G1/S转换的细胞周期调控缺陷已导致开发出针对 AD诊断的替代方法，其基于对相关细胞周期调控缺陷的检测，而非对疾病外在症状(例如认知功能障碍(痴呆))的评估。在这方面，国际专利公开WO 02/073212描述了一种可用于诊断早期AD的诊断测试，其基于对测试对象中的非神经元细胞筛查G1/S转换细胞周期调控缺陷的存在。WO 02/073212的作者发现，先前在阿尔茨海默症患者的神经元中观察到的G1/S转换的细胞周期调控缺陷也发生在AD患者的非神经元细胞(如淋巴细胞或成纤维细胞)中。这继而导致开发出针对细胞周期调控缺陷(其预示了经典阿尔茨海默症症状(如痴呆)的发生(即在症状发生之前出现))的方便的血液测试方法(Zs Nagy, M Combrinck,M Budge,R McShane. Cell cycle kinesis in lymphocytes in the diagnosis of Alzheimer' s disease. Neurosci Letters. 2002,317,2,81-84)。载脂蛋白Efepolipoprotein Ε, apoE)是一种对于富含甘油三酯之脂蛋白成分的分解代谢必需的载脂蛋白。编码apoE的基因具有多态性，其具有三个主要的等位基因—— ApoE2、ApoE3和ApoE4，它们分别翻译成三个主要的蛋白质同工型(apoE2、apoE3和apoE4)。 ApoE4等位基因是多个种族群体中已知的AD遗传风险因素，并且在许多种群中可占病例数的约50% (Waring SC禾口Rosenberg RN. Genome-Wide Association Studies in Alzheimer Disease. Arch Neurol 2008 ；65 (3) =329-334) 与具有其它同工型的携带者相比，携带一个或两个拷贝之ApoE4的个体具有更高的AD发病风险。此外，ApoE4还使AD发病的平均年龄从非携带者的84岁降低至纯合体的68岁(Cedazo-Minguez A. Apolipoprotein E and Alzheimer' s disease :molecular mechanisms and therapeutic opportunities. J. Cell. Mol. Med. 2007 ；11 (6) :1227-1238)。虽然ApoE4等位基因是已确立的AD遗传风险因素，但该标志物本身不适用于在临床上对AD进行诊断。此外，在对表现出痴呆的对象进行AD临床诊断中，尚未证明其可与认知障碍的神经病理学评估联合使用。(McConnell LM, Sanders GD，Owens DK. Evaluation of genetic tests :AP0E genotyping for the diagnosis of Alzheimer disease. Genet Test 1999 ；3(1) :47-53)。发明概述本发明人已发现，通过将测定结果与来自同一测试对象的apoE4基因分型数据相结合，可以改善针对非神经元细胞G1/S之细胞周期调控缺陷的测定在诊断活体对象中的阿尔茨海默症的应用(最初描述于WO 02/073212中)，从而基于该结合结果获得新的诊断标准。因此，根据本发明的第一方面，提供了获得人对象阿尔茨海默症相关诊断标准的方法，该方法包括i)筛查人对象中至少一个非神经元细胞中是否存在G1/S期转换的细胞周期调控缺陷，ii)确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果相结合，从而获得与阿尔茨海默症相关的诊断标准。在一个实施方案中，步骤i)和步骤ii)的结果通过将所述结果作为变量输入统计学算法(或诊断预测工具)中来“结合”，从而获得概率值，该概率值即为与阿尔茨海默症相关的诊断标准。根据本发明的第二方面，提供了提高筛查阿尔茨海默症相关细胞周期调控缺陷之存在情况的准确性的方法，该方法包括i)筛查对象中至少一个非神经元细胞中是否存在G1/S期转换的细胞周期调控缺陷，
ii)确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果相结合，从而与步骤i)获得的结果相比，通过结合获得的结果的准确性提高。在一个相关的方面，本发明提供了提高基于筛查阿尔茨海默症相关细胞周期调控缺陷之存在的诊断预测的准确性的方法，该方法包括i)筛查对象中至少一个非神经元细胞中是否存在G1/S期转换的细胞周期调控缺陷，ii)确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果相结合，并使用该结合的结果用于诊断预测，从而与基于步骤i)获得之结果的诊断预测相比，基于通过结合获得之结果的诊断预测的准确性提高。根据本发明的第三方面，提供了评估人对象中发生阿尔茨海默症之风险的方法， 该方法包括i)筛查对象中所述对象之至少一个非神经元细胞中是否存在G1/S期转换的细胞周期调控缺陷，ii)确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果相结合，从而评估人对象发生阿尔茨海默症的风险。在一个实施方案中，将步骤i)和步骤ii)的结果通过将所述结果作为变量输入统计学算法(或诊断预测工具)中来“结合”，从而获得用于测试对象发生阿尔茨海默症之风险的概率值。根据本发明的第四方面，提供了在活体人对象中辅助用于阿尔茨海默症临床诊断的方法，该方法包括i)筛查对象中所述对象之至少一个非神经元细胞中是否存在G1/S期转换的细胞周期调控缺陷，ii)确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果相结合。在一个实施方案中，将步骤i)和步骤ii)的结果通过将所述结果作为变量输入统计学算法(或诊断预测工具)中来“结合”，从而获得测试对象患有阿尔茨海默症的概率值。在另一个方面，本发明提供了在活体人对象中辅助诊断临床前阿尔茨海默症的方法，该方法包括i)筛查对象中所述对象之至少一个非神经元细胞中是否存在G1/S期转换的细胞周期调控缺陷，ii)确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果相结合。在又一方面，本发明提供了获得如下预后标准的方法，所述预后标准指示人对象由阿尔茨海默症引起的认知能力下降的可能速度，该方法包括i)测定所述对象之至少一个非神经元细胞中是否存在G1/S期转换的细胞周期调控缺陷，或者测定其程度，
