专利名称：包括氨基醇的酶氧化的生产聚胺的方法
包括氨基醇的酶氧化的生产聚胺的方法本发明涉及一种使用酶来生产聚胺的方法；特别是涉及一种在水性环境中进行的方法；用所述方法生产的聚胺；以及所述聚胺用于造纸、固定酶或用于制备药物或化妆品组合物的用途。本发明还涉及一种用于原位再生辅因子NAD (P)+的新方法。
背景技术：
聚胺，如PEI (聚乙烯亚胺)是具有十分广泛应用的阳离子聚合物。PEI及其衍生物被用于例如纸浆和纸的制造中以克服由树脂和机械木浆提取物造成的生产问题(MonchD7Stange A, Linhart F,用于伴行消除和增加造纸功效的先进生产概念(AdvancedProduct Concepts for Concomitant Elimination and Increased Efficiency of PaperManufacture) ,Wochenblatt fiir Papierfabrikation 1996，124 :889_892，894-895)。聚合物的荷电性也使其可用于例如酶的固定(Grunwald PiFreder RiGunsser W，聚乙烯亚胺作为酶固定载体材料的应用(Application of polyethylene imine as carrier materialfor enzyme immobilization)Naturwissenschaften 1981，68 :525_526) ； (de LathouderKM，van Benthem DTJ,Wallin SA,Mateo C. ,Fernandez Lafuente R,Guisan JM，KapteijnF, Moulijn JA，作为酶载体的聚乙烯亚胺(PEI)官能化的蜂窝状陶瓷载体制备和性能(Polyethyleneimine(PEI)functionalized ceramic monoliths as enzyme carriers Preparation and performance)Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic 2008,50 20-27)。最近已经在基因传递方面取得了一些进展，其中已经表明PEI (有时与PEG联合)增加了 DNA/RNA 的细胞渗透(Lungwitz U, Breunig M, Blunk T, G6pferich A,以聚乙烯亚胺为基础的非病毒基因传递系统(Polyethylenimine-based non-viral genedelivery systems)European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2005,60:247-266) ； (Belenkov Al,Alakhov VY,Kabanov AV,Vinogradov SV,Panasci LC,MoniaBP, Chow TY.用普朗尼克P85进行接枝的聚乙烯亚胺增强了 Ku86反义传递和体内的电离福身寸功效(Polyethyleneimine grafted with pluronic P85 enhances Ku86antisensedelivery and the ionizing radiation treatment efficacy in vivo), Gene Therapy2004，11 1665-1672.) ； (Jeong JH, Kim Sff, Park TG. 一种以自组装的 0DN-PEG 杂交共轭胶束为基础的新的反义寡核苷酸传递系统(A new antisense oligonucleotide deliverysystem based on self-assembled ODN-PEG hybrid conjugate micelles). Journal ofControled Release. 2003,93 :183_191)。因为引入了 AND(反义寡核苷酸)的概念，并且在2006年获得了诺贝尔奖，因此，这是一种十分有前景的应用。反编码(anticoding)基因的成功传递将治愈多种疾病如HIV、癌症、自身免疫应答等。聚胺的另一些治疗应用包括缓解与皮肤疾病和化疗有关的症状。
