用于评估肝病变的方法

专利名称：用于评估肝病变的方法
用于评估肝病变的方法相关申请本申请要求于2009年9月11日提交的美国专利第61/241，709号的优先权，其内容通过引用整体并入。
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许多潜在威胁生命的肝疾病影响大部分人群。一个这样的实例是乙型肝炎一由乙型肝炎病毒(HBV)引起的肝传染病。由于乙型肝炎可能引起慢性肝疾病，最终可导致肝硬化和肝癌，因此其是主要的全球性健康问题和最严重的病毒性肝炎类型。世界范围内估计有20亿人感染了 HBV，并且多于3. 5亿人患有慢性肝传染病，尽管许多是无症状的。乙型 肝炎在中国和亚洲其他地区是地方流行病。那些地区的大部分人在童年时期已感染了 HBV，并且8%至10%的成年人口是慢性感染的。由HBV引起的肝癌处于男性中癌症三大致死原因的首位，也是女性中癌症的主要原因。已开发且在临床中常规使用了许多肝功能检测。例如，为了评估肝功能的目的，可检测患者血样的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素或Y-谷氨酰转肽酶(GGT)水平。然而，由于肝疾病的流行性和早期检测和治疗的至关重要性，尤其是鉴于大部分肝疾病最初仅表现出轻度症状的事实，存在对可允许早期诊断肝疾病的新的且更灵敏方法的需要。本发明满足了这种或其他相关需要。发明简述—方面，本发明提供了用于检测没有肝疾病指征的个体中肝疾病的方法，所述个体例如从来没有异常的丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测结果的人。所述方法包括以下步骤(a)测定取自所述个体的无细胞血样中白蛋白mRNA的量或浓度；以及(b)将步骤(a)的白蛋白mRNA的量或浓度与标准对照进行比较。与标准对照相比时，步骤(a)得到的蛋白mRNA的量或浓度增加表示个体中存在肝疾病。反之，步骤(a)得到的蛋白mRNA的量或浓度与标准对照基本相同，认为所述个体没有肝疾病。在一些实施方案中，受检测的个体是没有肝疾病发生风险的人。待检测的肝疾病的一些实例包括脂肪肝疾病如非酒精性脂肪肝病、肝硬化、肝纤维化或肝炎(例如甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎)。其他实例包括威尔森氏症、血色病、a-I抗胰蛋白酶缺乏症或糖原贮积病。在一些实施方案中，使用本发明方法检测的肝疾病名单中不包括肝细胞癌，特别是肝移植患者中出现的肝细胞癌。在一些实施方案中，无细胞血样是血浆。在其他实施方案中，无细胞血样是血清。在所要求保护方法的一些实施方案中，步骤(a)包括扩增白蛋白mRNA序列，例如通过聚合酶链式反应(PCR)，包括反转录酶(RT) -PCR、数字PCR或实时定量PCR。在其他实施方案中，步骤(a)包括质谱分析或与微阵列、荧光探针或分子信标杂交。在一些情况下，所要求保护的方法还可以包括在稍后时间利用来自所述个体的同一类型的无细胞血样重复步骤(a)(例如步骤(a)使用血清样品时，重复步骤使用另一血清样品)。当原步骤(a)得到的量或浓度已表明存在肝疾病时，与原步骤(a)相比，在稍后时间(即从重复的步骤(a)得到的)白蛋白mRNA的量或浓度增加表示肝疾病的恶化，而降低则表示肝疾病的改善。同样，所要求保护的方法还可以包括，当原步骤(a)得到的白蛋白mRNA的量或浓度表示没有肝疾病时，在稍后时间利用来自所述个体的同一类型的无细胞血样重复步骤(a)。与原步骤(a)相比，在稍后时间(即重复的步骤(a))的白蛋白mRNA的量或浓度增加，表示出现肝疾病，而基本上没有差异则表示没有肝疾病的生理状况。所要求保护的方法常常以至少I个标准偏差从标准对照增加或降低。在其他情况下，从标准对照这样的增加或降低可以为至少2、甚至3个标准偏差。另一方面，本发明提供了用于诊断没有肝疾病指征的个体或没有肝疾病发生风险的人中肝疾病的试剂盒。所述试剂盒包含这些成分(I)提供健康个体血样中白蛋白mRNA 平均量或浓度的标准对照；以及(2)用于特异性扩增至少一部分白蛋白mRNA的两种寡核苷酸引物。一般而言，试剂盒还包含辅助使用者实施本发明方法的说明手册。试剂盒还可以包含与白蛋白编码序列特异性杂交的多核苷酸探针。在又一方面，本发明还可以体现于包括装置或包括一个或多个这样的设备的系统，所述装置能够实施本文所述的全部或部分方法步骤。例如，在一些情况下，装置或系统在接收取自受检测个体的无细胞血样以检测可能存在的肝疾病或监测肝状况变化时，进行以下步骤(a)测定样品中白蛋白mRNA的量或浓度；(b)将所述量或浓度与标准对照值进行比较；以及(c)提供表示所述个体中是否存在肝疾病变，或者所述个体的肝状况是否有变化(即恶化或改善)的输出结果。在其他情况下，已进行步骤(a)且已将步骤(a)的量或浓度输入设备之后，本发明的装置或系统执行步骤(b)和(c)的任务。优选地，装置或系统是部分或完全自动化的。在实施本发明以上提及的任何方面时，接受利用本发明的方法或试剂盒或装置或系统进行的检测的人，可以是没有肝疾病指征的人，或是无已知肝疾病发生风险的人，或是已接受肝移植且通过常规检测未显示肝异常症状的人。在一些情况下，本发明实施中不包括肝移植后的患者，所述患者以前患有肝细胞癌且肝移植之后肝细胞癌复发。附图简要说明图I.是血浆ALB mRNA浓度的箱形图。箱形的上下限和穿过箱形的线分别指示第75个和第25个百分点及中位数。晶须帽(whisker cap)表示第90个和第10个百分点。异常值显示为空圈。虚线表示通过ROC分析产生的检测肝病变的截止值(835拷贝/mL)。HCC :肝细胞癌；CHB :慢性乙型肝炎。图2.是用于通过血浆ALB mRNA定量检测肝病变的接收者工作特征曲线。图3.是血浆ALB mRNA和丙氨酸氨基转移酶浓度之间的相关性。HCC :肝细胞癌；CHB :慢性乙型肝炎。图4.是肝细胞癌患者的血浆ALB mRNA和血清甲胎蛋白之间的相关性。插图圈出那些具有甲胎蛋白(AFP) < 20u g/L但血浆ALB mRNA浓度> 835拷贝/mL的患者。图5.是对ALB SNP、rs962004进行基因分型获得的质谱图。SNP等位基因通过延伸产物分子质量的差异来分辨。分别代表未延伸的引物、延伸的A和G等位基因的峰值位置如标记所示。X-轴表示了以道尔顿测量的质量，而y-轴表示以任意单位测量的离子电流强度。hME分析可以应用于DNA和RNA产物的基因分型。对于A-等位基因是纯合的且对于G-等位基因是杂合的和纯合的样品，分别显示在上图、中图和下图。图6.是血浆ALT未升高的参与者的血浆ALB mRNA浓度的箱形图。箱形上下限和穿过箱形的线分别指示第75个和第25个百分点和中位数。晶须帽表示第90个和第10个百分点。异常值显示为空圈。虚线表示通过ROC分析所产生的的检测肝病变的截止值(835拷贝/mL)。HCC :肝细胞癌；CHB :慢性乙型肝炎。图7.是用于血浆ALT未升高的个体中通过血浆ALB mRNA顶儿检测肝病变的接收者工作特征曲线。图8.是健康对照和血浆ALT未升高的肝移植后受体的血浆ALB mRNA浓度的箱形图。箱形的上下限和穿过箱形的线分别表示第75个和第25个百分点和中位数。晶须帽表示第90个和第10个百分点。异常值显示为空圈。虚线表示如图I和图6所用的用于检测肝病变的截止值(835拷贝/mL)。
图9.是显示登记时稳定组和不稳定组的血浆ALB mRNA浓度的箱形图。箱形的上下限和穿过箱形的线分别表示第75个和第25个百分点和中位数。晶须帽表示第90个和第10个百分点。异常值显示为空圈。835拷贝/mL的血浆ALB mRNA截止值以点线表示。

图10.是在整个研究期间对(A)稳定组和(B)不稳定组中的受体采集的血样的血浆ALB mRNA浓度。稳定和不稳定受体的血浆ALB mRNA水平分别以具有虚线的空心符号和具有实线的实心符号表示。835拷贝/mL的血浆ALB mRNA截止值水平以点线表示。图11.是患有急性肝并发症的受体的血浆ALB mRNA和ALT的连续测量。图A-F是对不同患者进行的连续测量数据，每一数据代表一名患者。血浆ALB mRNA浓度以具有实线的实圈显示，而ALT活性水平以具有虚线的空圈显示。835拷贝/mL的血浆ALB mRNA截止值水平以点线表示。图12.是患有慢性肝并发症的受体中血浆ALB mRNA和ALT的连续测量。图A-D是对不同患者进行的连续测量数据，每一数据代表一名患者。血浆ALB mRNA浓度以具有实线的实圈显示，而ALT活性水平以具有虚线的空圈显示。835拷贝/mL的血浆ALB mRNA截止值水平以点线表示。图13.是患有脂肪肝疾病的病例和健康对照的血浆ALB mRNA浓度。箱形的上下限和穿过箱形的线分别表示第75个和第25个百分点和中位数。晶须帽表示第90个和第10个百分点。异常值显示为空圈。图14.是通过肝活检(Bx)诊断为患有脂肪肝疾病的病例，或通过磁共振波谱成像(MRI)诊断为患有脂肪肝疾病的病例和健康对照的血浆ALB mRNA浓度。箱形的上下限和穿过箱形的线分别表示第75个和第25个百分点和中位数。晶须帽表示第90个和第10个百分点。异常值显示为空圈。NAFLD :非酒精性脂肪肝病。图15.是图14所示个体的血楽;ALT活性-浓度。虚线表示参考截止值。Bxjg检；MRI :磁共振波谱成像；NAFLD :非酒精性脂肪肝病。定义本申请中所用的术语“肝疾病”是指改变患者的正常肝功能的任何事件或状况，其在患者一生中任意时间长度出现症状。肝疾病的一些实例包括肝癌、肝硬化、肝纤维化、月旨肪肝、非酒精性脂肪肝炎、肝中毒或机械损伤、病毒或细菌传染病例如各种类型的肝炎(例如甲型、乙型或丙型肝炎)、威尔森氏(Wilson)症、血色病、a-I抗胰蛋白酶缺乏症或糖原贮积病。在一些情况下，为了本申请的目的，肝细胞癌可从待诊断的肝疾病中排除。肝疾病通常根据发病持续时间再分为急性或慢性。一般而言，持续超过三个月的病症被认为是慢性肝疾病，而那些持续少于三个月的病症被认为是急性肝疾病。急性肝疾病，如由肝病毒或缺血损伤引起的急性肝炎，通常突然出现但常常与正常肝功能完全恢复相关。另一方面，慢性肝疾病通常不知不觉地出现且进程缓慢，但是很少恢复到完全正常的肝功能。由于肝疾病具有不同的潜在原因和临床症状，有许多不同的方法用于诊断这些肝疾病。常规方法通常包括常规分析血清生化标志物以评估丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素或Y _谷氨酰转肽酶(GGT)水平。可选择地，使用通过超声、CT扫描或MRI的肝胆系统成像来检测肝结构上的异常。当前不知道患者任何那些异常的人，或在过去的任何时间中从未被诊断患有慢性肝疾 病的人，或已知已从以前的急性肝疾病中恢复的人，是“没有肝疾病指征的个体”。