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ii)确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果相结合，从而获得指示由所述对象之阿尔茨海默症引起的认知能力下降的速度的预后标准。在本发明每种方法的非限制性实施方案中，步骤ii)可包括筛查对象中是否存在 apoE4等位基因，以及从而确定测试对象携带的apoE4等位基因的数目。在本发明的所有实施方案中，步骤iii)中的“结合”通常涉及将步骤i)和步骤ii) 之测定中获得的结果进行统计学结合(statistical combination)，如本文所详述地。


图1显示特定apoE基因型特征性限制性片段的带型。图2示意诊断性预测发生阿尔茨海默症之风险的灵敏度和特异性，其中诊断性预测基于A)单独进行淋巴细胞测试；B)单独测定ApoE4等位基因的存在情况和数目(表2)； C)将淋巴细胞培养测定(以评估G1/S期的细胞周期调控缺陷)的结果与apoE4基因分型的结果相结合。图3显示，当测量A)相对于来自同一个体的对照培养物，在雷帕霉素的作用下细胞分裂的数目(“n_rapa/n”)(表3) ；B)在雷帕霉素的作用下Gl期的时长(“TGl_Rapa”) (表4) ；C)仅基于雷帕霉素测试的患AD患者的几率(“几率(Odds) ”)(表5)时，个体所具有的apoE4等位基因的数目不影响淋巴细胞测试的结果。图4显示表8数据的KM曲线。其表明，在该群体中，与诊断为MCI相比，如果诊断为可能是AD则在任何年龄不发生记忆力问题的概率要低得多。图5示意在MCI和可能的AD中记忆障碍发病的平均年龄(表9. 3中给出数据)。图6示意在AD和MCI患者中在一定时期内失去匪SE标度上1点的概率(表10)。图7显示针对MCI和可能的AD失去匪SE标度上1点所需月数的平均值(表11. 3 中给出数据)。图8示意对于淋巴细胞测试(仅进行淋巴细胞测试)呈阴性的患者(0，η = 4)和测试呈阳性的患者(1，η = 17)失去匪SE标度上1点所需的时间(表12)。图9显示对于淋巴细胞测试(仅进行淋巴细胞测试)呈阴性的患者(n = 4)和测试呈阳性的患者(n = 17)失去匪SE标度上1点所需的平均时间(表13. 3)。图10示意携带0、1或2个ΑροΕ4等位基因的患者失去MMSE标度上1点所需的时间(表14)。图11显示携带0、1或2个ΑροΕ4等位基因的患者失去匪SE标度上1点所需的平均时间(表15. 3)。图12示意对于淋巴细胞测试+ApoE测试(组合测定)呈阴性的患者(0，η = 2) 和测试呈阳性的患者(1，η = 19)失去匪SE标度上1点所需的时间(表16)。图13显示对于淋巴细胞测试+ApoE测试(组合测定)呈阴性的患者(0，η = 2) 和测试呈阳性的患者(1，η = 19)失去匪SE标度上1点所需的平均时间(表17. 3)。发明详述在多个方面中，本发明涉及“组合测定”，其中将两个独立测定(第一测定针对测试对象的至少一个非神经元细胞中G1/S期转换中细胞周期调控缺陷的存在情况，第二测定确定测试对象的apoE4基因型)的结果相结合以得到经结合的结果，然后可将该经结合结果用作辅助诊断阿尔茨海默症的诊断标准或者用作预后标准。在此情形中，术语“诊断”取其广义的含义，涵盖了对表现出符合阿尔茨海默症之其它症状(例如，痴呆)的对象 (包括根据NINCDS/ADRDA标准已临床确诊的患者)中阿尔茨海默症的临床诊断，对不满足 NINCDS/ADRDA标准的早期或“临床前”阿尔茨海默症患者的诊断，以及对无症状对象或表现轻度认知功能障碍的对象发生AD之风险的预测。本发明测定方法的临床应用将在下文中进一步详述。已知所述第一测定(针对对象的至少一个非神经元细胞在G1/S期转换中细胞周期调控缺陷的存在情况)作为诊断阿尔茨海默症(特别是早期诊断)的工具，如WO 02/073212所详述。当将利用本发明方法获得的诊断标准用于诊断时，通过将该测定的结果与来自同一对象的apoE4基因分型结果进行统计学结合，可提高结果的整体准确性。在本发明下述段落中将进一步详述。应理解，除非有相反的声明，否则描述为优选或有利的特征适用于本发明的所有方面。另外，除非另外说明，否则任何描述为优选或有利的特征均可与所描述的任何其它特征相结合。步骤i)_筛杳非神经元细胞中的细胞周期调控缺陷可使用WO 02/073212(其内容通过引用整体并入本文)描述的方法或者如所附实施例中所述地对该方法的改良来筛查测试对象的非神经元细胞中G1/S检验点的细胞周期调控缺陷。最优选地，所述测定利用从待测试人对象分离的非神经元细胞在体外实施。所述非神经元细胞可以是下述任何非神经元细胞类型，其表现出与阿尔茨海默症神经元中相同的G1/S期转换的细胞周期调控缺陷。在一个实施方案中，所述方法利用从对象分离并经体外培养的淋巴细胞来实施。能够测试非神经元细胞类型中细胞周期调控缺陷的存在情况具有明显的实际优势。使用淋巴细胞是特别方便的，因为它们很容易从血样中分离出来，并且可以在体外进行培养。另一实施方案涉及使用成纤维细胞，特别是可以从皮肤活检方便获取的皮肤成纤维细胞。非神经元细胞样品通常应不包括癌细胞。在某些非神经元癌细胞中可鉴定出细胞周期缺陷。因此，本发明的诊断测定优选地使用非癌性的非神经元细胞实施，或者使用来自不具有癌症临床表现之患者(例如，不具有肿瘤、含癌症相关浓度之癌症特异性抗原的患者)、年轻患者(即，非AD相关年龄的患者(例如，在该年龄时，少于20%、更优选地少于10%、更优选地少于5%、更优选地少于 2 %、更优选地少于以及最优选地少于0. 的一般人群表现出AD或AD相关的病症) 的细胞。由于癌症通常不与痴呆或认知功能障碍相关联，并且AD和AD相关的病症通常不与肿瘤抗原表达和致瘤性相关联，因此本领域普通技术人员可以容易地对癌症和AD/AD相关病症进行差别性诊断。