目前可获得的聚胺如PEI和树状聚合物是在有机溶剂中合成的。乙烯亚胺的常规聚合是以开环为基础的，因此，将重复单元的长度限制为氮原子之间两个碳。因此，本发明所要解决的问题是提供一种制备聚胺的方法，其可以在水性环境中进行，并且并不限于C2-构造块。
发明概述
上述问题通过提供一种新的聚胺合成方法得到了解决，该方法可以在水性介质中进行并且如所附权利要求书中进一步定义的那样，该方法是以某些酶的应用为基础的。
具体地讲，提供了如图1和2中概述的合成聚胺的新方法。通过醇脱氢酶如马肝醇脱氢酶(HLADH)的作用(用NAD+/NADH作为辅因子)(图1)或通过醇氧化酶的作用(用分子氧作为电子受体)(图2)，在水性环境中将氨基醇例如3-氨基-1-丙醇氧化成氨基醛。 由此形成的氨基醛在中等酸性PH下自发性与亚胺反应，从而形成聚亚胺。然后，通过还原， 例如用氰基硼氢化钠还原来将所述聚亚胺转化成聚胺。聚合物中的重复单元可在氮原子之间具有两个或多个碳原子、可具有官能团，并且可以是手性化合物，其仅受酶接受作为底物的起始氨基醇的容量的限制。在自然界中发现了许多具有不同的底物特异性和/或活性的醇脱氢酶和醇氧化酶。
为了支持底物的完全转化，应用一种用于辅因子再生的方法是有利的。迄今为止，NAD+的再生一直是个问题；一种方法利用酶NADH-氧化酶，其是一种十分昂贵的物质(Riebel BR, Gibbs PR, Wellborn WB, Bommarius AS，得自 NADH 的 NAD+和得自 NADPH 的NADP+的辅因子再生得自旧金山乳杆菌的NADH氧化酶(Cofactor Regeneration of both NAD+from NADH an d NADP+from NADPH :NADH Oxidase from Lactobacillus sanfranciscensis)Advanced Synthesis & Catalysis 2003，345 :707-712)。
本发明以乙酸乙烯酯的自发水解为基础，提出了一种简单的新方法，该方法可以与酶聚合反应相结合。
在使用醇氧化酶的情况中，通过将该反应与氧化酶、特别是过氧化氢酶的催化活性结合，所形成的过氧化氢被迅速转化成水和氧，从而使反应平衡进一步向醛一侧移动，并因此支持了底物的完全转化。
图1 :用醇脱氢酶催化的聚胺合成的图示。将pH降至pH 4. 5以使聚亚胺形成。然后，用氰基硼氢化物进行聚亚胺的还原。在原位用所形成的乙醛来进行辅因子的再循环，所述乙醛是在碱性PH下或者用酯酶进行乙酸乙烯酯的自发水解后形成的。
图2 :用醇氧化酶催化的聚胺合成的图示。将pH降至pH 4. 5以使聚亚胺形成。然后，用氰基硼氢化物进行聚亚胺的还原。该酶利用氧并且在原位用过氧化氢酶进一步氧化所形成的过氧化氢。
图3 :排阻色谱。从顶端开始由2-苯基甘氨醇制得的聚合物、对照(PEI1800)(未起作用(也许是上样过多))、由3-氨基丙醇制得的聚合物、由D-丙氨醇制得的聚合物、由 L-丙氨醇制得的聚合物。各聚合物具有约IOOODa的分子量(Mw标准品未示出)。
图4 :由2-苯基甘氨醇形成的低聚物的MALD1-T0F光谱。
图5 PEI1800 的 MALD1-T0F 光谱。
本发明的特定实施方案
1.在第一个实施方案中，本发明提供了一种生产通式(4)的聚胺的方法，特别是在含水反应介质中进行的方法，
权利要求
1.一种生产通式(4)的聚胺的方法
2.权利要求1的方法，其中步骤a)的氨基醇是其中X= -CH2-CH2-的式(I)化合物。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤a)的酶选自脱氢酶和氧化酶，特别是醇脱氢酶E.C.1.1.1.1、醇脱氢酶(NADP+)1.1.1. 2、烯丙基-醇脱氢酶E. C.1.1.1. 54、醇脱氢酶[NAD(P)+]E.C.1.1. 1.71、芳基-醇脱氢酶E.C.1.1.1. 90、芳基-醇脱氢酶(NADP+) E. C.1.1.1. 91,3-羟基苄基-醇脱氢酶E. C.1.1.1. 