这样的人的一个实例是，当前预期没有异常丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测结果的人，因为在过去这个人从未有异常ALT检测结果，或最近的急性肝损伤之后ALT恢复到正常水平。由于某些肝炎病毒如HBV的携带者可能是无症状的，并且明显的肝细胞损伤没有达到通过常规肝功能检测引起任何可检测的异常的程度，已知是任何一种这样的病毒的携带者但从未有异常肝功能检测结果的人，也被认为是“没有肝疾病指征的个体”。不仅没有肝疾病指征，而且没有直系亲属(父母或兄弟姐妹)具有肝疾病指征的人被认为是没有肝疾病发生风险的人。内科专业人员常规采用ALT检测。如果一个人发现肝疾病症状，包括黄疸(淡黄色的皮肤或眼睛)、小便黄赤、反胃、呕吐或腹痛，通常被要求进行ALT检测。为辅助诊断肝传染病如病毒性肝炎或监测服用引起肝相关副作用的药物的患者，也被要求进行ALT测试。血液中ALT水平的正常范围是5IU/L至60IU/L(国际单位/升)。AST水平的正常范围是5IU/L 至 43IU/L。本文所使用的术语“血液”是指用于检测可能的肝疾病或用于评估个体的肝生理状况的来自个体的血样或制剂。“无细胞血样”是指全血中存在的全部细胞至少95%被去除的血液的任何部分，并且包含常规定义的诸如血清和血浆的部分。获自不同的个体或在不同的时间点按照相同的处理步骤获自同一个体的血样，被称为“同一类型的血样”。术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链或双链形式的聚合物。除非特别限定，该术语包含含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参照核酸相似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外指明，特定的核酸序列还暗含其保守的修饰变体(例如简并密码子置换)、等位基因、直系同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补的序列，以及明确指明的序列。具体而言，简并密码子置换可通过产生这样的序列来实现在所述序列中，用混合的碱基和/或脱氧肌苷残基置换其中一个或多个所选择的(或全部)密码子的第三位(Batzeret al. ,NucleicAcid Res. 19 :5081(1991) ；0htsuka et al.，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985)；以及Rossolini et al. , Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA 和由基因编码的mRNA交换使用。术语“基因”意指与产生多肽链有关的DNA区段；其包括与基因产物的转录/翻译和转录/翻译的调控相关的编码区的前后区域(前导区和尾区)，以及单独的编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
在本申请中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可交换使用，指氨基酸残基的聚合物。将该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。如本文所使用，该术语包含任意长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即抗原)，其中的氨基酸残基通过共价肽键相连接。术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及随后得到修饰的那些氨基酸，如羟脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。氨基酸在本文中还可通过常用的三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可以通过它们的常用单字母代码表示。 本申请中所使用的“增加”或“降低”是指与已确定的标准对照有数量上可检出的正或负差异。增加是正差异优选是对照值的至少2-倍，更优选至少5-倍，以及最优选至少10-倍。同样，减少是负差异，优选是对照值的至少50 %，更优选至少80 %，以及最优选至少90%。表示与比较基准有差异或不同的其他术语，如“更多”、“更少”、“更高”和“更低”在本申请中与以与上文所述相同的方式使用。相反地，术语“基本相同”或“基本没有差异”表示与标准对照值在数量上很少至没有差异，一般在标准对照的±10%之内，或±5%、±2%、甚至与标准对照有更小的变化。本文所使用的“多核苷酸杂交方法”是指基于在适当的杂交条件下多核苷酸与已知序列的多核苷酸探针形成Watson-Crick碱基配对的能力来检测所述多核苷酸的存在和/或数量的方法。这样的杂交方法实例包括Southern印记和Northern印记。本文所使用的“引物”是指可用来诸如聚合酶链式反应(PCR)的扩增方法中，基于对应于目的基因如白蛋白编码序列的多核苷酸序列扩增核苷酸序列的寡核苷酸。至少一种用于多核苷酸序列扩增的PCR引物对于该序列来说是序列特异性的。本文所使用的术语“数字聚合酶链式反应”是指常规聚合酶链式反应(PCR)方法的精确形式，其可用于直接定量并克隆扩增包括DNA、cDNA或RNA在内的核酸，使得靶核酸的量可以被直接定量测量。数字PCR通过在许多独立的能够定位和扩增产物并将其浓缩至可检出水平的反应室中捕获或分离样品中存在的每一单独的核酸分子来实现这种直接定量测量。PCR扩增之后，计数含有PCR终端产物的小室是直接测量绝对核酸量。捕获或分离单独的核酸分子，一般通过稀释的方式，可在毛细管、微乳液、小型化室的阵列中或在核酸结合表面来实现。数字PCR的基本方法描述于例如Sykes et al. ,Biotechniques 13(3)444-449,1992)中。在本文中使用的术语“分子计数”是指允许定量测量分子或分子复合物的数量，在上下文中通常是不同特征的其他共存分子或复合物的相对数量的任何方法。分子计数的各种方法描述于，例如 Leaner et al. Analytical Chemistry 69:2115-2121,1997;Hiranoand Fukami, Nucleic Acids Symposium Series No. 44 :157-158,2000 ;Chiu etal. , Trends in Genetics 25 :324-331, 2009 ;以及美国专利号 7，537，897 中。本文所使用的“标准对照”是指存在于已确定的样品如无细胞血样中的预先定量的多核苷酸序列如白蛋白mRNA。标准对照值适合用于本发明的方法中，以用作比较检测样品中存在的白蛋白mRNA的量的基础。用作标准对照的已确立的样品提供对于没有如常规定义的任何肝疾病的普通健康人的特定血样(特别是无细胞血样，如血清或血浆)来说典型的白蛋白mRNA的平均量。标准对照值可以随样品性质以及其他因素如个体(这种对照值是基于该个体而确立的)的性别、年龄、种族而变化。上下文中所使用的描述健康、没有如常规定义的任何肝疾病的人的术语“平均值”是指某些特征，尤其是人血液或血液的任何非细胞部分如血清或血浆中存在的白蛋白mRNA的量，其代表没有任何肝病变的随机选择的一组健康人群。所选择的组应当包括足够数量的人，使得这些个体的血液或血液部分中的白蛋白mRNA的平均量以合理的精确性反映出总的健康人群中相应的白蛋白mRNA含量。此外，所选择的一组人的年龄通常与其血样受检测潜在的肝病症指征的个体年龄相似。实施本发明的优选年龄可以因筛选的肝疾病/失调而变化。此外，同样要考虑其他因素，如性别、种族，还考虑病史，且病史优选在检测个体的特征与所选择确立“平均值”的个体组之间紧密匹配。本申请中所使用的术语“量”是指样品中存在的目的多核苷酸序列如白蛋白mRNA的量。这样的量可以表示为绝对数，即样品中多核苷酸序列的总量，或相对数，即样品中多 核苷酸序列的浓度。发明详述I 引言分析血浆中的循环核酸，为各种生理和病理症状的非侵入性监测提供了方法(Loet al. ,Ann N Y Acad Sci 2004 ；1022 :135-139 ;Chan等，Ann Clin Biochem 2003 ；40 122-30)。已报道了许多基于检测人血浆循环中的无细胞核酸的申请，应用的范围是用于管理恶性肿瘤(Anker et al. , Int J Cancer 2003 ；103 :149-52)、妊娠相关病症(Lo et al.，Nat Rev Genet 2007 ；8 :71_7)、器官移植(Lo et al. ,Lancet 1998 ；351 :1329-30)及外伤(Lo et al. ,Clin Chem 2000 ；46 :319-23 ；Chiu et al. ,Acta Neurochir Suppl 2005 ；95 471-4)。支持这些申请的基本原理涉及源自患病器官的细胞外核酸分子的血浆检测。通过循环DNA分析可开发疾病特异性遗传标记，其包括检测疾病相关病原体(Chan et al. ,ClinChem 2005 ；51 :2192-5)、疾病特异性突变、胎儿与其母亲之间或者移植供体与受体之间的性别和多态性差异。除了循环DNA，无细胞血浆RNA分析为开发病理学相关标志物提供了另一种机会(Lo et al. ,Ann N Y Acad Sci 2004 ；1022 135-139 ；Anker et al. ,Clin Chem 2002 ；48 1210-1)。可以靶定器官或疾病特有的表达谱，作为用于血浆检测的特异性核酸标记。已从具有用于疾病评估潜力的血衆中成功检测了源自肿瘤(Chen et al. , Clin Cancer Res
2000；6 :3823-6)和源自胎盘(Ng et al.，Proc Natl Acad Sci USA 2003 ；100 :4748-53)的RNA种类(Ng等，Clin Chem 2003 ；49 :727-31)。本发明人探讨了检测源自肝的循环mRNA用于评估肝病变的可能性。有许多证据表明，细胞死亡时释放循环DNA和RNA(Jahr et al. , Cancer Res
2001；61 :1659-65)。由于白蛋白是人体最丰富的蛋白且通过肝合成，本发明人推测人血浆的ALB mRNA是可检测的并且可能是肝病变的灵敏标志物。实际上，以前研究报道了检测人类个体的外周全血和外周单核细胞部分的ALB mRNA(Hillaire et al. ,Gastroenterology
