专利名称：含有核酸的脂质粒子及相关的方法
含有核酸的脂质粒子及相关的方法
技术领域：
本申请要求2009年11月4日提交的美国临时申请No. 61/280,510的权益，将其通过引用整体并入本文。
背景技术：
脂质纳米粒子(LNP)是接收了调控批准的最临床进展的具有基于7个LNP的药物的药物递送系统。这些批准的药物含有小分子诸如抗癌药物及相比"游离的"药物呈现改善的功效和/或减少的毒性。LNP载体技术也已应用于递送"遗传"药物诸如用于表达治疗性蛋白或用于沉默贡献于疾病进展的基因的小干扰RNA(SiRNA)寡核苷酸(OGN)的质粒。siRNA OGN和其他遗传药物的有效体内递送的作出方法是阻碍这些剂作为治疗剂的革命性的潜力的主要问题。
遗传药物的包裹和递送需要的LNP技术的新近发展及阳离子脂质的设计点亮了LNP系统解决体内递送问题的潜力。LNP-siRNA系统已显示在静脉内(静脉内)注射之后诱导动物模型，包括非-人灵长类动物中治疗关联的靶基因的沉默，且目前在几个临床试验中评估下。已开发各种方法来配制含有遗传药物的LNP系统。这些方法包括在乙醇的存在下混合预形成的LNP与OGN或混合溶解于乙醇的脂质与含有OGN的水性介质和得到具有IOOnm或更小的直径的LNP和65 95%的OGN包裹效率。这些方法均依赖于阳离子脂质的存在，以达到OGN和聚(乙二醇)(PEG)脂质的包裹，以抑制大结构的聚集和形成。产生的LNP系统的性质，包括尺寸和OGN包裹效率，敏感于各种制剂参数诸如离子强度，脂质和乙醇浓度，pH, OGN浓度及混合速度。一般而言，使用当前制剂过程难于控制参数诸如在混合时的相对脂质和OGN浓度，以及混合速度，导致在制备物之内及之间产生的LNP的特征的变异性。微流体装置提供以nl尺度控制性地和快速混合流体的能力，精确控制温度，驻留时间和溶质浓度。控制的及快速微流体混合已之前应用于合成无机纳米粒子和微粒，及可胜过纳米粒子的大规模产生中的大规模系统。微流体2-相滴技术已应用于产生单分散聚合物微粒用于药物递送或用于产生用于细胞包裹的大囊泡，蛋白或其他生物分子。已展示水动力流聚焦，常见的微流体技术的使用以提供试剂的快速混合，以创建控制的尺寸的单分散脂质体。此技术也已证明相比本体产生方法，对于随着小分子的更高包裹，获得更小，更多单分散粒子的聚合物纳米粒子的产生有用。尽管含有遗传药物的LNP系统的方法的开发的发展，存在对制备含有治疗性物质的脂质纳米粒子的装置和方法，以及改善的含有治疗性物质的脂质纳米粒子的需求。本发明寻求实现此需求及提供进一步相关的优势。发明概述一方面，本发明提供包含核酸的脂质粒子。在一实施方式中，脂质粒子包含(a) —种或更多阳离子脂质，(b) —种或更多第2脂质，及(C) 一种或更多核酸，其中脂质粒子包含基本上实体核心，如本文定义。在一实施方式中，阳离子脂质是DLin-KC2-DMA。在特定实施方式中，粒子包含约30 约95摩尔百分率阳离子脂质。在一实施方式中，第2脂质是PEG-c-DMA。在一实施方式中，第2脂质是I，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。在特定实施方式中，粒子包含约I 约10摩尔百分率第2脂质。核酸可为DNA，RNA，锁核酸，核酸类似物，或能表达DNA或RNA的质粒。在另一实施方式中，脂质粒子包含(a) —种或更多阳离子脂质，(b) 一种或更多中 性脂质，(C) 一种或更多PEG-脂质，(d) —种或更多甾醇；及(e) —种或更多核酸，其中脂质粒子包含基本上实体核心，如本文定义。在一实施方式中，阳离子脂质是DLin-KC2-DMA。在一实施方式中，PEG-脂质是PEG-c-DMA。在一实施方式中，中性脂质是1，2_ 二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。在一实施方式中，甾醇是胆甾醇。在一实施方式中，核酸是siRNA。在进一步实施方式中，脂质粒子由一种或更多阳离子脂质，及一种或更多核酸组成。