如WO 02/073212中详述地，有几种方法可用于筛查非神经元细胞中G1/S期转换的细胞周期调控缺陷的存在情况。在一个实施方案中，筛查细胞周期调控缺陷的存在情况可通过如下方式实现首先诱导细胞分裂，然后通过加入细胞分裂抑制剂物质引发细胞周期阻滞，并测试细胞的G1/S细胞周期调控机制对所加入的细胞分裂抑制剂物质的响应。细胞分裂抑制剂物质通常是Gl特异性抑制剂，特别优选雷帕霉素(rapamycin)。 通过加入有丝分裂刺激物(例如一种或更多种生长因子)，可诱导细胞分裂。如果使用淋巴细胞进行测试的话，可以使用植物血凝素诱导细胞分裂。其基本原理是首先刺激细胞分裂(例如，使用有丝分裂刺激物)，然后使用细胞分裂抑制剂(例如雷帕霉素或任何其它已知的Gl抑制剂)试图将细胞周期阻滞在Gl阶段， 然后评估该处理对细胞周期调控系统的作用。可通过多种不同的手段(总结如下)评估针对细胞周期调控的作用。使用细胞分裂抑制剂进行处理在本文中可称为“细胞周期抑制性处理”或“抑制性处理”。如果在G1/S转换存在细胞周期调控缺陷的话，这将影响试图进行细胞周期阻滞之细胞的响应。一般地，在G1/S期存在细胞周期调控缺陷会导致对使用细胞分裂抑制剂之处理的响应降低，即，抑制性处理对具有细胞周期缺陷之细胞在G1/S检验点的阻滞不太有效。在加入有丝分裂刺激物之前和之后以及在试图阻滞细胞周期以测试细胞对细胞周期抑制性处理(例如，在雷帕霉素存在下进行培养)的响应之前和之后，可实施多种操作。以下给出了可用于本发明中的优选操作的非穷尽性列表，本领域技术人员还将了解其它合适的操作(1)由于暴露于Gl抑制剂(例如，雷帕霉素)导致的对象细胞的细胞周期分析和细胞周期之Gl期相对延长的计算。可使用公式RL= IOOf-IOO (表示为百分数)来计算由于暴露于细胞分裂抑制剂导致的Gl期的相对延长。“f”是暴露于细胞分裂抑制剂的抑制性处理或诱导细胞周期阻滞的刺激物的细胞(来自测试对象的非神经元细胞)的Gl期时间(TGltr)与未暴露于抑制性处理的未处理对照细胞(即，也是来自于测试对象的非神经元细胞)的Gl期时间(TGlc)的比率。可根据以下关系计算“f”f = TGltr/TGlc = [1η2 In(2Gltr)][In(2Glc)]/[In(2Gltr)][ln2 ln(2Glc)]Gltr是暴露于抑制性处理(例如，细胞分裂抑制剂)的培养物中Gl期细胞的分数Glc是来自同一对象的对照细胞中Gl期细胞的分数(Darzynkiewicz Z (1993) In Fantes P and Brooks R 编，The cell cycle. Oxford University Press, Oxford,43 68 页)可采用多种技术获得TGltr和TGlc的值。在一个实施方案中，可通过确定经处理细胞(使用Gl抑制剂处理的来自对象的非神经元细胞)和未处理对照细胞(来自同一对象的未经Gl抑制剂处理的非神经元细胞)中处于细胞周期各时期之细胞的比例来获得TGltr 和TGlc。可通过对经适当标记的细胞进行荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting, FACS分析)来容易地确定处于细胞周期各时期的细胞的比例，如所附实施例所述。在一个实施方案中，可使用能整合入DNA的试剂(例如碘化丙啶或核苷酸类似物) 来标记细胞(在FACS分析之前)。也可通过免疫细胞化学来标记S期细胞的细胞周期蛋白 A(Cyclin A)。G1/S期转换存在细胞周期调控缺陷可通过如下情形指示与G1/S期转换不具有细胞周期调控缺陷的对照细胞相比，G1/S期转换存在细胞周期调控缺陷时在Gl抑制剂存在下Gl期的相对延长减少。合适的对照细胞包括来自年龄匹配的对照对象的细胞。在Gl/ S期转换不具有细胞周期调控缺陷的对照细胞不应与用于计算RL的“未处理对照”细胞相混淆，后者是来自测试对象的未暴露于Gl抑制剂的细胞。如所附实施例所举例说明地，与阿尔茨海默症患者相比，对照对象中由雷帕霉素培养分裂淋巴细胞所引起的TGl相对延长显著更长。
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(2)评估细胞增殖特征，其作为暴露于Gl抑制剂(例如，雷帕霉素)的细胞培养物中细胞周期阻滞的指示。在一个典型的筛查中，评估来自同一对象的经Gl抑制剂(例如， 雷帕霉素)处理的细胞和未处理细胞的增殖特征。因为抑制性处理仅在G1/S调控系统完好的情况下才起效，所以与年龄匹配的对照个体相比，阿尔茨海默症患者(和易患AD的对象)中的经处理细胞和未处理细胞之间增殖程度的差异显著较小。换句话说，与不具有Gl/ S缺陷的对照细胞相比，Gl抑制剂(例如雷帕霉素)作为细胞增殖活性抑制剂对具有G1/S 调控缺陷的细胞(即，来自AD患者和易于发生AD的对象的细胞)不太有效。可根据本领域已知的任何标准方案来实施增殖测定。在一个非限制性的实施方案中，可使用细胞毒性测定来测量使用或不使用Gl抑制剂(例如，雷帕霉素)的非神经元细胞(例如，淋巴细胞)培养物中的细胞数目。有多种商业化的细胞毒性测定适用于这一目的，其包括乳酸脱氢酶(LDH)测定(如在所附实施例中使用地)。该测定的结果可用于计算针对测试对象和正常对照的使用或不使用Gl抑制剂的培养物中细胞分裂的数目(n-n’)。 所述测定的一个优选的实施方案是基于使用或不使用雷帕霉素的淋巴细胞培养物。该测定得出的一项测量结果是使用与不使用Gl抑制剂的培养物中细胞分裂数目之间的差异。本发明人发现，这一结果可作为诊断的依据。观察到，与对照对象相比，阿尔茨海默症对象的使用Gl抑制剂(雷帕霉素)处理的培养物与未处理培养物之细胞分裂的相对延长显著较短。上述实施方案是非限制性的；可以使用其它已知的技术进行增殖测定，所述技术例如 MTT 存活测定(可购自 Chemicon Internationl Ltd,参见 Mosmann，T. In J. Immunol. Methods,1983，卷 65，55-63)。(3)对细胞周期调控蛋白或mRNA表达的评估。可使用本领域熟知的标准技术(例如，免疫印迹、western印迹、ELISA或相关方法)来评估细胞周期调控蛋白的表达。