1994；106 :239-42 ；Kar et al. ,Hepatology 1995 ；21 :403-7 ；Muller et al. ,Hepatology1997；25 :896-9 ；Barbu et al.，Hepatology 1997 ；26 :1171-5 ；Gion et al.，Hepatology
1998；28 :1663-8 ；Peck-Radosavljevic et al. , Liver Transplant Oncology Group. JHepatol 1998 ；28 :497-503 ；Wong et al.，Br J Cancer 1997 ；76 :628-33 ；Wong et al.，Cancer Lett 2000 ；156 :141-9 ；Basti das-Ramirez et al.，Hepatol Res 2002 ；24 265.11)。然而，这些研究报道了具有来自患有肝细胞癌(HCC)、肝硬化、肝炎的患者与健康对照的血液ALB mRNA的检测率低于100%的成功混合水平。最近Yet，Kudo et al.，(J VetMed Sci 2008;70:993-5)报道了血浆ALB mRNA浓度的存在及其与大鼠肝损伤的相关性。血细胞能够“不正常地”转录已知主要由其他细胞类型表达的基因(Lambrechtset al. ,Ann Oncol 1998 ;9 :1269-76)，而且本发明人以前已证实血细胞是血浆核酸的主要贡献者(Lui et al. ,Clin Chem 2002 ;48 :421-7)。因而发明人的首要目的是确定血浆或全血ALB mRNA是否源自肝，其次，在证实血浆ALB mRNA的肝来源之后，确定是否可以检测各 种肝病变的定量畸变。为了实现第一个目的，使用以前描述的RNA-单核苷酸多态性(SNP)策略(Lo et al.，Nat Med 2007 ；13 :218-23 ；Chan et al.，Clin Chem 2007 ；53 :1874-6)来对从供体移植肝或骨髓的受体循环系统中存在的ALB mRNA分子进行基因分型，所述供体对于所靶定的编码SNP的ALB在基因型上不同。II. 一般方法利用分子生物学领域的常规技术来实施本发明。公开了本发明中使用的一般方法的基础教科书包括Sambrook and Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual (分子克隆实验指南)，(2rd ed. 2001 (第 3 版，2001)) ； (Kriegler, Gene, Transfer andExpression A Laboratory Manual (基因转移和表达实验指南)(1990);以及 CurrentProtocols in Molecular Biology (现代分子生物学实验技术)，(Ausubel et al. , eds.,1994)。对于核酸，其大小以千碱基(kb)或碱基对(bp)给出。这些通过琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、已测序核酸或已公开DNA序列来估计。对于蛋白，其大小以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数量给出。通过凝胶电泳、已测序蛋白、衍生的氨基酸序列或已公开蛋白序列来估计蛋白大小。不能商购获得的寡核苷酸可以根据例如Beaucageand Caruthers, TetrahedronLett. 22 :1859-1862(1981))首次描述的固相亚磷酰胺三酯法，使用Van Devanter et al.，Nucleic Acids Res. 12 :6159-6168 (1984)所述的自动合成仪化学合成。寡核苷酸的纯化使用任何领域内认可的方法如Pearson and Reanier, J. Chrom. 255 137-149 (1983)所述的非变性丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换高效液相色谱法(HPLC)。 本发明中使用的遗传标志物序列或基因组序列，例如白蛋白基因的多核苷酸序列和合成的寡核苷酸(如引物)，可以使用例如Wallace et al.，Gene 16 :21-26(1981))的双链模板测序的链终止法来验证。III.血样的获得和mRNA的提取本发明涉及分析存在于人血液中，尤其是非细胞血样中的白蛋白mRNA的量，作为检测肝疾病或失调的存在和/或监测肝疾病或病症进程的非侵入性手段。因而，实施本发明的第一步是从受测试的个体获得血样，并从所述样品提取mRNA。A.血样的获得
血样获自待利用本发明的方法检测或监测肝病症或并病症的人。根据医院或门诊通常遵循的标准方案从个体采集血液。采集适当量的外周血，例如一般为5-50ml，在进一步制备之前可根据标准程序保存。B.血样的制各根据本发明分析患者的血样中存在的白蛋白mRNA可以利用例如全血或更经常是非细胞样品如血清或血浆进行。本领域技术人员熟知制备来自母系血液的血清或血浆的方法。例如，可将个体的血液放在含有EDTA的管或专业商品如Vacutainer SST(BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)中以防止血液凝结,并且接着通过离心可从全血中获得血浆。另一方面，离心后或未离心(血液凝结之后)可获得血清。如果接着使用离心，尽管并非专用，一般在适当速度，如1，500-3，000 X g下进行。在被转移到新的管子用于RNA提取之前，血浆或血清可以进行额外的离心步骤。从全血中产生非细胞样品的任何其他方法同 样适用本发明的目的，只要所述方法产生基本上不含细胞的无细胞血样，例如已去除全血样品中原始存在的全部细胞的至少90%、95%、98%或99%或更多。C. RNA的提取和定量有许多从生物样品中提取mRNA的方法。可以采用制备mRNA的一般方法(例如Sambrookand Russell, Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆实验指南)3d ed. ,2001);还可以使用各种商购试剂或试剂盒来从来自女性检测个体的生物样品中获得mRNA,所述商购试剂或试剂盒如Trizol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)、01igotexDirect mRNA 试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)、RNeasy 微型试剂盒(Qiagen, Hilden,Germany)以及 PolyATtract Series 9600 (Promega, Madison, WI) 还可以使用这些方法中的一种以上的组合。重要的是应当从RNA制备物中除去全部污染DNA。因而，必需小心处理样品，用DNase完全处理，以及在扩增和定量步骤中使用合适的阴性对照。I.基于PCR定量测定mRNA水平一旦从样品中提取了 mRNA，可以定量白蛋白mRNA的量。用于测定mRNA水平的优选方法是基于扩增的方法，如通过聚合酶链式反应(PCR)。在扩增步骤之前，必须合成白蛋白mRNA的DNA拷贝(cDNA)。这通过反转录来实现，其可以作为单独的步骤进行，或者以同源反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行，所述RT-PCR是一种改进的扩增RNA的聚合酶链式反应。适合于核糖核酸的PCR扩增的方法描述于 Romeroand Rotbart, Diagnostic Molecular Biology !Principles andApplications (诊断分子生物学原理和应用)，pp. 401-406 ；Persing et al.，eds.，MayoFoundation, Rochester, MN, 1993 ；Egge et al.，J. Clin. Microbiol. 33 1442-1447,1995 ；以及美国专利号5，075，212中。PCR的一般方法是本领域内所熟知的，因而在此不详述。对于PCR方法、方案及引物设计原理的综述，参见例如 Innis et al.，PCR Protocols A Guide to Methods andApplications (PCR 手册方法和应用指南)，Academic Press, Inc. N. Y.，1990)。PCR 试剂和方案还可获自商业供应商，如Roche Molecular Systems。PCR最常作为自动化过程与热稳定酶一起进行。在该过程中，反应混合物的温度通过变性区、引物退火区和延长反应区自动循环。为此而具体采用的装置可商购获得。
虽然靶mRNA的PCR扩增一般用于实施本发明，然而本领域技术人员将认识到，扩增母系血样中的这些mRNA种类可以通过任何已知的方法来完成，所述方法如连接酶链式反应(LCR)、转录介导的扩增以及自主序列复制或依赖核酸序列的扩增(NASBA)，它们各自提供充分扩增。最近开发的分支DNA技术也可以用于定量测定母系血液中mRNA标志物的量。对于用于临床样品的核酸序列的直接定量的分支DNA信号扩增技术的综述参见Nolte，Adv.Clin. Chem. 33 :201-235,1998。2.其他定量方法白蛋白mRNA还可以利用本领域技术人员熟知的其他标准技术来检测。虽然检测步骤之前一般是扩增步骤，但是在本发明的方法并不需要扩增的。例如，无论之前是否有扩增步骤，mRNA可以通过大小分级(例如凝胶电泳)来鉴定。根据已知技术，在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中跑样品并用溴化乙锭标记(参见例如Sambrook and Russell,同上)之后，与标准对照大小相同的条带的出现表示存在靶mRNA，其量可基于条带的密度与对照进行比较。可选择地，可使用对白蛋白mRNA具有特异性的寡核苷酸探针来检测这样的mRNA种类的存在，并且基于由探针赋予的信号强度与标准对照进行比较来表示mRNA的量。 序列特异的探针杂交是检测包含其他核酸种类的特定核酸的一种已知方法。在足够严格的杂交条件下，探针仅与基本上互补的序列特异地杂交。杂交条件严格的性可放宽到容许不同量的序列错配。本领域内熟知许多杂交形式，包括但不仅限于液相、固相或混合相杂交检测。