在一实施方式中，脂质粒子包含基本上实体核心，如本文定义。在一实施方式中，阳离子脂质是DLin-KC2-DMA。在一实施方式中，核酸是siRNA。在其他方面，本发明提供使用脂质粒子的方法。在一实施方式中，本发明提供给受试者施用核酸的方法，包括施用本发明的脂质粒子给有需求的受试者。在一实施方式中，本发明提供将核酸导入细胞的方法，包括使细胞接触本发明的脂质粒子。在一实施方式中，本发明提供调节靶多核苷酸或多肽的表达的方法，包括使细胞接触本发明的脂质粒子，其中核酸能调节靶多核苷酸或多肽的表达。在一实施方式中,本发明提供治疗受试者中表征为多肽的过表达的疾病或病症的方法，包括给受试者施用本发明的脂质粒子，其中核酸能沉默或降低多肽表达。在其他方面，本发明提供制造脂质粒子的方法。在一实施方式中，本发明提供制造含有核酸的脂质粒子的方法，包括(a)将在第I溶剂中包含核酸的第I流导入微流体装置；其中装置具有适于将一个或更多流导流入装置的第I区和用于用微流体混合器混合一个或更多流的内容物的第2区；(b)将在第2溶剂中包含脂质粒子-形成物质的第2流导入装置以提供在层流条件下流动的第I和第2流，其中装置具有适于将一个或更多流导流入微通道的第I区和用于混合一个或更多流的内容物的第2区，其中脂质粒子-形成物质包含阳离子脂质，且其中第I和第2溶剂不相同；(c)使一个或更多第I流和一个或更多第2流从装置的第I区流入装置的第2区；以及(d)在装置的第2区中混合在层流条件下流动的一个或更多第I流和一个或更多第2流的内容物以提供包含具有包裹的核酸的脂质纳米粒子的第3流。在另一实施方式中，本发明提供制造含有核酸的脂质粒子的方法，包括
(a)将在第I溶剂中包含核酸的第I流导入通道；其中装置具有适于将一个或更多流导流入通道的第I区和用于混合一个或更多流的内容物的第2区；(b)导入在第2溶剂中包含脂质粒子-形成物质的第2流；其中通道具有适于将一个或更多流导流入通道的第I区和用于混合一个或更多流的内容物的第2区；(c)使一个或更多第I流和一个或更多第2流从通道的第I区流入通道的第2区，而维持2个流的物理隔离，其中一个或更多第I流和一个或更多第2流先不混合，直到到达通道的第2区后才混合；以及(d)在微通道的第2区中混合在层流条件下流动的一个或更多第I流和一个或更多第2流的内容物以提供包含具有包裹的核酸的脂质纳米粒子的第3流。在以上方法的特定实施方式中，混合一个或更多第I流和一个或更多第2流的内容物包括改变一个或更多第I流和一个或更多第2流的浓度或相对混合速度。 在以上方法的特定实施方式中，方法还包含用水性缓冲剂稀释第3流。在特定实施方式中，稀释第3流包含使第3流和水性缓冲剂流入第2混合结构。在以上方法的特定实施方式中，方法还包含透析包含具有包裹的核酸的脂质粒子的水性缓冲剂以减少第2溶剂的量。在以上方法的特定实施方式中，第I溶剂是水性缓冲剂。在以上方法的特定实施方式中，第2溶剂是含水醇。在以上方法的特定实施方式中，所述混合第I和第2流的内容物包括杂乱平流。在以上方法的特定实施方式中，所述混合第I和第2流的内容物包括用微混合器混合。在以上方法的特定实施方式中，核酸包裹效率是约90 约100%。在以上方法的特定实施方式中，一个或更多第I流和一个或更多第2流的混合在第I区中被屏障阻止。在特定实施方式中，屏障是通道壁，鞘流体或同心管道。在本发明的另一方面，提供制造脂质粒子的装置。在一实施方式中，本发明提供产生包裹核酸的脂质粒子的装置，包括(a)第I入口，其用于接收在第I溶剂中包含核酸的第I溶液；(b)第I入口微通道，其与第I入口流通连接以提供在第I溶剂中包含核酸的第I流；(c)第2入口，其用于接收在第2溶剂中包含脂质粒子-形成物质的第2溶液；(d)第2入口微通道，其与第2入口流通连接以提供在第2溶剂中包含脂质粒子-形成物质的第2流；以及(e)第3微通道，其用于接收第I和第2流，其中第3微通道具有适于在层流条件下将第I和第2流导流入微通道的第I区和适于混合第I和第2流的内容物的第2区以提供包含具有包裹的核酸的脂质粒子的第3流。