还可通过标准方法(例如，杂交技术、微阵列技术分析或相关方法或者基于扩增的技术(例如 RT-PCR或基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA))) 来实现对编码细胞周期调控蛋白之mRNA的表达的评估。可用于本发明的合适mRNA检测/ 定量方法是本领域技术人员熟知的。这些方法中的某些方法(例如RT-PCR)依赖于对相关 mRNA之cDNA拷贝的检测/定量。阿尔茨海默症中存在的细胞周期调控缺陷可导致细胞周期调控蛋白及其相应的 mRNA表达模式的改变。因此，筛查特定细胞周期调控蛋白和/或其相应的mRNA表达的变化可用于鉴定G1/S期细胞周期调控缺陷的存在情况(以及确定其程度)。此外，可将细胞周期调控蛋白的表达用作细胞周期进展的标志物。因此，可通过一种或更多种细胞周期调控蛋白的表达来评估细胞对抑制性处理的响应，从而确定抑制性处理造成测试对象的细胞发生细胞周期阻滞的程度。合适的细胞周期调控蛋白包括但不限于⑶KN3、pl5ink4B、 pl6ink4A、pl9ink4D、p27kipl、p21cipl、p57kip2 和 TP53。此外，cyclin A 和 cyclin B 表达可分别用作S期和G2期的生物标志物。在一个具体实施方案中，可通过ELISA测定cyclin A和/或cyclin B的表达。所有以上列出的蛋白质以及编码其的基因的序列都是公开可得的。可用于检测这些蛋白质之每一种的抗体是市售的。(4)通过本领域已知的任何方法评估细胞生存力和细胞死亡。当增殖细胞被阻滞在G1/S转换时，可发生两种可能的“下游”现象(即，分化或程序性细胞死亡)中的一种。这些下游现象可用作细胞群中存在G1/S转换调控缺陷的指示，因为如果G1/S转换的调控有缺陷，则G1/S细胞周期阻滞的下游效应也会出现异常。与对照细胞相比，测试对象的细胞响应于抑制性处理的细胞死亡程度更低或者细胞生存力程度更高，其可作为G1/S调控缺陷的指示。(5)使用标准技术评估细胞死亡相关的(引发或阻止细胞死亡的)蛋白质或mRNA 的表达。在此实施方案中，使用细胞死亡相关的蛋白质或相应mRNA的表达作为用引发Gl/ S期转换细胞周期阻滞之细胞分裂抑制剂处理的下游效应的间接评估。合适的细胞死亡相关蛋白质包括bcl-2家族成员的蛋白质，其中包括多种本领域已知的蛋白质。(6)对非神经元细胞的DNA含量进行评估，使用或不使用细胞周期分析。在此实施方案中，测量测试对象的经细胞分裂抑制剂处理的细胞中的DNA含量提供了所述细胞在 G1/S期转换存在调控缺陷的间接指示。这一方法的基本原理是G1期细胞和G2期细胞(其已经历过细胞周期的DNA复制阶段)之间的DNA含量具有差异。当处理正常细胞群(即， 在G1/S期不存在调控缺陷)以引发Gl或G1/S期的细胞周期阻滞时，大多数细胞会停留在 Gl期。但是，如果细胞在G1/S期存在调控缺陷，则一定比例的细胞会通过G1/S期检验点并经历DNA复制。因此，与G1/S期不存在调控缺陷的对照细胞相比，测试对象之细胞在接受引发细胞周期阻滞于Gl期的处理后DNA含量增加可作为G1/S期存在调控缺陷的指示。以上列出的适用于测试非神经元细胞(特别是培养的淋巴细胞)对使用细胞分裂抑制剂进行之抑制性处理的响应的技术旨在举例说明，而非限制本发明。WO 02/073212中描述了另一些合适的技术。可对针对G1/S细胞周期调控缺陷的不同测定的结果进行统计学结合以用于诊断预测目的，从而获得具有特定测试结果之对象发生(或不发生)阿尔茨海默症的风险或“几率”的量度。可使用统计学分析(例如逻辑回归分析)来评估对于诊断(例如，AD相对于对照)或预测AD患病风险具有显著贡献之变量的相对贡献，并可用于将两种不同测定方法的结果进行结合，从而获得用于计算具有一组特定测试结果的对象发生(或不发生)AD之几率的诊断预测工具。测定结果(变量)的合适“结合”包括但不限于在使用或不使用Gl 抑制剂的培养物(例如，使用或不使用雷帕霉素培养的淋巴细胞)中细胞分裂数目之间的差异(变量n-n’)与使用Gl抑制剂时(例如使用或不使用雷帕霉素培养的淋巴细胞)TGl 的相对延长(协变量TGl_Rapa)相结合，如本发明实施例所述。步骤ii)_apoE4基因分型apoE基因多态性的分子性质已有详细地表征(参见OMIM数据库登录号107741 及其中引用的参考文献)。简单地说，载脂蛋白E具有三种主要的同工型(ap0E2、ap0E3和 apoE4)，它们分别由三种等位基因(印silon 2、3和4)编码。这三种等位基因在人对象中可存在六种可能的配对，即2/2、2/3、2/4、3/3、3/4和4/4。apoE基因分型方法是本领域中普遍已知的。在一个非限制性的实施方案中(在所附实施例中举例说明地)，可使用标准的 DNA纯化技术从测试对象细胞(如PBL)制备基因组DNA。然后，可通过PCR-RFLP (如所附实施例中所述)或通过任何其它合适的基因分型方法来确定对象的apoE基因型。基因分型方法本身不是本发明的发明目的所在，这是因为测试对象的基因型是绝对的，其不会因任何特定基因分型方法而改变。因此，本发明包括确定对象的apoE基因型。如本文所使用地，这种测定步骤包括对先前未曾确定基因型的对象进行重新apoE基因分型，以及考虑使用该对象先前已确定过的apoE基因型数据。在本发明方法的所有实施方案中，测试对象中存在的apoE4等位基因的数目可用作协变量以与针对G1/S调控缺陷的测定(测试i)结果进行统计学结合。在这样的实施方案中，所选用的基因分型方法应当至少允许测定测试对象中存在的apoE4等位基因的数目。尽管任何给定测试个体的基因型是固定的，但是考虑到待筛查的一群测试对象和对照对象，可以将每个个体中存在的apoE4等位基因数目(0、1或2)作为变量处理，以用于统计学分析。统计学结合为了充分实现本发明的优点和优势，须将步骤i)的测定结果(或测量结果)与步骤ii)获得的基因分型结果相结合。在本发明的所有方法中，可以对步骤i)和步骤ii)的结果进行“结合”，从而获得具体结果/诊断或预后预测结果的概率值。对于任何给定的对象来说，可通过将步骤i)和步骤ii)的结果作为变量输入统计学算法中来计算概率值。