以下文献提供了各种杂交检测形式的综述Singer et al. , Biotechniques 4:230,1986;Haase et al. , Methods in Virology, 189-226 页，1984 ;In situ Hybridization(原位杂交)，Wilkinsoned., IRL Press, Oxford University Press, Oxford ;以及 Hames andHigginseds. , Nucleic Acid Hybridization A Practical Approach (核酸杂交应用方法)，IRL Press，1987。根据熟知技术检测杂交复合物。能够与靶核酸即mRNA或所扩增的DNA特异性杂交的核酸探针可通过几种常用来检测所杂交核酸的存在的方法中的任何一种来标记。一种常用的检测方法是使用利用3H、125I、35S、14C或32P等标记的探针的放射自显影法。放射性同位素的选择取决于所选择同位素的易于合成、稳定性及半衰期所致的研究偏好。其他标志物包括化合物(例如生物素和地高辛)，其与用荧光团、化学发光剂和酶标记的抗配体(antiligand)或抗体结合。可选择地,探针可直接与诸如突光团、化学发光剂或酶的标志物轭合。标志物的选择取决于所要求的灵敏度、易于与探针轭合、稳定性要求以及可利用的仪器。用于实施本发明必需的探针和引物可利用熟知的技术合成和标记。用作探针和引物的寡核苷酸可以根据 Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts. , 22 :1859-1862，1981首次描述的固相亚憐酸胺三酯法，利用Needham-VanDevanter et al.，NucleicAcids Res. 12 :6159-6168,1984所述的自动合成仪化学合成。寡核昔酸通过Pearson andRegnier, J. Chrom. , 255 :137-149,1983所述的非变性丙烯酰胺凝胶电泳或通过离子交换HPLC纯化。IV.确定标准对照为了确定用于实施本发明方法的标准对照，首先选择一组没有如常规定义的任何肝疾病的健康人。为了利用本发明的方法筛选和/或监测诸如肝硬化、肝纤维化、肝炎等肝病症或肝疾病的目的，若适用的话，这些个体在适当的参数范围内。任选地，这些个体性别的相同、年龄相似或种族背景相似。所选择个体的健康状况通过已确定的常规使用的方法来证实，所述常规使用的方法包括但不限于个体的常规体检及其病史的总体评价。此外，所选择的一组健康个体必需有适当的体重，使得获自该组的血液中的白蛋白mRNA平均量/浓度可合理地被认为代表一般的健康人群的正常或平均水平。优选地，所选择群体包括至少10名人类个体。一旦基于所选择健康对照组中每一名个体中存在的个体值确定了白蛋白mRNA的平均值，则该平均值或中位数或代表值或分布就被认为是标准对照。在同一过程中还测定标准偏差。在一些情况下，对具有诸如年龄、性别或种族背景的不同特征而分开限定的组可以确定单独的标准对照。V.试剂盒本发明提供了用于实施本文所述方法以评估个体的肝生理或病理状况的组合物和试剂盒，其可以用于各种目的，如检测或诊断患者的肝疾病的存在和监测患者的肝疾病进程，所述患者尤其是没有任何肝损伤、病症或疾病指征的人。用于实施测定白蛋白mRNA水平的检测的试剂盒一般包括用于与白蛋白编码序列或互补序列特异性杂交的至少一种寡核苷酸。任选地，该寡核苷酸用可检测部分标记。在一些情况下，试剂盒可包括在通过PCR、特别是RT-PCR扩增白蛋白mRNA中使用的至少两种寡核苷酸引物。通常，试剂盒还提供说明手册，以指导使用者分析检测样品和评估检测个体的肝生理或病理状况。
实施例以下实施例仅以阐述而非限定的方式提供。本领域技术人员易于认识到可以改变或修正各种非关键的参数而产生基本上相同或相似的结果。实施例II.材料与方法参与者2006年6月至2008年4月期间，从香港威尔斯亲王医院(the Prince of WalesHospital)招募参与者，包括(i)在内科及药物治疗和临床肿瘤学部就诊的患有一系列肝并发症的患者；(ii)之前在外科部接受过肝移植(LT)的患者，以及配对的肝供体；(iii)在儿科部接受过骨髓移植(BMT)的患者；以及(iv)健康个体。获得机构审查委员会的伦理批准，并且获得全部参与者或责任监护人的知情同意。将IOmL外周血采集到EDTA-管中。还从BMT患者采集口腔颊粘膜细胞或毛囊细胞。对于接受过尸体LT的参与者,提取已死亡供体的存档肝活检组织标本。样品采集和处理采集血液之后立刻将样品保存于4°C并在4小时之内处理。轻轻地混合血样之后，将 0. 3mL 全血与 0. 9mL TRIzol LS 试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)相混合。通过二次离、心方案(Chiu et al.，Clin Chem 2001 ；47 :1607-13)获得血浆。第一次离心步骤之后分离血沉棕黄层(buffy coat)，然后于4°C下，230g再次离心5分钟以去除任何残留的血浆。在如本发明本部分所述提取核酸之前，保存全部样品。ALB基因分型靶定ALB编码区之内的SNP即rs962004。通过对10名无关个体的DNA进行测序，发现SNP具有0. 37的小等位基因频率。利用同源MassEXTEND (hME) (Sequenom, San Diego,CA)检测，通过引物延伸反应进行基因分型。每一 SNP等位基因的延伸产物显示不同的质量，这可通过基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱分析来分辨(参见图5)。SNP分析的详情可以在表3中找到。利用血沉棕黄层DNA测定LT受体和肝供体的基因型。对于尸体LT病例，由存档的肝活检组织DNA测定已死亡供体的ALB基因型。对于BMT受体，由口腔颊粘膜细胞或毛囊细胞的DNA检测他们的原始ALB基因型。利用BMT之后受体的血沉棕黄层DNA来评估骨髓供体的ALB基因型。移植受体的血浆或全血ALB mRNA的基因型利用对反转录ALB mRNA 的同一基因分型检测来测定。血浆ALB mRNA转录本的定量使用一步反转录定量实时PCR(RT-qPCR)来测量血浆ALB mRNA浓度。设计用于ALB mRNA定量的跨内含子(intron-spanning)检测来扩增跨5’区的外显子I和外显子2的78-bp ALB扩增子(GenBank登录号NM_000477. 3)且将序列总结于表4中。通过对指定 革巴向ALB扩增子的HPLC-纯化的单链合成DNA寡核苷酸(Sigma-Proligo, Singapore)进行连续稀释来制作用于绝对ALB mRNA定量的校正曲线(Wong et al.，Clin Chem 2005 ；51 1786-95)，浓度范围为每个反应孔3个拷贝至3xl06个拷贝。通过ABI Prism 7900序列检测仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)和序列检测软件2. 2版(Applied Biosystems)监测ALB mRNA的扩增。由校正曲线计算的PCR效率中位数为88. 3 % (SD:6%，范围81. 1% -98. 8 % )，所述校正曲线具有中位数斜率为-3. 64 (SD :0. 18，范围3. 35-3. 88)，y-截距为 40. 8 (SD :1. 86，范围:38. 1-43. 5)，以及相关系数为 0. 9958 (SD :0. 0026，范围0. 9905-0. 9986)。血浆ALB mRNA的绝对浓度表示为拷贝/mL。评估肝功能由香港威尔斯亲王医院的化学病理学实验室利用DPE Modular分析系统(RocheDiagnostics)进行血浆分析白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和甲胎球蛋白。如之前所述(Chan 等 J Med Virol 2002 ；68 182-7 ；Loeb et al. , Hepatology2000 ；32 :626-629)，定量患有慢性乙型肝炎(CHB)传染病的患者血清中的乙型肝炎病毒(HBV)DNA0浓度> 10，000拷贝/mL被认为是活性病毒复制的证据(Chan et al.，B. J ClinMicrobiol 2003 ；41 :4693-5)。统计学分析利用SPSS软件15. 0版(SPSS Inc.，Chicago, IL)进行统计学分析。通过适当的克-瓦二氏(Kruskal-Wallis)H检验和邓肯(Dunn' s)检验对患者与对照组之间的血衆ALB mRNA浓度进行比较。通过斯皮尔曼(Spearman' s)等级相关法来确定血衆ALB mRNA浓度与其他参数之间的相关性。P值小于0. 05被认为是统计学显著，并且全部概率都是双尾。当样品的血浆ALB mRNA浓度大于相应组平均值的3个标准偏差时，鉴定为异常值。构建ROC曲线以确定曲线下面积(AUC)。计算最佳血浆ALB mRNA浓度截止点处的灵敏度和特异性，用于区别患有肝并发症的患者和健康个体。样品采集和制备为获得血浆，首先将每一份血样在4°C下于1600g离心10分钟(离心机5810R，Eppendorf, German)。将上清液小心地转移到普通聚丙烯管中，并在4°C下于16000g再次离心 10 分钟(离心机 5417R, Eppendorf) (Chiu et al.，Clin Chem 2001 ；47 :1607-13)。接着将血浆转移到新的聚丙烯管中且避免搅动到下面的沉淀。然后将每I. 6mL血浆与4. SmLTRIzol LS试剂(Invitrogen)混合并在提取前于-80°C保存(Heung et al. , Prenat Diagn2009 ；29 277-9)。RNA 提取将每一份血浆-TRIzol LS混合物解冻并与I. 28mL氯仿混合。通过在4°C下于 12000g离心15分钟，将RNA裂解物分离到不同的相中。然后将含水层小心地转移到新的聚丙烯管中。对于RNA沉淀，将700mL/L的一体积乙醇添加到一体积含水层中。将混合物应用于RNeasy微型试剂盒的纯化柱上(Qiagen, Valencia, CA),并按厂商手册进行处理。用50 u L不含RNase的水洗脱总RNA。根据厂商说明,用扩增级脱氧核糖核酸酶I (Invitrogen)预先处理全部RNA样品，然后于_80°C保存，直到使用。DNA 提取用合适的QIAamp血液微型试剂盒(Qiagen)或QIAamp DNA微型试剂盒(Qiagen)并按厂商建议提取血沉棕黄层、口腔颊粘膜细胞、毛囊细胞和石蜡保存的肝活检组织的DNA。用50 ii L双蒸水洗脱DNA样品，并于_20°C保存，直到使用。