在一实施方式中，装置还包含用于稀释第3流的设施以提供稀释的包含稳定化的具有包裹的核酸的脂质粒子的流。在特定实施方式中，用于稀释第3流的设施包含微混合器。在一实施方式中，微通道具有约20 约300 ii m的水动力直径。在一实施方式中，微通道的第2区包含浅浮雕结构。在一实施方式中，微通道的第2区具有主流方向和一个或更多表面，所述表面具有至少一个限定于其中的凹槽或突起，凹槽或突起具有与主方向成角的取向。在一实施方式中，第2区包含微混合器。在特定实施方式中，装置还包含用于改变第I和第2流的流速的设施。在特定实施方式中，装置还在第I区中包含对于物理隔离一个或更多第I流与一个或更多第2流有效的屏障。
本发明的上述方面和许多伴随优势会变得更容易被同意为与通过参考下列详述，参照附图更佳明白的相同的。图I是本发明的代表流体装置的示意图。图2是本发明的代表流体装置的示意图，其为图I中例证的装置的明细。 图3是本发明的代表流体装置的示意图，其为图2中例证的装置的明细。图4是本发明的代表流体装置和方法的示意图。图5是本发明的代表阵列的示意图，其包含图4中例证的流体装置中的10个。图6是本发明的代表流体装置的示意图。图7是本发明的代表阵列的示意图，其包含图6中例证的代表流体装置中的10个。图8是本发明的代表流体装置的示意图，其具有3个入口和单个出口(装置800包括混合通道810)。图9是本发明的代表流体装置的示意图，其具有2个入口和单个出口(装置900包括混合通道910)。图10是本发明的代表流体装置的示意图，其具有多重(n)系列个入口和单个出口(装置 1000 包括混合通道 1010a, 1010b, IOlOc 和 IOlOd)。图11是本发明的代表流体装置的示意图，其具有3个入口和单个出口(装置1100包括混合通道1110a, IllOb和IllOc)。 图12是本发明的代表流体装置的示意图，其具有7个入口和单个出口(装置1200包括混合通道 1210a, 1210b, 1210c 和 1210d)。图13是本发明的代表流体装置的示意图，其具有多层混合器(装置1300包括混合通道1310)。图14是图14中例证的多层混合器的近观视图。图15A是制造脂质纳米粒子(LNP)的本发明的代表微流体(MF)方法的示意图月旨质-乙醇和siRNA-水溶液泵入微流体混合装置的入口 ；装置的鲱骨状特征诱导层式流的杂乱平流及导致脂质物质与水流快速混合及形成脂质纳米粒子。混合通道是200 u m宽和79 ii m高。鲱骨状结构是31 ii m高和50 y m厚。图15B是制造脂质纳米粒子(LNP)的预形成的囊泡(PFV)方法的示意图(a)将脂质-乙醇溶液加入水溶液，pH4. 0，导致囊泡类型粒子的形成；(b)通过SOnm聚碳酸酯膜(Nuclepore)于室温使用Lipex挤出机的挤出提供更均一的粒子分布；及(C)添加siRNA溶液而涡旋及于35°C温育30分钟促进siRNA的包裹。图16A 16C例证微流体装置中的流速对混合及LNP粒径的影响。2个10 ii M荧光素(在PH8. 8荧光，在pH5. 15非-荧光)溶液混合而产生完全荧光溶液。图16A比较了通过沿着通道宽度的平均荧光强度测定的混合程度)作为从平均流体速度及行进长度(0. 2,0. 8，I. 4和2mL/min)计算的混合时间(msec)的函数。图16B和16C比较由以40 11. 5 47. 5 I 的摩尔比，siRNA-总脂质比 0.06wt/wt 的 Dlin-KC2-DMA/DSPC/胆甾醇/PEG-c-DMA组成的LNP的平均粒径，IOmM脂质-乙醇相与含有siRNA的25mM乙酸盐缓冲剂，PH4混合。图16B比较LNP的平均粒径(nm)作为流速(mL/min)的函数。图16C比较LNP的平均粒径(nm)作为乙醇/水流速比的函数。误差条代表通过动态光散射测量的平均粒径的标准偏差。图17通过比较平均粒径(nm)作为乙醇中的脂质浓度(mM)的函数例证脂质浓度对LNP粒径的影响。增加脂质浓度导致平均粒径增加。