用于计算概率值的算法本身可通过如下方式获得将步骤i)和步骤ii)的测定应用于一组测试对象(例如，AD患者) 和对照对象(非AD患者)，然后将结果进行统计学结合以确定所述两种(独立测定的)测试结果对诊断(或预后)预测结果的贡献(例如，AD患者相对于对照)。这可通过如下方式来实现将步骤i)的结果(例如RL、TGl_Rapa、n-n’或其任意统计学结合)作为第一变量，并将apoE4基因型(例如apoE4等位基因的数目)作为协变量，如所附实施例所述。可将标准的统计学分析方法(例如逻辑回归)用于此一目的。本发明人已发现，当以这种方式将两种(独立获得的)测定结果相结合时，与仅使用步骤i)的测定或步骤ii)的测定相比，通过将步骤i)的结果或步骤ii)的结果相结合作为临床结果生物标志物(例如AD患病风险的预测工具)，所得结果的整体准确性提高了。所获得的“组合”测定还表现出高的临床特异性(通常大于90% )和灵敏度(通常大于65% )。与apoE4基因型(步骤ii)相结合的针对G1/S期细胞周期调控缺陷之测定(步骤i)的“结果”本身也可以是“经结合的”结果。如上文所解释地，可以将两种不同的指示 G1/S期细胞周期调控缺陷存在情况之测定的结果进行结合(例如，通过逻辑回归来实现)， 以用于预测发生阿尔茨海默症的风险(几率)。根据本发明，可将这种经结合的结果本身作为变量，并将其与apoE基因型协变量(具体来说是apoE4等位基因的数目)相结合(例如通过逻辑回归来实现)，从而获得诊断预测。虽然逻辑回归是用于对测试结果进行统计学结合的优选方法，但是还可使用其它统计学技术，包括例如ANOVA、Levene检验、student Newman-Keuls检验和卡方检验等。一旦获得诊断预测工具(即基于针对G1/S期缺陷和apoE基因型之独立测定的结果来计算几率(例如，通过逻辑回归来实现)的算法，可使用ROC (receiver operating characteristic，接受者操作特性)分析来确立临界点，即，基于所述两种独立测定的结果的结合(即，几率计算)，在所述临界点将测试对象划分为“AD” (或“可能是AD”)或者“非 AD”(或“可能不是AD”)。可应用该临界值以给出二元读数，即将患者样品划分为“AD”或 “非 AD，，。应注意，已显示ApoE4基因分型本身或与认知功能缺陷评估联用对临床诊断AD是
12无效的。然而，本发明人发现，将ApoE4基因分型与G1/S期细胞周期调控缺陷测定相组合， 当将组合测定的结果用于诊断预测时，与仅使用步骤i)的结果用于诊断预测相比，前者出人意料地提高了诊断正确之患者的数目。测定的临床应用本发明的方法用于通过将两种独立测定的结果进行结合来获得诊断标准。这些测定之一检测人对象的非神经元细胞中G1/S期转换细胞周期调控缺陷的存在情况。这一细胞周期缺陷在文献中已有描述，并且已知其与阿尔茨海默症患病风险有关。但是，与仅根据G1/S期缺陷的测定结果得出的诊断预测相比，将G1/S期细胞周期缺陷测定与apoE4基因分型的结果相结合提高了诊断预测的临床可靠性和可用性。在这方面，应当指出，并非将 apoE4基因型本身用作本发明中临床结果(例如，发生AD的“风险系数”)的预测工具，而是将apoE4基因分型结果与针对G1/S细胞周期调控缺陷之测定获得的结果相结合以获得结合的结果，从而可用作诊断标准(即诊断预测的基础)。事实上，本发明人已发现，针对细胞周期调控缺陷之测定(步骤i)的结果不依赖于已有的apoE4基因型，因此这两种测定结果从技术角度(以及生物学角度)上讲是相互独立的。然而，当将所述两种(独立)测定的结果相结合时，所得的诊断标准比仅使用二者中任一种测定的结果(在诊断预测方面) 表现更好。在本发明的多个方面中，基本方法如下i)筛查对象中所述对象之至少一个非神经元细胞中是否存在G1/S期转换的细胞周期调控缺陷，或其程度，ii)确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果进行统计学结合，可用于多种不同的临床应用中。在某些实施方案中，所述基本方法可用于评估阿尔茨海默症的患病风险，或用于检测非常早期的AD发病(在“经典”的AD症状(特别是痴呆)出现之前)。传统上，将阿尔茨海默症定义为导致痴呆的脑的进行性退行性疾病。因此，AD的主要外在症状是痴呆，但是并非所有表现为痴呆的患者都患有阿尔茨海默症。尽管已知阿尔茨海默症是导致痴呆(特别是在65岁以上的对象中)的主要原因，但是还存在另一些原因。通过淀粉样蛋白斑块和缠结等病理特征的存在情况可将AD与其它痴呆相区分。本发明人假定阿尔茨海默症实际上应被视为是由细胞周期调控缺陷(特别是Gl/ S检验点的调控缺陷)导致的疾病。不希望受理论的约束，本发明人认为，神经元中的缺陷是阿尔茨海默症的病理特征(即淀粉样蛋白的积聚)和症状(例如痴呆)的诱因。在非神经元细胞(如淋巴细胞)中也可检测到同样的细胞周期调控缺陷，这构成了本发明之测定的基础。由于细胞周期调控缺陷是诱因，并因而在发生可识别的AD临床症状(例如痴呆) 之前出现，因此，本发明的测定方法提供了改进的诊断预测，与仅根据G1/S期细胞周期缺陷的评估进行诊断预测相比，本发明的测定方法在评估AD患病风险中将具有重要的临床应用。换句话说，本发明的测定方法可鉴定出易患AD的对象(因其存在相应的细胞周期调控缺陷)，无论该患者是否表现出症状。在某些实施方案中，本发明的方法可用于筛查无症状的对象以评估发生完全显现(full blown)之AD症状的风险/易患性，其基于细胞周期调控缺陷的存在情况。在另一些实施方案中，可使用同样的基本方法来筛查不同程度的“有症状”对象。在某些实施方案中，可将本发明方法应用于已符合NINCDS/ADRDA标准的人对象，在这种情况下，本发明的方法可以提供一种独立于神经心理学症状(即，不基于认知功能的评估)的额外的诊断标准。因此，本发明方法提供的额外的诊断标准可为NINCDS/ADRDA提供有用的辅助手段，以协助临床诊断活体患者。在另一些实施方案中，本发明的方法可应用于尚未应用NINCDS/ADRDA标准的人对象或者不符合OTNCDS/ADRDA标准的人对象。在这方面，本发明的方法可视为提供独立于 NINCDS/ADRDA标准的、对活体患者进行阿尔茨海默症临床诊断(或者至少用于鉴定很可能患有AD的对象)的替代性基础。