通过MassARRAY 同源MassEXTEND (hME)分析进行RNA-SNP分析，之后进行质谱检测反转录一将RNA样品通过耐热禽类反转录酶(ThermoScript 反转录酶，Invitrogen)和基因特异性引物(Integrated DNA Technologies ;参见表 3)在 0. 5 U M 的终浓度中于55°C下反转录I小时。PCR扩增一对于反转录cDNA的扩增，每个反应含有0. 6x HotStar Taq PCR缓冲液，所述缓冲液具有 0. 9mM MgCl2 (Qiagen)，dATP、dGTP 和 dCTP # 25 u M, 50 u MdUTP (Applied Biosystems)。对于 DNA 的扩增，每个反应含有 Ix HotStar Taq PCR 缓冲液，所述缓冲液具有 I. 5mM MgCl2 (Qiagen)，额外的 ImM MgCl2 (Qiagen), dATP、dGTP 和dCTP 各 50 ii M，100 ii M dUTP (Applied Biosystems)。对于全部 PCR，正向引物和反向引物(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA ;参见表 4)为 200nM,以及 HotStar Taq聚合酶的终浓度为0. 5U(Qiagen)。PCR于95°C下开始15分钟；之后45个循环于95°C下变性20秒，于56°C下退火30秒，于72°C下延伸I分钟；最后于72°C下孵育3分钟。喊基延伸一用0. 6U虫下喊性憐酸酶(Sequenom) >0. 34MassARRAY 同源MassEXTEND (hME)缓冲液(Sequenom)和3. 06 y L水对PCR产物进行虾碱性磷酸酶(SAP)处理。将混合物于37°C下孵育40分钟，之后于85°C下孵育5分钟以去除多余的dNTP。用hME分析(Sequenom)进行基因分型。对于RNA SNP基因分型，将9 ii L含有I. 2 ii M延伸引物(Integrated DNA Technologies ;参见表3)的碱基延伸反应混合物、I. 15UThermosequenase (Sequenom)及 ddATP、ddCTP 和 dGTP (Sequenom)各 64 U M添力卩到 5 U L SAP处理的PCR产物中。对于DNA SNP基因分型，将4 ii L含有0.771 ii M延伸引物(IntegratedDNA Technologies ;参见表 I)的喊基延伸反应混合物、I. 15U Thermosequenase (Sequenom)及ddATP、ddCTP和dGTP (Sequenom)各64 y M添加到10 y L SAP处理的PCR产物中。反应条件如下对于RNA-SNP基因分型，94°C下2分钟；之后85个循环94°C，5秒，52°C，5秒，72°C，5秒。对于DNA-SNP基因分型，引物延伸反应使用相同温度描述进行75个循环。液体分配和MALDI-TOF MS数据分析一通过添加12mg纯化树脂(Sequenom)和24iiL水来纯化最终的碱基延伸产物。将混合物于旋转器中混合20分钟。于361g下离心5分钟之后，将IOnL反应溶液通过MassARRAY纳米分配器S (Sequenom)分配到SpectroCHIP(Sequenom)中。使用MassARRAY Analyzer Compact质谱仪(Bruker,Madison,WI)从SpectroCHIP获取数据。质谱数据被自动输入到MassARRAY Typer(Sequenom)数据库用于分析。 通过实时定量PCR检测血浆ALB mRNA转录本使用Primer Express 2. 0 版(Applied Biosystems)设计 ALB mRNA定量分析。正向引物和反向引物分别位于外显子I和外显子2中，并由Integrated DNA Technologies合成。突光探针(Applied Biosystems, Foster City, CA)跨越外显子I和2之间的连接，以防止污染性基因组DNA的扩增(参见表4)。进行电脑模拟特异性筛选和序列比对，以确保扩增子对所靶定ALB位点是特异性的且没有剪接变体。反转录一根据厂商说明(TaqManEZ RT-PCR核心试剂；Cat. No. N8080236 ；AppliedBiosystems)，在25 y L反应体积中手动设置定量实时PCR反应。各反应每一成分的终浓度如下1 X EZ缓冲液，乙酸锰溶液3mM, dNTPs 300 u M，AmpErase尿嘧啶-N-糖基化酶0. 25单位，正向引物400 ii M，反向引物400 ii M，探针200 u M，rTth DNA聚合酶2. 5单位，并且没有使用添加剂。对于扩增，将3 ii L提取的血浆RNA添加到96-孔反应板的各个孔内(MicroAmp光学96-孔反应板；目录号N8010560 ；Applied Biosystems)。对于ALB mRNA分析使用的温度分布如下反应于50°C下开始2分钟，用于所包括的尿嘧啶-N-糖基化酶活化；之后于60°C下反转录30分钟。于95°C下变性5分钟之后，进行45个循环的PCR :于94°C下变性20秒，并于58°C下变性/延伸I分钟。每一样品分析两份，并且与各分析平行进行相应的校正曲线。每次分析中包括多个水空白和肝组织RNA分别作为阴性和阳性对照。通过用AmpliTaq Gold酶(Applied Biosystems)取代rTth聚合酶,还进行样品检测以确保它们对于DNA是阴性的。在全部阴性水空白和“无-RT”对照分析中未观察到扩增，表明对于mRNA分析是特异性的。PCR产物的特异性还通过凝胶电泳分析来验证。发现对于ALB分析的检测限度是每个反应孔3拷贝，因为98%的40个一式两份的孔[=总共80个孔，每个反应孔含有3拷贝]被成功检测，循环阈值中位数(范围)为38. 6(37. 8-44. 3)。通过测量具有ALB mRNA浓度调整到835拷贝/mL的样品来评估ALB mRNA分析的分析内CV，其定义为在同一反应板上的20个一式两份的孔中，通过ROC分析，由健康对照鉴定患有肝疾病患者的血浆ALB mRNA浓度的截止值。从重复中检测到平均ALB mRNA浓度为855拷贝/mL，SD为85 拷贝 /mL, CV 为 9. 97%。II.结果循环系统中ALB mRNA的来源
为确定血浆和全血中的ALB mRNA是否是肝来源的，开发RNA-SNP分析以对LT和BMT受体的循环系统中存在的ALB mRNA分子进行基因分型。将分析集中于有信息的供体-受体对，其中供体被定义为相比他们相应的受体对于查询的ALB SNP携带不同的基因型。肝移植之后，如果ALB mRNA真的是肝来源的，则对于在受体的循环系统中发现的ALBmRNA分子，应当观测到对应于供体基因型的基因型。可选择地，如果其他组织来源对循环ALB mRNA库有贡献，则受体的ALB基因型应当是可检测的。为表明造血细胞可能是循环ALBmRNA的污染源，对BMT受体进行相似的RNA-SNP分析。同样，如果造血细胞对循环系统贡献ALB mRNA，则循环ALB mRNA分子将显现骨髓供体的基因型。研究了二十九(29)例LT病例，其中九(9)名受体从他们活着的亲属获得肝，其余受体从尸体获得肝。通过显示供体和受体之间不同的ALB基因型，这些供体-受体对中的15对(15)被认为是有信息的。表I总结了有信息的供体和受体的基因分型数据。在有信息的病例中，移植后受体血浆中所检测的ALB mRNA基因型与他们的原始基因型不同，并与肝供体基因型一致。所招募的20例BMT病例中的5例是有信息的，并且表I总结了基因分型数据。受 体血浆ALB mRNA基因型在BMT之前和之后没有变化。因此，供体的骨髓并不是受体血浆ALB mRNA的主要贡献者。除血浆外，还对采自移植后有信息的LT和BMT受体的全血ALB mRNA进行RNA-SNP分析。十二(12)例有信息的LT病例和四(4)例有信息的BMT病例同意该分析，并且基因型数据在表I中给出。与血浆数据不同，在全血ALB mRNA中观测到来自骨髓供体(病例B8和B 10)和LT受体(病例L8、LI 8、L23、L24和L25)的贡献。总之，血浆ALB mRNA是肝来源的，而全血ALB mRNA不是肝特异的。血浆ALB mRNA的定量分析证实血浆ALB mRNA是肝特异的之后，发明人评估其在获自患有肝并发症谱系的107名患者和207名健康个体的血浆中的浓度。在患者中，已证实35名患有HCC，25名患有肝组织活检检验的肝硬化，24名患有CHB。其具有血清HBV DNA浓度> 10，000拷贝/mL，即活性病毒复制，以及23名患有CHB，其血清HBV DNA浓度< 10，000拷贝/mL，即非活性病毒复制。全部健康个体经检测为HBsAg阴性，并且根据标准血浆生化检测具有在参考区间之内的肝功能检测参数。表2总结了关于参与者的人口统计资料、生化检测、病毒学调研和血浆ALB mRNA浓度中位数的信息。除I名患者和5名对照具有阴性读数，314名参与者中的308名检测到血浆ALB mRNA (98. 1% ) 图I中给出全部组的血浆ALB mRNA浓度。参与者组之间的血浆ALB mRNA浓度有统计学显著差异(P < 0. 0001，克-瓦二氏检验)。与对照相比时，亚组分析显示患有HCC (P < 0. 0001)、肝硬化(P = 0. 0068)和活动性CHB (P < 0. 0001)的患者的血浆ALB mRNA浓度具有统计学显著的升高。对照与患有非活动性CHB的患者之间的血浆mRNA浓度没有统计学显著差异$ = 0.4239，邓肯检验)。这些数据进一步支持患有非活动性CHB的人通常具有与健康对照相似的肝状况。进行ROC曲线分析以评估血浆ALB mRNA浓度是否是肝病变的有效指示物(图2)。AUC表明，利用血浆ALB mRNA作为肝病变指示物的诊断效率为92. 9%。通过利用835拷贝/mL的血浆ALB mRNA作为截止值，检测任何一种所评估肝病变的灵敏度和特异性分别为85. 5%和 92. 8%。血浆ALB mRNA浓度与常规肝功能检测参数之间的关系考虑到来自全部研究参与者(患者和对照)的数据，血浆ALB mRNA浓度与血浆总胆红素(r = 0. 133，P = O. 018，斯皮尔曼相关法)、碱性磷酸酶(r = 0. 126，P = O. 0255)和 ALT(r = 0. 207，P = 0. 0002 ;图 3)相关性较弱。在107名患者中，仅23名患者(21.5%)具有升高的ALT水平(> 58IU/L)，而62名患者(73.8% )的血浆ALB mRNA浓度> 835拷贝/mL。对于通过肝活检确认的患有HCC的35名患者中，仅17名患者(49% )具有升高的甲胎蛋白水平(> 20ii g/L) (Sherman etal.，Hepatology 1995 ；22 :432-8)。然而，这些患者中的32名(91. 4% )具有升高的血浆ALB mRNA浓度，如图4所示。具有正常肝功能的个体的血浆ALB mRNA分析