在微流体芯片中混合的乙醇相中的总脂质含量变动为IOmM 50mM。LNP由以40 11. 5 47.5 I的摩尔比，siRNA-总脂质比0. 06wt/wt的Dlin-KC2-DMA/DSPC/胆留醇/PEG-c-DMA组成。微流体混合器之内的总流速维持在2ml/min。误差条代表通过动态光散射测量的平均粒径的标准偏差。图18A和18B例证PEG-脂质和阳离子脂质对LNP系统的影响。图18A比较平均粒 径(nm)作为通过PFV和MF方法制备的LNP的PEG-c-DMA含量(LNP中的mol% )的函数。PEG-脂质在LNP组合物中变动为Imol % IOmol %。PEG-脂质含量的改变通过调节胆甾醇含量而补偿。LNP由以40 11.5 47.5 I (_x) I (+x)的摩尔比，(其中X= I 9)，siRNA-总脂质比 0. 06wt/wt 的 Dlin_KC2_DMA/DSPC/ 胆甾醇 /PEG-c-DMA 组成。图 18B比较平均粒径(nm)作为通过PFV和MF方法制备的LNP的DLin_KC2_DMA含量(mol% )的函数。阳离子脂质变动为40mol% 70mol%。PEG-c-DMA保持恒定在Imol %和与DSPC-胆甾醇维持0. 25摩尔比。微流体混合器之内的总流速维持在2ml/min。IOmM脂质-乙醇相与含有siRNA的25mM乙酸盐缓冲剂，pH4混合。误差条代表通过动态光散射测量的平均粒径的标准偏差。图19通过比较平均粒径(nm)及包裹(％ )作为siRNA/脂质比(wt/wt)(也表达为核苷酸/磷酸(N/P))的函数而例证siRNA/脂质比对粒径和包裹的影响。通过使用阴离子交换旋柱从游离的siRNA分离LNP悬浮液测定包裹。LNP由以40 11.5 47.5 I的摩尔比，siRNA-总脂质比 0. 06wt/wt 的 Dlin_KC2_DMA/DSPC/ 胆甾醇 /PEG-c-DMA 组成。微流体混合器之内的总流速维持在2ml/min。IOmM脂质-乙醇相与含有siRNA的25mM乙酸盐缓冲剂，PH4混合。误差条代表通过动态光散射测量的平均粒径的标准偏差。图20A和20B例证通过微流体混合器使用冷冻-传输电子显微镜检(TEM)制备的PEG-脂质和阳离子脂质LNP系统的形态。LNP通过Cryo-TEM以29K放大率成像。图20A是由以 40 11.5 : 47.5 I 的摩尔比的 Dlin-KC2-DMA/DSPC/胆甾醇/PEG-c-DMA 组成的空LNP的像。图20B是由以40 11.5 47. 5 I的摩尔比，siRNA-总脂质比0. 06wt/wt的Dlin-KC2-DMA/DSPC/胆甾醇/PEG-c-DMA组成的siRNA装载的LNP的像。使用微流体混合器以20mM脂质在乙醇相中进行制剂。含有Imol% PEG-c-DOMG的装载的LNP-siRNA和空粒子呈现同一形态，且结构非常均质。比例尺代表lOOnm。图21通过比较相对FVII蛋白水平(％ )作为LNP中的DLin-KC2-DMA含量40mol% 60mol%变化的siRNA剂量(mg/kg)的函数例证因子VII小鼠模型中的LNP产生的微流体的体内沉默活性。含有Imol % PEG-c-DOMG和60mol% DLin_KC2_DMA的LNP制剂提供类似于之前报道的使用替代性的方法的FVII沉默。在40mol% 60mol%的范围，含有DLin-KC2-DMA的LNP基因沉默渐进地改善。通过尾静脉注射(η = 3每剂量水平)进行LNP-siRNA向小鼠的系统性注射。在注射后24小时之后进行血收集和因子VII水平通过比色测定来测定。LNP DSPC :胆甾醇比保持在O. 2wt/wt及含有Imol% PEG-c-DOMG。LNPsiRNA :脂质比是 O. 06wt/wt。图22A 22C例证通过微流体学方法制备的脂质纳米粒子的冷冻电子显微镜检。通过微流体学制备的空脂质纳米粒子(40% DLinKC2-DMA, 11. 5% DSPC，47. 