在一个特别重要的实施方案中，所述基本方法可用于筛查表现出轻度认知障碍 (mild cognitive impairment，MCI)的对象，从而鉴定出具有发生完全显现之AD症状(即， 痴呆)的风险/易患性的对象或者甚至可被视为“早”期AD (无论通过经典症状或是病理特征(即，脑中淀粉样蛋白的积聚)的存在来定义)的对象。本发明人已在一项纵向研究中表明，与不表现细胞周期调控缺陷的MCI患者相比，额外地对非神经元细胞G1/S期中细胞周期调控缺陷筛查结果呈阳性的MCI患者表现出认知功能减退的初次迹象平均要早10年。 因此，细胞周期缺陷的存在情况预测了 MCI患者将要发生认知功能缺陷的“风险”。在另一些实施方案中，可以认为同样的基本方法用于“诊断”，或者至少用于辅助对活体患者进行AD临床诊断。在这样的实施方案中，测试对象可以是表现出与AD—般性相关(但不必须是仅与AD相关)之症状的人对象。一个典型的实例是表现出认知功能缺陷/认知功能减退或痴呆的患者。在这样的患者群体中，可使用本发明测定的基本方法来验证表现出认知功能障碍/痴呆症状的患者确实具有相应的与AD相关的细胞周期调控缺陷，并因此证实所述痴呆是AD引起的症状，而非另外一些疾病引起的整整。AD表现出的另一些“症状”可包括大脑结构的变化，其可通过使用成像技术(例如MRI)呈现出来。在临床实践中，使用本发明的测定方法得到的诊断标准(单独应用，或者与针对AD症状的其它诊断测试联用)将为辅助在活体患者AD诊断的所有方面提供有价值的额外工具。可获得针对构成阿尔茨海默症之病理基础的细胞周期调控缺陷的准确测试显著提高了诊断病症的能力，特别是使得早期诊断成为可能。根据本发明人的工作，显然，在完全发展为痴呆的临床征兆出现之前，即可在外周(非神经元)细胞(如淋巴细胞)中检测出细胞周期调控缺陷。因此，本发明的方法提供了早期诊断阿尔茨海默症(尤其是检测处于疾病之临床前阶段的个体)的工具，以及鉴别尚未发生阿尔茨海默症但具有患病风险的个体的工具，其基于细胞周期调控缺陷的存在情况。此外，可获得针对构成阿尔茨海默症之病理基础的细胞周期调控缺陷的准确测试还显著提高了确定用于治疗阿尔茨海默症的疗法在接受该疗法的人对象中治疗疗效(或候选疗法的潜在治疗效力)的能力。这种疗法或候选疗法可包括施用药物、方法或方案。因此，举例来说，评估接受阿尔茨海默症疗法或候选疗法之对象的非神经元细胞，以确定G1/S 期转换中细胞周期调控缺陷的程度。对经确定的G1/S期转换细胞周期调控缺陷的程度以及所述对象的apoE4基因型进行评估，从而确定用于治疗所述对象之阿尔茨海默症的疗法或潜在疗法的疗效。
本发明人还发现，在总分为30分的简易精神状况检查(Mini-Mental State Examination, MMSE)中，表现出非神经元细胞中G1/S期转换细胞周期调控缺陷(S卩，在步骤 (i)的测定中结果呈“阳性”)的可能的阿尔茨海默症患者的认知能力下降速度显著加快， 并且存在一个或更多个ApoE4等位基因(即测试呈阳性)的可能的阿尔茨海默症患者的认知能力下降速度也显著加快。另外，当把这两测定结果进行统计学结合从而得到诊断标准时，其与认知能力加速下降的关联性显著增强了。因此，在本发明的另一个方面中，提供了获得如下预后标准的方法，所述预后标准指示由人对象中阿尔茨海默症引起的认知能力下降的可能速度，该方法包括i)测定所述对象之至少一个非神经元细胞中是否存在G1/S期转换的细胞周期调控缺陷，或者测定其程度，ii)确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果相结合，从而获得指示由所述对象之阿尔茨海默症引起的认知能力下降的可能速度的预后标准。此方法可应用于表现出可能是AD的人对象，或者应用于具有阿尔茨海默型痴呆的对象，包括但不限于基于NINCDS/ADRDA标准临床诊断为AD的对象，从而预测所述对象在其病程中认知能力下降的可能速度。本领域技术人员应当清楚，关于本发明前述各方面的具体实施方案同样适用于这一另外的方面。本发明的范围也延伸到以下方法，其中“结合”步骤应用于先前从步骤i)的测定和步骤ii)的测定获得的结果获得人对象中阿尔茨海默症相关诊断标准的方法，该方法包括将筛查人对象中至少一个非神经元细胞中G1/S期转换细胞周期调控缺陷的存在情况的测定得到的结果与同一对象的apoE4基因分型得到的结果相结合，从而获得阿尔茨海默症相关诊断标准。用于提高筛查阿尔茨海默症相关之细胞周期调控缺陷的存在情况的准确性的方法，该方法包括将筛查人对象中至少一个非神经元细胞中G1/S期转换细胞周期调控缺陷的存在情况的测定得到的结果与同一对象的apoE4基因分型得到的结果相结合，从而与仅从细胞周期调控缺陷测定获得的结果相比，这一结合结果的准确性得到提高。评估人对象发生阿尔茨海默症之风险的方法，该方法包括将筛查人对象中至少一个非神经元细胞中G1/S期转换细胞周期调控缺陷的存在情况的测定得到的结果与同一对象的apoE4基因分型得到的结果相结合，从而评估发生阿尔茨海默症的风险。辅助临床诊断活体人对象中阿尔茨海默症的方法，该方法包括将筛查人对象中至少一个非神经元细胞中G1/S期转换细胞周期调控缺陷的存在情况的测定得到的结果与同一对象的apoE4基因分型得到的结果相结合。评估候选疗法在接受这一疗法的人对象中治疗阿尔茨海默症的效力的方法，该方法包括将筛查人对象中至少一个非神经元细胞中G1/S期转换细胞周期调控缺陷的存在情况的测定得到的结果与同一对象的apoE4基因分型得到的结果相结合，从而获得与所述用于治疗阿尔茨海默症的候选疗法效力相关的诊断标准。获得指示人对象中由阿尔茨海默症引起的认知能力下降之可能速度的预后标准的方法，该方法包括将筛查人对象中至少一个非神经元细胞中G1/S期转换细胞周期调控缺陷的存在情况的测定得到的结果与同一对象的apoE4基因分型得到的结果相结合，从而获得指示所述对象中由阿尔茨海默症引起的认知能力下降之速度的预后标准。参考以下实验例，将会进一步了解本发明。实施例1以下方法举例说明了使用本发明的方法对受试群体(临床诊断为阿尔茨海默症 (AD)的患者、具有轻度认知障碍(MCI)的患者以及年龄匹配的对照对象)进行的测试。测试对象对于“临床诊断”为阿尔茨海默症来说，使用NINCDS标准诊断AD。连续几年未表现出认知功能障碍的对象可作为对照对象。使用标准的神经心理学标准诊断轻度认知障碍 (MCI)。制聚i)_Tfjffl胞冲G1/S其月_胞細膽細以下方法用于评估来自测试对象和对照对象之外周淋巴细胞的制备物的G1/S细胞周期调控。1)样品采集和淋巴细胞分离从人对象抽取静脉血(约5 IOml)样品置于肝素化的vacutainer管中。在采集后，样品最长可在室温下存储/运输36 48小时。根据制造商的说明，使用Lymph0pri5pTM(AXiS Shield，UK)分离外周淋巴细胞。一经分离，将淋巴细胞(需要时)在_80°C下储存于90%胎牛血清(fetal calf serum,FCS, 热灭活)外加10%DMS0中。-80°C储存适于储存数月，而更长期地储存样品应将样品置于液氮中。