明显注意到的是，患有肝疾病的患者的血浆ALB mRNA升高，而不是正常的血浆ALT或AFP水平。ALT是指示肝细胞损伤的常用生化标志物。这些数据表明，对于肝疾病检测，ALB mRNA比血浆ALT更灵敏。根据这些发现，再次分析数据从而仅包括具有正常血浆ALT的个体。由参与本研究检测实验室所提供的正常血浆ALT的参考范围是< 58U/L。总共291名研究参与者具有正常的血浆ALT。这代表全部参与者的93%。表5总结了关于该亚组参与者的人口统计资料、生化检测、病毒学调研和血浆ALB mRNA浓度中位数的信息。图6中给出具有正常血浆ALT的全部组的血浆ALB mRNA浓度。血浆ALB mRNA浓度在亚组之间在统计学上显著不同(P < 0.0001，克-瓦二氏检验)。进一步分析显示，与对照相比时，患有HCC的患者(P < 0. 0001)，患有肝硬化的患者(P = 0. 0094)，以及患有活动性CHB (P < 0.0001)的患者具有统计学显著升高的血浆ALB mRNA浓度。对照与患有非活动性CHB的患者之间的血浆mRNA浓度没有统计学显著差异(P = 0. 2723，Dunn检验)。对该亚组进行ROC曲线分析(图7)。AUC表明，利用血浆ALB mRNA作为肝病变的指示物的诊断效率为87%。通过利用835个拷贝/mL的血浆ALB mRNA作为截止值，检测任何一种所评估的肝病变的灵敏度和特异性分别是74%和93%。该亚组分析进一步证实，血浆ALB mRNA分析是用于检测肝病变，甚至是在具有正常的肝功能检测(如正常血浆ALT水平)的个体中检测肝病变的灵敏的标志物。升高的血浆ALB mRNA作为将来不良后果的预示物进一步研究参与以上所述基因分型研究的29名LT受体。除了基因分型，还通过如以上所述实时定量PCR测量血浆ALB mRNA浓度。同时还评估了血浆ALT水平。与Cheunget al. , Transplantation 2008 ；85 :81_7)所述的个体不同，在研究招募时并不知道所有患者已发生肝移植后(post-LT) HCC。监测需要就医或住院长达125周的参与者的任何不良后果。5名参与者未返回香港威尔斯亲王医院接受后续治疗，因此将他们从该研究的这一部分中排除的。在剩余的24名参与者中，9名在随后的日子中出现除HCC外的不良后果，如表6所示。这9名个体中的7名在发生内科并发症之前显示升高的血浆ALB mRNA( > 835拷贝/mL)浓度。这些个体中仅3名在采血时血浆ALT水平升高。这些数据表明，升高的血浆ALB mRNA浓度是肝LT后受体的肝相关并发症的早期预示物，其比血浆ALT具有更好的性能。这些数据表明，还可以通过升高的ALB mRNA水平预测除HCC外的肝相关并发症。在15名未发生肝相关并发症的参与者中，仅有I人(表6中的病例14)的血浆ALB mRNA水平> 835个拷贝/mL。在发生或未发生肝相关并发症的那些参与者中，具有升高的血浆ALBmRNA的个体比例是统计学差异显著的(P < 0. OOLFisher精确检验)。这些数据表明升高的ALB mRNA水平是肝疾病相对特异的早期迹象和预示物。血浆ALB mRNA的范围可以表示肝并发症严重性，例如具有预后价值。从以前肝疾病中完全恢复的个体的血浆ALB mRNA浓度肝并发症之后ALB mRNA恢复到正常水平表示恢复了正常肝功能。由于导致严重危害他们肝功能的病症，全部LT受体需要LT。因而，他们通过LT治疗，其中原始患病的肝由健康肝替代。对于肝LT后期间并未接着发生任何肝相关并发症的那些人(表6)，令人感兴趣的是注意到血浆ALB mRNA浓度与健康对照相当，如图I和图6所示，且没有统计学显著差异(P = 0.686，曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验)(图8)。这些数据表明，尽管以前存在肝损伤，但在接受具有正常肝功能的肝之后，血浆ALB mRNA浓度恢复到正常水平，所述正常肝功能通过标准血浆ALT和没有相关迹象和症状来表明。同样，期望的是对于从肝损伤恢复但未接受LT作为治疗的个体，血浆ALB mRNA浓度应当正常，所述从肝损伤恢复通过标准肝功能检测和没有相关迹象和症状来表明。因而，如果血浆ALB mRNA浓度在恢复后的 稍后阶段增加，则其表示复发或其他肝疾病发生。III.讨论通过分析循环核酸开发用于疾病诊断和管理的基于血液的工具的可能性，令人非常兴奋(Chan et al. , Ann Clin Biochem 2003 ；40 :122-30 ；Anker et al. , Int J Cancer2003 ； 103 149-52 ；Lo et al. , Nat Rev Genet 2007 ；8 :71-7 ；Lo et al. , Lancet 1998 ；351 :1329-30 ；Lo et al. ,Clin Chem 2000 ；46 :319-23)。检测循环 RNA提供优于 DNA 的某些优势(Lambrechts et al.，Ann Oncol 1998 ；9 :1269-76)。由于细胞类型与疾病之间的表达谱不同，可以使用组织或疾病特异的转录本作为疾病评估的标志物。如果选择了具体器官特有的RNA转录本，则RNA途径可能更普遍适用于该器官的疾病，并且不限于容纳特异DNA标签的部分情况。此外，如果血浆RNA和DNA都源自同一细胞群，则所释放的RNA在数量上可能比DNA更多。这是因为RNA转录本的多拷贝可依赖于其表达水平而存在于各细胞中，而各细胞仅含有相当于一个二倍体基因组的DNA。实际上，一些癌症研究人员报道，相比DNA标志物，更大比例的癌症病例对于所研究的血浆RNA是阳性的(Anker et al.，IntJ Cancer 2003 ；103 :149-52)。越来越多的证据表明，从器官或腔室将无细胞核酸释放到血浆中可能是由于细胞死亡所致(Jahr et al. , Cancer Res 2001 ；61 1659-65 ；Fournie et al. , Cancer Lett
1995；91 :221-7 ；Fournie 等，Gerontology 1993 ；39 :215-21)。肝为人体最大的器官之一，我们猜测，由于与正常细胞更新和/或病理损伤相关的细胞死亡，肝表达的RNA如ALB在外周循环系统中应当是可检测的。实际上，已有研究报道存在循环ALB mRNA，但是成功的程度不同(Cheung et al. , Transplantation 2008;85:81-7)。一些研究人员认为血液ALB mRNA来源于已进入外周循环系统的恶性或非恶性肝细胞(Hillaire et al.,Gastroenterology 1994 ； 106 :239-42 ；Kar et al. , Hepatology 1995 ；21 :403_7)。然而，Muller et al. Hepatology 1997 ;25 :896-9 报道,可诱导外周单核细胞表达 ALB mRNA。实际上，先前的报道表明，由于不正常的基因转录(Lambrechts et al. , Ann Oncol 1998 ；9 1269-76 ；Chelly et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1989 ;86 :2617-21)，某些推测在循环系统中可检测的器官特异性转录本实际上可能源自其他细胞群，如造血细胞(Chan etal. , Clin Chem 2007；53 :1874-6 ；Heung et al. , PLoS One 2009 ；4 e5858)。因而，在本研究中，发明人的首要目的是，证实人血浆和全血中可检测的ALB mRNA是否源自于肝且对肝是特异性的。研究对于编码SNP的ALB基因分型不同的LT或BMT的供体和受体，并确定血浆和全血的RNA-SNP基因型。所述数据证实，在血浆而非全血中检测到的ALB mRNA是肝特异性的。所述数据还表明，由造血细胞表达的ALB mRNA可对全血中所检测的ALB mRNA库有贡献。这些发现呼吁注意先前关于全血ALB mRNA检测报道数据的解释。血浆优于全血优选用于在未来研究作为肝疾病标志物的ALB mRNA。为使残留血细胞污染血浆中ALB mRNA分子的机会最小，应当通过先前所报道的二次离心步骤制备血浆。发明人接着开发了用于定量血浆ALB mRNA的一步RT-qPCR检测。在我们的研究中血浆ALB mRNA的检测率为98. I %。使用两步RT-qPCR，调查血浆ALB mRNA检测在预测肝移植受体中HCC复发中的作用的最新研究报道了 82%的检出率(Cheung et al.， Transplantation 2008 ；85 :81-7)。在他们报道的讨论部分,Cheung等声称,他们认为血衆ALB mRNA的阳性检测表明存在循环HCC细胞，而中血浆ALB mRNA阴性的LT受体则表明循环系统中没有HCC细胞。然而，本研究的数据表明，在几乎所有个体的血浆中可检测出血浆ALB mRNA,所述个体包括健康对照。这些数据表明，循环HCC细胞根本不是血浆ALB mRNA的唯一来源。因而，由于任何肝细胞死亡，血浆ALB mRNA更有可能被释放到血浆中，并且对于检测不限于LT后HCC的一系列肝疾病是有用的。相信本发明人对血浆ALB mRNA检测率的提高可能与一步RT-qPCR方案的分析灵敏度和它们靶定ALB基因的更靠5’端相关。发明人先前报道血浆中的循环mRNA可能不是完整的全长转录本且显示5’优势(Wong et al.，Clin Chem 2005 ；51 :1786-95)。已发现，相比对照，血浆ALB mRNA浓度在患有HCC、肝硬化和活动性CHB而不是患有非活动性CHB的患者中显著更高。这些数据表明，由于细胞死亡，ALB mRNA被释放到血浆中，并且可能与细胞死亡程度相关。通过ROC曲线分析，已发现，血浆ALB mRNA测量对于检测肝病变的存在是引人注目的手段(92.9% )。特别是，对于HCC组，在48.6%的病例中，仅甲胎蛋白升高，而大多数(91. 4% )病理显示ALB mRNA浓度升高。虽然其诊断灵敏，血浆ALB mRNA并非对任何特定病因的肝病变都是特异性的。然而，血浆ALB mRNA浓度与血清ALT活性-浓度有一些相关性。还发现血浆ALB mRNA在患有肝疾病但有正常ALT水平的患者中升高(图3)。这些观测结果表明，血浆ALB mRNA是检测早期慢性肝疾病的灵敏标志物，所述肝疾病中ALT活性-浓度通常在参考限度内。总之，本发明人的实验数据显示血浆而非全血的ALB mRNA源自肝且对肝是特异性的。