5%胆甾醇，1%PEG-c-DMA)显示指示实体核心结构的电子致密内部(图22A)。用POPC组成的样品显示与水性核心囊泡关联的欠密内部(图22B)。具有被POPC的单层围绕的三油精疏水核心的含有POPC/三油精的系统显示类似于样品A的电子致密内部(图22C)。图23例证用DLinKC2-DMA/PEG-脂质系统(90/10，mol/mol)使用微流体混合制备的限制尺寸LNP通过比较平均粒径(nm)作为LNP的乙醇/水流速比的函数，LNP在siRNA存在(N/P = I)及siRNA不存在(无siRNA)下产生。制剂使用与25mM乙酸盐缓冲剂，pH4 混合的IOmM脂质-乙醇相进行。粒径通过动态光散射测定及报道数-加权的平均直径。图24A 24C例证使用微流体混合在50 % DLinKC2_DMA，45 %胆甾醇和5 %PEG-c-DMA中包裹的siRNA的31P NMR。忽略DSPC以避免从磷脂发生的冲突磷信号。完整LNP或添加150mM乙酸铵之后不可检测来自siRNA的31P信号(图24A)(图24B)。仅可在添加1% SDS而溶解粒子之后检测信号(图24C)。图25是例证RNA酶保护测定的结果的电泳凝胶。siRNA使用微流体方法(MF)或PFV方法包裹，或保持未包裹。将Triton X-100加入，以完全溶解及裂解脂质粒子。在20%天然聚丙烯酰胺凝胶上进行凝胶电泳，并将siRNA通过用CYBR-SAFE染色来可视化。图26例证以百分率脂质混合作为时间(秒)的函数代表的脂质混合融合测定的结果。为了评定LNP的最外层中存在的暴露的阳离子脂质的量，制备3个LNP系统在siRNA缺失下(无siRNA)，以N/P = 4，及N/P= I。在pH5. 5进行脂质测定，以确保阳离子脂质的几乎完全电离，及反应通过将LNP注射进含有高度阴离子D0PS/NBD-PE/Rh-PE(98 :1:1摩尔比)囊泡的比色杯来起始。图27是通过根据本发明的方法微流体混合而形成的实体核心LNP siRNA系统的示意图。图28A和28B分别例证平均粒径(nm)及ζ电势(mV)，作为使用微流体混合器制备的连续脂质纳米粒子组合物的函数。图29是用于脂质纳米粒子的连续组装的本发明的代表装置和方法的示意图。图30是本发明的代表装置和方法的示意图。图31是本发明的代表装置和方法的示意图。图32是本发明的代表装置和方法的示意图。图33是本发明的代表装置和方法的示意图。发明详述本发明提供含有治疗剂的脂质粒子，制造含有治疗剂的脂质粒子的方法和装置，及使用脂质粒子递送治疗剂的方法。脂质粒子一方面，本发明提供含有治疗剂的脂质粒子。脂质粒子包括一种或更多阳离子脂质，一种或更多第2脂质，及一种或更多核酸。阳离子脂质.脂质粒子包括阳离子脂质。如本文所用，术语"阳离子脂质"指称阳离子或随着PH降低到脂质的可离子化的基团的PK以下成为阳离子(质子化的)，但是在更高PH值渐进地更中性的脂质。在PK以下的pH值，则脂质能结合带负电的核酸(例如，寡核苷酸)。如本文所用，术语"阳离子脂质"包括推定在PH减小后正电荷的两性离子脂质。术语"阳离子脂质"指称在选择性pH，诸如生理学pH携带净正电荷的许多脂质物质之任何。该脂质包括，但未限制于，N，N-二油基-N，N-二甲基铵氯化物(DODAC) ；N-(2,
3-二油酰氧基)丙基)_N，N，N-三甲基铵氯化物(DOTMA) ；N, N- 二硬脂基-N，N- 二甲基铵溴化物(DDAB) ;N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基铵氯化物(DOTAP) ；3-(N-(N/，N/ -二甲基氨基乙烷)_氨基甲酰基)胆甾醇(DC-Chol)和N-(l，2-二肉豆蘧酰氧基丙-3-基)-N，N- 二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。此外，阳离子脂质的许多商业制备物可在本发明中使用。