97、紫苏醇脱氢酶E. C.1.1.1. 144、长链醇脱氢酶E. C.1.1.1. 192、松柏醇脱氢酶E. C.1.1.1. 194、肉桂醇脱氢酶E. C.1.1.1. 195、 环己醇脱氢酶E. C.1.1. 1.245、4-(羟基甲基)苯磺酸酯脱氢酶E. C.1.1. 1.257,3-甲基丁醛还原酶E. C.1.1. 1.265、S-(羟基甲基)谷胱甘肽脱氢酶E. C.1.1.1. 284、醇脱氢酶(受体)E. C.1.1. 99. 8、聚乙烯基-醇脱氢酶(受体)E. C.1. 1.99. 23、甲醛脱氢酶(谷胱甘肽) Ε. C. 1.2.1.1和醇氧化酶，Ε. C.1. 1.3. 13、芳基-醇氧化酶E. C.1. 1.3. 7、仲-醇氧化酶 Ε. C.1.1. 3. 18、长链醇氧化酶Ε. C.1.1. 3. 20、聚乙烯基-醇氧化酶E. C.1.1. 3. 30、香草醇氧化酶 Ε. C.1.1. 3. 38。
4.权利要求3的方法，其中所述酶是马肝醇脱氢酶(HLADH)并且具有SEQID NO 1的多肽序列，或者是具有SEQ ID NO :2的多肽序列的醇氧化酶；或者是它们的与SEQ ID NO I或2的序列具有至少60%序列一致性的突变体或变型。
5.权利要求3或4的方法，其中在步骤a)中，如果使用醇脱氢酶，则用NAD+作为氧化的辅因子；或者如果使用醇氧化酶，则该反应在需氧条件下进行。
6.权利要求5的方法，其中通过用相同的脱氢酶将醛或酮还原成相应的醇来通过酶再生NAD+辅因子。
7.权利要求5的方法，其中所述醛或酮是通过活性酯的水解形成的。
8.前面权利要求中任意一项的方法，其中化学还原步骤c)是在存在NaBH3CN或Pd/H2 的情况下进行的。
9.前面权利要求中任意一项的方法，其中获得分子范围为Mn= 100至7，000，000的聚胺。
10.前面权利要求中任意一项的方法，其中步骤b)是在具有支持形成聚亚胺的pH、优选3. 5至6的pH的水性介质中进行的。
11.前面权利要求中任意一项的方法，其中步骤a)是在pH范围为6至10的水性介质中进行的。
12.前面权利要求中任意一项的方法，其中所述酶是以溶解、分散或固定的形式使用的。
13.可用前面权利要求中任意一项的方法获得的聚胺。
14.如权利要求3和4中任意一项所定义的酶用于生产聚胺的用途。
15.可用权利要求1至12中任意一项的方法获得的聚胺用于造纸；固定酶；或制备药物或化妆品组合物的用途。
16.权利要求15的用途，其中所述药物组合物选自用于改善DNA和/或RNA的细胞渗透的组合物；用于治疗皮肤疾病的软膏；用于治疗化疗副作用的组合物；药物传递组合物。
17.一种再生在脱氢酶催化的由所述酶的第一底物SI生成第一种氧化的产物Pl的氧化反应过程中产生的NAD(P)+的方法，该方法包括通过使所述的脱氢酶催化的氧化反应与第二个同时进行的脱氢酶催化的由不同于SI和Pl的所述酶的第二底物S2生成不同于Pl 和SI的第二个还原的产物P2的还原反应相结合来再生NAD(P)+，其中所述底物S2是由前体分子PrS2产生的。
18.权利要求17的方法，其中所述脱氢酶是醇脱氢酶(ADase)。
19.权利要求17或18的方法，其中所述PrS2分子是羧酸的乙烯酯，其在水解时被分解成相应的羧酸和作为第二底物S2的乙醛。
20.权利要求17至19中任意一项的方法，其中所述第一底物SI是一种可被所述ADase 氧化的醇。
21.权利要求20的方法，其中所述的醇是上面式(I)的氨基醇。
22.权利要求18至21中任意一项的方法，其中所述再生反应是在水性介质中进行的。
全文摘要
本发明涉及一种使用酶来生产聚胺的方法；特别是涉及一种在水性环境中进行的方法；用所述方法生产的聚胺；以及所述聚胺用于造纸、固定酶或用于制备药物或化妆品组合物的用途。本发明还涉及一种原位再生辅因子NAD(P)+的新方法。
文档编号C12P13/00GK103052716SQ201080049472
公开日2013年4月17日 申请日期2010年10月29日 优先权日2009年11月2日
发明者B·豪尔, D·K·恩格马克卡西姆吉, P·贝里隆德 申请人:巴斯夫欧洲公司