观察到一系列肝病变的血浆ALB mRNA浓度升高，且需要进一步研究来调查其在评估或管理这类疾病中的临床效用。实施例2 :通过血浆白蛋白mRNA监测肝移植后并发症的灵敏度检测在本研究中，本发明人证明，血浆ALB mRNA浓度的显著升高与慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(HCC)相关。我们的数据显示，对于检测肝病变，血浆ALB mRNA比血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性更灵敏。长期监测肝功能和早期检测肝损伤是持续护理包括肝移植后受体在内的患有各种肝病变的患者的重要方面。因此，本研究的目的是利用肝移植受体为例，研究血浆ALB mRNA测量是否为已知以前患有肝病变的患者的护理提供任何价值。I.材料和方法参与者2006年6月至2009年7月期间，招募了先前在香港威尔斯亲王医院外科部经过肝移植的24名患者。肝移植后受体通常每隔三至六个月，或者若临床有指征则更频繁地到肝移植门诊部就诊。每次就诊时，进行体格、生化和血清学检查。本研究中血浆ALB mRNA的连续分析涉及3年期间由前臂静脉最多7次采集的6mL外周血。获得机构审查委员会的伦理批准，并且得到各受体的知情同意。样品采集和处理样品采集和处理的方法如Chan et al. ,Clin. Chem. 2010 ；56 :82_9所述。简而言之，将血液样品采集到含EDTA的管中，立即于4°C保存且在4小时内处理。通过二次离心方案获得血浆(Chiu et al.，Clin. Chem. 2001 ；47 =1607-13)。通过包括使用 RNeasy 微型试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)和 TRIzol LS 试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA) (Heung etal.，Prenat. Diagn. 2009 ；29 :277-9)的方案提取血浆 RNA。总 RNA 在不含 RNase 的 50 y L水中洗脱并根据厂商说明用扩增级脱氧核糖核酸酶I (Invitoogen)处理，然后于_80°C保 存，直到使用。血浆中ALB mRNA转录本的定量使用一步反转录定量实时聚合酶链式反应(RT-qPCR)来测量血浆ALB mRNA浓度。简而言之，设计用于定量ALB mRNA的跨越内含子的检测，来扩增跨越5’区的外显子I和外显子的 278-bp ALB 扩增子。使用 EZ rTth RNA PCR 试剂盒(Applied Biosystems,FosterCity, CA)以25 ii L的反应体积设置反应。用于绝对ALB mRNA定量的校正曲线通过对指定靶向ALB扩增子的高效液相色谱纯化的单链合成DNA寡核苷酸(Sigma-Proligo, Singapore)进行连续稀释来制备。本检测所检测的下限是每个反应I个拷贝，且线性范围高达每个反应IO6个拷贝。各样品一式两份进行分析，并且与各分析平行进行相应的校正曲线。通过ABI Prism 7900序列检测仪(Applied Biosystems)和序列检测软件2. 2版(AppliedBiosystems)来监测ALB mRNA的扩增。将血浆ALB mRNA的绝对浓度表示为拷贝/mL。评估肝功能由PWH的化学病理学实验室利用DPE Modular分析系统(Roche诊断，Basel,Switzerland)进行血浆白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和甲胎蛋白分析。统计学分析使用SigmaStat 软件(Windows 3. 5 版,Systat Software Inc. , Chicago, IL)进行统计学分析。将连续变量表示为中位数和范围。如果合适，通过克-瓦二氏H检验和曼-惠特尼U检验比较组间的血楽；ALB mRNA浓度和其他参数。通过斯皮尔曼等级相关法来确定血浆ALB mRNA浓度和其他参数之间的相关性。P值小于0.05被认为是统计学显著的，并且全部概率都是双尾。II.结果对在研究期间总共具有至少3次采血用于血浆ALB mRNA测量的24名肝受体(20名男性和4名女性)进行了研究。肝移植于1991至2004年期间在PWH进行。9名是活供体肝移植，15名是死亡供肝移植。用于肝移植的指征包括HCC(12个病例)、肝硬化(7个病例)、肝衰竭(3个病例)、重型乙型肝炎(I个病例)和酒精性肝硬化(I个病例)。在本研究中，将24名受体根据他们在研究期间是否发生肝相关临床后遗症而分成两组。将14名受体(12名男性和2名女性)归为“稳定”组，他们具有通过他们的稳定临床症状和生化肝功能检测特征反映的不显著进程。另一方面，将10名受体(8名男性和2名女性)归为“ 不稳定”组，他们在研究期间具有需要住院或手术管理的单一或多种肝相关并发症发作的迹象。在研究期间，24名受体都没有HCC复发。研究登记时的初步分析登记时，24名受体的年龄中位数是56. 2岁(范围17_69)，并且在稳定组和不稳定组之间的年龄中位数中没有统计学显著差异(曼-惠特尼U检验，P = O. 254)。基于肝脏学家的评估和令人满意的生化肝功能检测特征，稳定组的全部14名受体在登记时被认为是临床稳定的。对于稳定组，血浆白蛋白、胆红素、ALP和ALT水平中位数分别为 44g/L (40-49)、15 u mol/L(7_38)、82U/L (59-290)和 32U/L (10-69)。不稳定组的10名受体中的9名在研究登记时是临床稳定的。一个例外是编号U07的受体，其在登记时被诊断为酒精性肝硬化复发和轻度慢性排斥。不稳定组的血浆白蛋白、胆红素、ALP 和 ALT 浓度中位数分另为 44g/L (38-45)、19 u moI/L (10-31)、169U/L (73-379)和53U/L(24-155)。两组之间的血浆白蛋白(P = 0. 341)和胆红素(P = 0. 538)浓度没有统计学显著差异。然而，不稳定组的血浆ALP(P = 0. 015)和ALT(P = 0. 035)浓度在统计学上显著高于稳定组。图9给出登记时两组的血浆ALB mRNA浓度。稳定组的血浆ALB mRNA浓度中位数为533个拷贝/mL (69-2，399)，而不稳定组的血浆ALB mRNA浓度中位数为1，540个拷贝/mL (203-37，524) (P = 0. 021，曼-惠特尼U检验)。在他们先前的研究中(Chan et al.，Clin. Chem. 2010 ；56 :82_9)，利用接收者工作特征曲线分析，本发明人鉴定了 835拷贝个/mL作为用于区别健康对照和患有肝病变的患者的灵敏且特异性的截止值。采用相同的截止值用于本研究，本发明人发现稳定组和不稳定组中分别有21% (3/14)和70% (7/10)具有升高的血浆ALB mRNA浓度。两组中具有升高的血浆ALB mRNA浓度的病例比例是统计学差异显著的(X 2检验，P < 0. 0001)。发明人进一步研究了 24名受体的血浆ALB mRNA浓度与生化肝功能检测参数之间的关系。血浆ALB mRNA浓度与血浆ALP (斯皮尔曼相关法，r2 = 0. 71, P < 0.0351)和 ALT(r2 = 0. 45, P = 0. 03)浓度显著相关，但是与白蛋白(r2=-0. 16, P = O. 46)或胆红素 Cr2 = 0. 15, P = 0. 5)不相关。连续监测血浆ALB mRNA追踪24名受体临床进程的持续时间中位数为110周。稳定组的总研究时间112周(87-160)与不稳定组的总研究时间107周(69-159)相当，没有任何统计学显著差异(P= 0.412)。研究期间，采集105份血液标本(56份来自稳定组和49份来自不稳定组)用于血浆ALB mRNA分析，并且全部都有可检测的血浆ALB mRNA。具有稳定临床进程的肝移植后受体在稳定组的14名受体中，有12名受体(86%)在整个研究期间具有不显著的临床进程。对于研究期间进行的全部测量而言，稳定组的血浆白蛋白、胆红素、ALP和ALT浓度中位数分别为 44g/L (35-49)、15 u mol/L(5_38)、85U/L (59-290)和 28U/L (10-158)。与登记时首次采集的血样一致，稳定组的血浆ALB mRNA浓度中位数为418个拷贝/mL (52-15，320)。图IOA是从稳定组得到的全部血浆ALB mRNA的测量值图。仅25% (14/56)的血浆ALB mRNA测量值高于835个拷贝/mL。当将来自稳定组的全部血浆ALB mRNA测量值分组时，第5个百分点和第95个百分点的值分别为90个拷贝/mL和2，400个拷贝/mL。在所有情况下，这12名受体的生化肝功能检测特征保持不显著。在14名稳定受体中，2名受体(14% )的生化肝功能检测参数具有迅速恢复到正常范围内而没有影响的偶发性上升。那些情况下测量的来自2名受体的血浆ALB mRNA浓度为15，320和2，399个拷贝/mL。然而，随后检查时水平分别恢复到497和1，044个拷贝/mL。相关性分析表明，研究期间所测量的14名稳定受体的血浆ALB mRNA浓度与血浆ALP浓度并不显著相关(r2 = 0.41，P = 0.002)，但是与白蛋白(r2 = -0.06，P = 0.68)、胆红素(r2 = -0. 19，P = O. 16)、ALT(r2 = 0. 19，P = O. 16)不相关。具有不稳定临床进程的肝移植后受体