这些包括，例如，LIP0FECTIN (可商购的阳离子脂质体包含DOTMA和1,2-二油酰-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE),自 GIBCO/BRL, Grand Island, NY);阳离子脂质体 (可商购的阳离子脂质体包含N-(l-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N-(2-(精胺羧酰氨基)乙基)-N，N-二甲基铵三氟乙酸盐(DOSPA)和(DOPE)，自 GIBC0/BRL);及 TRANSFECTAM: (可商购的阳离子脂质包含乙醇中的二-十八烷基氨基甘氨酰羧基精胺(DOGS)自PromegaCorp.，Madison, WI)。下列脂质是阳离子且在生理学pH以下具有正电荷D0DAP，DODMA,DMDMA, I，2~ _■亚油基氧基_N，N- _■甲基氣基丙烧(DLinDMA) ,1,2- _■亚麻基氧基-N，N- _.甲基氨基丙烷(DLenDMA)。在一实施方式中，阳离子脂质是氨基脂质。在本发明中有用的适合的氨基脂质包括描述于WO 2009/096558的那些，其通过引用整体并入本文。代表氨基脂质包括1，2- _■亚油基氧基_3-( _■甲基氣基)乙酸氧基丙烧(DLin-DAC), 1, 2- _■亚油基氧基_3_吗啉代丙烷(DLin-MA)，1，2-二亚油酰-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)，1，2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)，1_亚油酰_2_亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP) ,1,2- _■亚油基氧基_3- 二甲基氣基丙烧氣化物盐(DLin-TMA Cl), I,2- 二亚油酰-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP Cl),I,2- 二亚油基氧基_3_(N_甲基哌嗪并)丙烷(DLin-MPZ)，3- (N，N- 二亚油基氨基)-I，2-丙二醇(DLinAP)，3- (N，N-二油基氨基)_1，2-丙二醇(DOAP)，1，2-二亚油基氧代-3 (2N，N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)和2，2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-DMA)。适合的氨基脂质包括具有下式的那些
权利要求
1.脂质粒子，其包含 (a)一种或更多阳离子脂质； (b)一种或更多第2脂质；以及 (C) 一种或更多核酸， 其中脂质粒子包含实体核心。
2.权利要求I的粒子，其中阳离子脂质是氨基脂质。
3.权利要求I或2的粒子，其中阳离子脂质选自DODAC，DOTMA,DDAB, DOTAP,DOTAP Cl, DC-Chol，DOSPA, DOGS, DOPE, DODAP, DODMA, DODMA 和 DMRIE。
4.权利要求I 3之任一项的粒子，其中阳离子脂质具有下式
5.权利要求I 4之任一项的粒子，其中阳离子脂质是二亚油基氨基脂质。
6.权利要求I 5之任一项的粒子，其中阳离子脂质是DLin-KC2-DMA。
7.权利要求I 6之任一项的粒子，其包含约30 约95摩尔百分率阳离子脂质。
8.权利要求I 7之任一项的粒子，其中第2脂质选自PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺，PEG-修饰的磷脂酸，PEG-修饰的神经酰胺，PEG-修饰的二烷基胺，PEG-修饰的二酰基甘油，PEG-修饰的二烷基甘油。
9.权利要求I 7之任一项的粒子，其中第2脂质选自PEG-c-D0MG，PEG-c-DMA和PEG-c-DMG。
10.权利要求I 7之任一项的粒子，其中第2脂质是PEG-c-DMA。