cons] 2)含有或不含Gi抑泡丨齐H (雷巾白g素)mmmmm^i在37°C、5% CO2的条件下，使用RPMI 1640生长培养基培养外周淋巴细胞(需要时解冻储存的样品)48小时至达到指数生长，所述培养基中还添加了 15% FCS (热灭活)、 2% L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素以及2. 5%植物血凝素(PHA)。用96孔板制备细胞培养物，针对每位患者(测试对象)分配至6或8个孔中。因此，一个单板可容纳11组患者的样品，以及一组标准样品。一旦细胞达到指数增长，仅使用(上述)生长培养基或使用同样的生长培养基外加lOOng/ml雷帕霉素处理淋巴细胞培养物，针对每位患者一式三份/ 一式四份。24小时后收获细胞培养物。用于细胞毒性测试(LDH测定)的样品于_20°C冻存， 而用于流式细胞术分析的样品则用85%冷乙醇固定。3) LDH细胞毒性测定根据制造商提供的操作说明，使用Promega的CytoTox 96 非放射性细胞毒性测定试剂盒进行LDH细胞毒性测定，从而测量3)中制备的细胞培养物中的细胞数目。在96孔板中进行该测定，每孔使用30 μ 1淋巴细胞培养物和50 μ ILDH底物混合物(底物混合物是CytoTox试剂盒中的一个组件，使用前需进行稀释)。一式三份地分别测试使用或不使用雷帕霉素培养的患者样品。测定板中还包括稀释的LDH阳性对照标准(用淋巴细胞培养基系列稀释的LDH阳性对照，按1 2500、1 5000、1 10，000、1 20，000、 1 40000,1 80，000和1 160，000稀释，一式三份，每份30 μ 1)，从而构建校准曲线。在向患者样品和校准样品加入底物混合物之后，将测定板在室温下于暗处孵育 15 30分钟，连续地观察颜色的变化以确保校准曲线保持线性且主要样品的颜色强度不超出校准曲线。然后，向每个孔中加入50 μ 1冷的终止溶液(CytoTox试剂盒中的组件)以终止反应。然后读取490nm处的光密度。4)流式细胞术和细胞周期分析以400g于室温离心经乙醇固定的96孔板中淋巴细胞培养物(含有或不含雷帕霉素)10分钟(步骤3末尾)，自然减速。除去上清，并用每孔0. 300ml冰冷的PBS重悬细胞沉淀。再次以400g于室温离心所述板10分钟，自然减速。除去上清，并用每孔0.080ml碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色溶液重悬细胞沉淀。PI染色溶液如下制备向IOml PBS (不含Ca和Mg，组织培养级，购自Sigma)中添加200 μ 1 PI 储液(lmg/ml)100 μ 1 RNA 酶 A 溶液(10mg/ml)10 μ 1 Triton X混勻，始终避光保存。设置流式细胞仪(FacsCalibur BD)，使其能够很好地区分Gl和G2的峰(至少分开200单位)。细胞周期各阶段的判断是基于MG Ormerod的推荐(Flow Cytometry，第3版，第 95 页)。用作标志量度的PI读数对应于Gl峰和G2峰，参数X的计算基于如下公式X = (G2 峰-Gl 峰)/4根据这些量度，设立如下标志Gl 期细胞(Gl 峰-X)至(Gl 峰 +X)S 期细胞(Gl 峰 +X)至(G2 峰-X)G2 期细胞(G2 峰-X)至(G2 峰 +X)凋亡标志低于(Gl峰-X)的所有所有分裂细胞(Gl峰-X)至(G2峰+X)根据这些量度，如下计算细胞群比重(cell population density)S期细胞群S期细胞/(LC-UC标志内的所有分裂细胞)Gl期细胞群G1期细胞/(所有分裂细胞)G2期细胞群G2期细胞/ (所有分裂细胞)5)结果分析LDH细胞毒性测定给出了每种淋巴细胞培养物(含有或不含雷帕霉素)中总细胞数目的值。根据细胞数目的数据，可以推导出细胞分裂次数(η)和细胞群倍增时间 (population doubling time，PDT)。然后，使用通过分析FACS数据获得细胞群比重外加PDT结果来计算参数TGl (Gl期相对延长)。这可使用如下等式获得DTln2-ln(2-/Gl) ω In 2fG1是通过流式细胞术测量的细胞周期中处于Gl期的细胞比例。最后，比较针对来自同一测试对象的经雷帕霉素处理和未处理的淋巴细胞培养物计算得出的TGl值。可以用逻辑回归来结合变量n-n’和TGl_Rapa以得出用于诊断预测的几率值，如表1所示。表1-逻辑回归，淋巴细胞培养物测定的结果
逻辑回归
因变量YDG—R0C
ImIMl
如果P小于该值则输入变量θΓθ5
如果P大于该值则消除变量O
样本大小69
Y= O 时的情形43(62. 32% )
Y= 1 时的情形26(37. 68% )表1.1-整体模型拟合
零模型-2对数似然值91.42247
全模型-2对数似然值“ 66.73814卡方挣验— 24.6843
生水平“P < 0.0001 —表1.2-系数和标准误差
变量系数标准误差 P
(n-n'l-10,50492.9555 0.000379
to1 rapa0.38220.1416~~ 0.00696F 疲— -9.3555— ~~
模型中不包括的变量—‘
“f_D v_R"I
18
权利要求