在研究期间，不稳定组的10名受体具有至少一种肝相关并发症发作。表7列出不 稳定组受体在研究期间出现的肝相关并发症。将整个研究期间得到的测量值分组，不稳定组的血浆白蛋白、胆红素、ALP和ALT浓度中位数分别为40g/L(16-46) ,23 u moI/L(5-250)、150U/L(46-601)和50U/L(20-413)。不稳定组的血浆ALB mRNA水平中位数为2，721个拷贝/mL(203-61，694)，其比稳定组的血浆ALB mRNA水平中位数(418个拷贝/mL)高6. 5倍。与稳定受体中所观测到的血浆ALB mRNA持续低浓度相反，在不稳定受体中可观测到高度波动甚至是持续升高的血浆ALB mRNA浓度，如图IOB所示。78% (38/49)的不稳定组的血浆ALB mRNA测量值高于835个拷贝/mL。稳定组和不稳定组中具有升高的血浆ALB mRNA浓度的测量值比例是统计学差异显著的(X 2检验，P < 0. 0001)。对于不稳定组的10名受体，6名发生急性肝并发症(病例UOl至U06)，4名患有慢性肝并发症(病例U07至U10)。急性和慢性组的血浆ALB mRNA浓度和ALT活性-浓度的连续测量值分别在图11和图12中示出。患有急性肝相关并发症的不稳定受体图11和图12的图中标记了每次肝相关并发症发作的诊断时间。在患有记录的急性肝相关并发症的6名受体中，4个病例在诊断并发症的时间之前血浆ALB mRNA浓度升高(超过835个拷贝/mL的截止值)(图11)。病例UOl至U06总共记录9次并发症发作。在进行诊断时，全部并发症发作中血浆ALB mRNA浓度升高。相反，在9次发作中，仅4次发作的血浆ALT活性升高(> 58U/L)。患有慢性肝相关并发症的不稳定受体不稳定组的4名受体具有总共5次本质上是慢性的肝相关并发症发作。除了发现病例UlO患有肝脓肿时外，诊断时血浆ALB mRNA浓度升高(图12)。血浆ALT活性在诊断3次发作时升高。III.讨论在本研究中，本发明人进一步证实他们之前的数据，即血浆ALB mRNA是肝病变的灵敏标志物。在本研究中，以肝移植后受体为例。24名招募的受体中，23名是临床稳定的，在登记时具有正常的生化肝功能检测特征，并且经临床鉴定没有内科和外科并发症。在连续监测期间，在进行各种并发症的临床诊断时发现血浆ALB mRNA浓度升高。在不稳定组中，记录的14次并发症发作中有13次与ALB mRNA浓度升高相关。实际上，在大多数发作中，血浆ALB mRNA浓度在进行诊断的时间之前升高。这些数据进一步证实，血浆ALB mRNA是在早期诊断肝病变中有用的灵敏标志物。对于大多并发症的急性发作，血浆ALT活性-浓度并未升高。该观测结果表明，对于肝病变，血浆ALB mRNA是比ALT更灵敏的标志物。另一方面，血浆ALB mRNA浓度升高对肝病变出现是特异性的。从稳定组得到的大多测量值低于以前确定的用于肝疾病检测的截止值。稳定组的2名受体具有短暂升高的血浆ALB mRNA浓度。这些现象的出现可能与临床上未鉴定的短暂性肝相关并发症有关。
总之，血浆ALB mRNA浓度升高允许灵敏和特异地检测肝病变，甚至是在受体没有症状、血浆ALT活性-浓度正常及临床未怀疑有并发症时的阶段。因而，测量血浆ALB mRNA浓度用作筛选肝病变和常规检查可能发生肝相关并发症的人的有用方法。由于本项目研究的大多数肝移植受体已从他们原先的肝疾病和移植中完全恢复，发明人在本研究中所做的观测结果可以应用于以前没有肝疾病史或已从以前的肝疾病发作中恢复的任何人。实施例3 :升高的血浆白蛋白mRNA浓度用于检测脂肪肝病脂肪肝病，包括非酒精性脂肪肝病，是富裕国家中最常见的慢性肝疾病(Farrellet al. , J Gastroenterol Hepatol 2007;22:775-7)。其可发展成肝硬化和肝癌。非酒精性脂肪肝病与代谢综合征和中心性肥胖密切相关(Wong et al. , Clin GastroenterolHepatol 2006;4:1154-61)。超声扫描可以用于诊断脂肪肝。然而，超声扫描依赖于操作者，并且对脂肪肝诊断具有有限的灵敏度和特异性。肝活检和组织学检查提供脂肪肝及任何相关的肝炎症或纤维化的权威性证据，但是活检是侵入性操作，且可导致急性并发症如出血。随着技术的改进，现在可能使用质子磁共振波谱(MRS)作为测量肝甘油三酯(IHTG)即脂肪肝的指示物含量的灵敏和非侵入性的技术(Szczepaniak et al. ,Am J Physiol Endocrinol Metab 2005 ；288:E462-8)。然而，MRS成像耗费时间，需要专业成像设备和受培训的专业操作人员。在本研究中，发明人检查了与健康对照相比时，患有脂肪肝的患者的血浆ALB mRNA是否升高。I.材料与方法对明显健康的志愿者进行MRS。测量IHTG含量。具有IHTG含量< 5%的个体被认为具有健康肝，而具有IHTG含量> 5%的个体被诊断为患有脂肪肝病。此外，本研究还包括通过肝活检的组织学检查被诊断为患有脂肪肝病的个体。将全部招募的个体的外周血采集到EDTA血液管。通过如前面实施例所述的二次离心方案处理血样，以获得血浆。使用如前面实施例所述的RT-qPCR检测测量血浆ALB mRNA浓度。II.结果通过MRS发现136名志愿者的IHTG含量<5%，因而将其招募为正常对照。通过MRS发现47名个体的IHTG含量> 5%，由此诊断为患有脂肪肝病。通过肝活检组织学检查将35名个体诊断为患有脂肪肝病。与对照相比时，患有脂肪肝病的病例的血浆ALB mRNA浓度在统计学上显著更高(曼-惠特尼P < 0. 001)(图13)。如果将脂肪肝病病例再分成通过MRS诊断或肝活检诊断，比较同样是统计学显著的(克-瓦二氏检验，之后是成对比较，三组之间的全部成对比较P < 0. 0001)(图14)。测量这些患者的血浆ALT，其在大多病例中并未升高(图15)。即使是通过肝活检诊断为患有脂肪肝病的组，46% (16/35)的ALT活性-浓度位于参考截止值之内。III.讨论脂肪肝病被认为是可发展成肝纤维化、肝硬化、甚至是HCC早期肝病变。与对照相比时，脂肪肝病患者的血浆ALB mRNA升高，表明血浆ALB mRNA的确是其灵敏度足以检测诸如脂肪肝病的早期肝病变的标志物。通过肝活检诊断患有脂肪肝病的组，通常比那些通过MRS诊断的组患有更高级阶段的脂肪肝病。这是因为肝活检组的个体具有症状或异常生化肝功能检测参数来保证被推荐用于肝活检，而MRS组包含无症状的志愿者。数据显示通过肝活检诊断的组具有统计学上显著高于通过MRS诊断的脂肪肝病病例的血浆ALB mRNA浓度。该观测结果表明，血浆ALB mRNA浓度与肝病变的严重程度相关，因而是可用于评估疾病阶段、用于预后和用于治疗监测的工具。这些数据进一步显示，对于检测脂肪肝病和其他早期肝病变，ALT是不如血浆ALB mRNA灵敏的标志物。 基于所呈现的实例获得的数据，始终表明，血浆ALB mRNA是包括肝细胞损伤、死亡或凋亡的肝病变的灵敏标志物。与健康对照相比时，肝病变个体的血浆ALB mRNA的浓度变得升高，所述肝病变包括肝细胞损伤、死亡或凋亡。这种肝或肝胆病变包括急性疾病状况，例如急性肝炎，包括那些由于中毒或病毒原因所致急性肝炎，缺氧性损伤，胆管炎和急性胆道梗阻。这种肝或肝胆病变还包括慢性疾病状况，例如慢性肝炎，包括由于乙型肝炎或丙型肝炎病毒所致的慢性肝炎，脂肪肝病，肝纤维化，肝硬化，肝细胞癌，但不包括肝移植后复发的那些慢性病症。本发明人的数据表明，与健康对照相比，血浆ALB mRNA升高的幅度与肝病变的严重程度相关，因为其可能反映出肝细胞损伤、死亡或凋亡的程度。因而，可以将血浆ALBmRNA浓度用于预后和监测以上所列的所有肝病变的治疗有效性。同样，已显示血浆ALB mRNA升高的灵敏度足以检测早期肝疾病，如脂肪肝病。全部肝病变包括肝细胞损伤、死亡或凋亡。因而，升高的血浆ALB mRNA作为用于肝病变早期检测的灵敏标志物同样是有用的，所述肝病变例如乙型肝炎病毒携带者发展成活动性肝炎、肝硬化代偿失调或进程、早期肝细胞癌，但是不包括肝移植后复发的那些肝病变。为了所有目的,本申请中引用的全部专利、专利申请和其他出版物,包括GenBank登录号通过引用整体并入。表I有信息的移植受体和供体的ALB基因型
权利要求
1.用于检测肝疾病的方法，所述方法包括以下步骤 (a)测定取自没有肝疾病指征的个体的无细胞血样中白蛋白mRNA的浓度；以及 (b)将步骤(a)的所述白蛋白mRNA的浓度与标准对照进行比较，其中所述步骤(a)的浓度与所述标准对照相比增加表示所述个体中存在肝疾病。
2.如权利要求I所述的方法，其中所述个体具有正常的丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测结果。
3.如权利要求I所述的方法，其中所述肝疾病是脂肪肝病、肝硬化、肝纤维化或肝炎。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述肝炎是乙型肝炎。
5.如权利要求I所述的方法，其中所述肝疾病是威尔森氏症、血色病、a-I抗胰蛋白酶缺乏症或糖原贮积病。
6.如权利要求I所述的方法，其中所述步骤(a)的白蛋白mRNA的浓度与所述标准对照基本上相同，从而表示所述个体没有肝疾病。
7.如权利要求I所述的方法，其中所述血样是血浆。
8.如权利要求I所述的方法，其中所述血样是血清。
9.如权利要求I所述的方法，其中所述步骤(a)包括扩增白蛋白mRNA序列。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述扩增是通过聚合酶链式反应(PCR)。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述PCR是反转录酶(RT)-PCR。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述PCR是数字PCR。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述PCR是实时定量PCR。
14.如权利要求I所述的方法，其中所述步骤(a)包括质谱分析或与微阵列、荧光探针或分子信标杂交。
15.如权利要求I所述的方法，其还包括在稍后时间利用来自所述个体的同一类型的无细胞血样重复步骤(a)，其中与原步骤(a)相比在稍后时间所述白蛋白mRNA的浓度增加，表示所述肝疾病的恶化，而降低表示所述肝疾病的改善。
16.如权利要求6所述的方法，其还包括在稍后时间利用来自所个体的同一类型的无细胞血样重复步骤(a)，其中与原步骤(a)相比，在稍后时间所述白蛋白mRNA的浓度增加表示肝出现疾病，而基本没有差异则表示没有肝疾病的生理状况。
17.如权利要求I或15所述的方法，其中以至少I个标准偏差从标准对照增加或降低。
18.如权利要求I或15所述的方法，其中以至少2个标准偏差从标准对照增加或降低。
19.如权利要求I或15所述的方法，其中以至少3个标准偏差从标准对照增加或降低。
20.用于诊断没有肝疾病指征的个体中肝疾病的试剂盒，其包含(I)提供健康个体血样中白蛋白mRNA平均量的标准对照；以及(2)用于特异性扩增至少部分白蛋白mRNA的两种寡核苷酸引物。
21.如权利要求20所述的试剂盒，其还包含说明手册。
22.如权利要求20所述的试剂盒，其还包括用于与白蛋白编码序列特异性杂交的多核苷酸探针。
全文摘要
本发明提供了用于检测或监测没有任何肝病变指征的中肝疾病的新方法，所述方法通过测定来自所述个体的无细胞血样中白蛋白mRNA浓度的量，然后将白蛋白mRNA的量或浓度与标准对照进行比较。
文档编号C12Q1/68GK102741426SQ201080049558
公开日2012年10月17日 申请日期2010年9月10日 优先权日2009年9月11日
发明者卢煜明, 赵慧君, 陈颖欣 申请人:香港中文大学