11.权利要求I 10之任一项的粒子，其中第2脂质是中性脂质。
12.权利要求I 7之任一项的粒子，其中第2脂质选自二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺，鞘磷脂，二氢鞘磷脂，脑磷脂和脑苷脂。
13.权利要求I 7之任一项的粒子，其中第2脂质是选自下列的中性脂质二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺，鞘磷脂，二氢鞘磷脂，脑磷脂和脑苷脂。
14.权利要求I 7之任一项的粒子，其中第2脂质是I，2-二硬脂酰-sn-甘油基_3_磷酸胆碱(DSPC)。
15.权利要求I 7之任一项的粒子，其中第2脂质是甾醇。
16.权利要求I 15之任一项的粒子，其包含约I 约10摩尔百分率第2脂质。
17.权利要求I 16之任一项的粒子，其中核酸是DNA，RNA,锁核酸，核酸类似物，或能表达DNA或RNA的质粒。
18.权利要求I 17之任一项的粒子，其中核酸是ssDNA或dsDNA。
19.权利要求I 17之任一项的粒子，其中核酸是siRNA或微RNA。
20.权利要求I 19之任一项的粒子，其中核酸是反义寡核苷酸。
21.脂质粒子，其包含 (a)一种或更多阳离子脂质； (b)中性脂质； (c)PEG-脂质； (d)甾醇；以及 (e)—种或更多核酸， 其中脂质粒子包含实体核心。
22.权利要求21的粒子，其中阳离子脂质是DLin-KC2-DMA。
23.权利要求21的粒子，其中PEG-脂质是PEG-c-DMA。
24.权利要求21的粒子，其中中性脂质是1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。
25.权利要求21的粒子，其中甾醇是胆甾醇。
26.权利要求21的粒子，其中核酸是siRNA。
27.脂质粒子，其由下列物质组成 (a)一种或更多阳离子脂质；以及 (b)一种或更多核酸， 其中脂质粒子包含实体核心。
28.权利要求21的粒子，其中阳离子脂质是DLin-KC2-DMA。
29.权利要求21的粒子，其中核酸是siRNA。
30.给受试者施用核酸的方法，包括给有需求的受试者施用权利要求I 29之任一项的脂质粒子。
31.将核酸导入细胞的方法，包括使细胞接触权利要求I 29之任一项的脂质粒子。
32.调节靶多核苷酸或多肽的表达的方法，包括使细胞接触权利要求I 29之任一项的脂质粒子，其中核酸能调节靶多核苷酸或多肽的表达。
33.治疗受试者中表征为多肽的过表达的疾病或病症的方法，包括给受试者施用权利要求I 29之任一项的脂质粒子，其中核酸能沉默或降低多肽表达。
34.制造含有核酸的脂质粒子的方法，包括 (a)将在第I溶剂中包含核酸的第I流导入微流体装置；其中装置具有适于将一个或更多流导流入装置的第I区和用于用微流体混合器混合一个或更多流的内容物的第2区； (b)将在第2溶剂中包含脂质粒子-形成物质的第2流导入装置以提供在层流条件下流动的第I和第2流，其中装置具有适于将一个或更多流导流入微通道的第I区和用于混合一个或更多流的内容物的第2区，其中脂质粒子-形成物质包含阳离子脂质，且其中第I和第2溶剂不相同；(C)使一个或更多第I流和一个或更多第2流从装置的第I区流入装置的第2区；以及 (d)在装置的第2区中混合在层流条件下流动的一个或更多第I流和一个或更多第2流的内容物以提供包含具有包裹的核酸的脂质纳米粒子的第3流。
35.制造含有核酸的脂质粒子的方法，包括 (a)将在第I溶剂中包含核酸的第I流导入通道；其中装置具有适于将一个或更多流导流入通道的第I区和用于混合一个或更多流的内容物的第2区； (b)导入在第2溶剂中包含脂质粒子-形成物质的第2流；其中通道具有适于将一个或更多流导流入通道的第I区和用于混合一个或更多流的内容物的第2区； (c)使一个或更多第I流和一个或更多第2流从通道的第I区流入通道的第2区，而维持2个流的物理隔离，其中一个或更多第I流和一个或更多第2流先不混合，直到到达通道的第2区后才混合；以及 (d)在微通道的第2区中混合在层流条件下流动的一个或更多第I流和一个或更多第2流的内容物以提供包含具有包裹的核酸的脂质纳米粒子的第3流。