1.获得人对象中阿尔茨海默症相关诊断标准的方法，该方法包括i)筛查人对象中至少一个非神经元细胞中是否存在G1/S期转换的细胞周期调控缺陷， )确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果相结合，从而获得与阿尔茨海默症相关的诊断标准。
2.提高筛查阿尔茨海默症相关细胞周期调控缺陷之存在情况的准确性的方法，该方法包括i)筛查对象中所述对象之至少一个非神经元细胞中是否存在G1/S期转换的细胞周期调控缺陷， )确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果相结合，从而与所述步骤i)获得的结果相比，结合所得结果的准确性提高。
3.评估人对象中发生阿尔茨海默症之风险的方法，该方法包括i)筛查对象中所述对象之至少一个非神经元细胞中是否存在G1/S期转换的细胞周期调控缺陷， )确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果相结合，从而评估发生阿尔茨海默症的风险。
4.根据权利要求3的方法，其中步骤iii)包括将所述步骤i)的结果和步骤ii)的结果作为变量输入统计学算法中，以计算出所述对象发生阿尔茨海默症之风险的概率值。
5.根据权利要求3或权利要求4的方法，其中所述人对象不具有阿尔茨海默症的症状或者表现出轻度认知功能障碍。
6.辅助临床诊断活体人对象中的阿尔茨海默症的方法，该方法包括i)筛查对象中所述对象之至少一个非神经元细胞中是否存在G1/S期转换的细胞周期调控缺陷， )确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果相结合。
7.根据权利要求6的方法，其中步骤iii)包括将所述步骤i)的结果和步骤ii)的结果作为变量输入统计学算法中，以计算出所测试对象患有阿尔茨海默症的概率值。
8.根据权利要求6或权利要求7的方法，其中待测试的所述人对象表现出一种或更多种符合阿尔茨海默症的症状。
9.根据权利要求8的方法，其中所述符合阿尔茨海默症的症状包括认知能力下降或痴呆。
10.评估候选疗法在接受该疗法的人对象中治疗阿尔茨海默症之效力的方法，该方法包括i)测定所述对象之至少一个非神经元细胞中G1/S期转换细胞周期调控缺陷的程度， )确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果相结合，从而获得所述候选疗法用于治疗阿尔茨海默症之效力相关的诊断标准。
11.获得指示人对象由阿尔茨海默症引起之认知能力下降的可能速度的预后标准的方法，该方法包括i)测定所述对象之至少一个非神经元细胞中是否存在G1/S期转换的细胞周期调控缺陷，或者测定其程度， )确定同一对象的apoE4基因型，以及iii)将步骤ii)获得的结果与步骤i)获得的结果相结合，从而获得指示所述对象之由阿尔茨海默症引起的认知能力下降的速度的预后标准。
12.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述筛查或测定G1/S期转换细胞周期调控缺陷的存在情况通过如下方式实现诱导所述非神经元细胞发生细胞分裂，并测试所述细胞对细胞分裂抑制剂物质的响应，其中与G1/S期转换不存在细胞周期调控缺陷的对照组细胞相比，来自所述对象的细胞对所述细胞分裂抑制剂物质的响应降低作为G1/S期转换存在细胞周期调控缺陷的指示。
13.根据权利要求12的方法，其中所述细胞分裂抑制剂物质是Gl抑制剂。
14.根据权利要求13的方法，其中所述Gl抑制剂是雷帕霉素。
15.根据权利要求12至14中任一项的方法，其中所述细胞对所述细胞分裂抑制剂物质的响应通过计算来自所述对象的非神经元细胞中细胞周期Gl期的相对延长来测试，与Gl/ S期转换不存在细胞周期调控缺陷的对照细胞相比，在所述细胞分裂抑制剂物质存在下所述细胞Gl期的相对延长减少作为G1/S期转换存在细胞周期调控缺陷的指示。
16.根据权利要求12至14中任一项的方法，其中所述细胞对所述细胞分裂抑制剂物质的响应通过评估细胞增殖活性来测试，其中与G1/S期转换不存在细胞周期调控缺陷的对照细胞相比，在所述细胞分裂抑制剂物质存在下细胞增殖活性增加作为G1/S期转换存在细胞周期调控缺陷的指示。
17.根据权利要求16的方法，其中细胞增殖活性如下评估与不使用细胞分裂物质的测试对象培养物中非神经元细胞样品相比，计算使用细胞分裂抑制剂物质培养的测试对象中非神经元细胞样品的细胞分裂时间的相对延长。
18.根据权利要求16或17的方法，其中细胞增殖活性通过细胞毒性测定来评估。
19.根据权利要求1至18中任一项的方法，其中步骤ii)包括确定所述测试对象携带的apoE4等位基因的数目。
20.根据权利要求1至9任一项的方法，其中步骤i)包括(a)在存在或不存在雷帕霉素的条件下培养来自所述测试对象的外周血淋巴细胞，(b)与来自所述对象的不使用雷帕霉素培养的非神经元细胞相比，计算来自所述对象的用雷帕霉素培养的非神经元细胞样品中细胞周期Gl期的相对延长。(b)与来自不用雷帕霉素培养的测试对象之非神经元细胞样品相比，独立计算来自所述测试对象的使用雷帕霉素培养的非神经元细胞样品中细胞分裂时间的相对延长。(c)将所述部分(a)和部分(b)的结果相结合以得到经结合的结果；步骤ii)包括确定所述测试对象中存在的apoE4等位基因的数目；和步骤iii)包括将步骤i)部分(c)获得的结合结果与步骤ii)确定的apoE4等位基因数目相结合。
21.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述非神经元细胞是淋巴细胞。
全文摘要
本发明涉及对活体患者进行阿尔茨海默症(Alzheimer′s disease，AD)或早期阿尔茨海默症的临床诊断。特别地，本发明提供了一种筛查方法，其可用于对活体人对象进行阿尔茨海默症的辅助诊断或者用于鉴定人对象针对阿尔茨海默症的易患性。
文档编号C12Q1/68GK102482721SQ201080040701
公开日2012年5月30日 申请日期2010年7月16日 优先权日2009年7月16日
发明者兹苏桑纳·纳吉 申请人:伯明翰大学