36.权利要求34或35的方法，其中所述混合一个或更多第I流和一个或更多第2流的内容物包括改变一个或更多第I流和一个或更多第2流的浓度或相对混合速度。
37.权利要求34 36之任一项的方法，其还包括用水性缓冲剂稀释第3流。
38.权利要求37的方法，其中所述稀释第3流包括使第3流和水性缓冲剂流入第2混合结构。
39.权利要求34 38之任一项的方法，其还包括透析包含具有包裹的核酸的脂质粒子的水性缓冲剂以减少第2溶剂的量。
40.权利要求34 39之任一项的方法，其中第I溶剂是水性缓冲剂。
41.权利要求34 40之任一项的方法，其中第2溶剂是含水醇。
42.权利要求34 42之任一项的方法，其中核酸是DNA，RNA,锁核酸，核酸类似物，或能表达DNA或RNA的质粒。
43.权利要求34 42之任一项的方法，其中氨基脂质具有下式
44.权利要求34 43之任一项的方法，其中第2流还包含第2脂质。
45.权利要求34 44之任一项的方法，其中所述混合第I和第2流的内容物包括杂乱平流。
46.权利要求34 45之任一项的方法，其中所述混合第I和第2流的内容物包括用微混合器混合。
47.权利要求34 46之任一项的方法，其中核酸包裹效率是约90 约100%。
48.权利要求35的方法，其中一个或更多第I流和一个或更多第2流的混合在第I区中被屏障阻止。
49.权利要求48的方法，其中屏障是通道壁，鞘流体或同心管道。
50.脂质粒子，其通过权利要求34 49之任一项的方法制造。
51.产生包裹核酸的脂质粒子的装置，包括 (a)第I入口，其用于接收在第I溶剂中包含核酸的第I溶液； (b)第I入口微通道，其与第I入口流通连接以提供在第I溶剂中包含核酸的第I流； (c)第2入口，其用于接收在第2溶剂中包含脂质粒子-形成物质的第2溶液； (d)第2入口微通道，其与第2入口流通连接以提供在第2溶剂中包含脂质粒子-形成物质的第2流；以及 (e)第3微通道，其用于接收第I和第2流，其中第3微通道具有适于在层流条件下将第I和第2流导流入微通道的第I区和适于混合第I和第2流的内容物的第2区以提供包含具有包裹的核酸的脂质粒子的第3流。
52.权利要求51的装置，其还包含用于稀释第3流的设施以提供稀释的包含稳定化的具有包裹的核酸的脂质粒子的流。
53.权利要求51或52的装置，其中微通道具有约20 约300u m的水动力直径。
54.权利要求51 53之任一项的装置，其中微通道的第2区包含浅浮雕结构。
55.权利要求51 54之任一项的装置，其中微通道的第2区具有主流方向和一个或更多表面，所述表面具有至少一个限定于其中的凹槽或突起，凹槽或突起具有与主方向成角的取向。
56.权利要求51 55之任一项的装置，其中第2区包含微混合器。
57.权利要求51 56之任一项的装置，其还包含用于改变第I和第2流的流速的设施。
58.权利要求52 57之任一项的装置，其中用于稀释第3流的设施包含微混合器。
59.权利要求52 58之任一项的装置，其还在第I区中包含对于物理隔离一个或更多第I流与一个或更多第2流有效的屏障。
全文摘要
本发明提供使用微流体混合装置制备包含阳离子脂质DLinKC2-DMA的核酸-脂质纳米粒子的方法，其中得到核酸-脂质纳米粒子相比在常规进行的囊泡方法中产生的相同的制剂的核酸-脂质纳米粒子呈现更小粒径和更大核心密度。
文档编号C12N15/88GK102712935SQ201080059999
公开日2012年10月3日 申请日期2010年11月4日 优先权日2009年11月4日
发明者A·勒恩格, A·维尔德, C·L·G·汉森, D·沃克, I·哈弗兹, J·泰勒, J·胡弗特, N·M·贝利维奥, P·R·库里斯, S·马尔克姆 申请人:不列颠哥伦比亚大学