专利名称：一种含hsya和iqba的红花的筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物科学技术领域，具体涉及一种含两种有效成分羟基红花黄色素A 和4- {11，-羟基-11，-巯基-11，- {1，- [2，- (N — 0)-异喹啉基]} 苯甲酸的红花的筛选方法。
背景技术：
红花Carthmus tmctorius L.为菊科植物红花的干燥管状花，临床应用广泛。主要化学成分有黄酮类、吲哚类、木脂素类、烷基二醇类等。其中羟基红花黄色素 A(Hydroxysafflor yellow A，简称HSYA)是红花的重要活性成分，具有抗心肌缺血、脑缺血、抑制血小板聚集、抗氧化等多种药理作用，对心脑血管疾病有很好的防治作用，具有很好的应用前景(吴伟，李金荣，朴永哲，董宁宁，金鸣.羟基红花黄色素A缓解大鼠心肌线粒体损伤的作用研究.中国药学杂志，2006,41(16) :1225-1227 ；金鸣，高子淳，王继峰.羟基红花黄色素A抑制PAF诱发的家兔血小板活化的研究.北京中医药大学学报，2004，27 (5) 32;金呜，李金荣，吴伟.羟基红花黄色素A抗氧化作用的研究.中草药，2004，35 (6) :665; 施峰，刘焱文，红花的化学成分及药理研究进展，时珍国医国药，2006，17 (9) :1666-1667)； 4-{11，-羟基-11，-巯基-11，-{1，-[2，-(N —0)-异喹啉基]}-1-苯甲酸(简称 IQBA) 是本发明人从中药红花中研究获得的又一个具有脑缺血保护作用的化合物(Ge Zhang, Mei-Li Guo, Run-Ping Li, Ying Li, Han-Ming Zhang, Zhong-Wu Su. A NOVEL COMPOUND FROM FlosCarthami AND ITS BI0ACTIVITY. Chemistry of Natural Compounds. 2009,45 339-341)。因此，红花中HSYA和IQBA含量的高低，直接影响红花品质的优劣。对红花品质相关功能基因进行研究，对提高红花的产量和质量具有重要意义。前期研究工作，本发明人应用cDNA-AFLP技术结合BSA法对含与不含羟基红花黄色素A的红花进行差异表达分析，发明了一种筛选含羟基红花黄色素A的红花品种的方法已获得中国专利(中国专利ZL 200810037322. 8，发明创造名称一种含羟基红花黄色素A 的红花的筛选方法)。为了更有效地筛选含有效成分种类多的红花，本发明人继续进行研究，发明了另一种筛选含两种有效成分HSYA和IQBA的红花的新方法。
发明内容
本发明目的是提供一种含HSYA和IQBA的的红花的筛选方法。本发明应用cDNA-AFLP技术结合BSA法对含与不含HSYA和IQBA的红花进行差异表达分析，在红花中找到与HSYA和IQBA紧密连锁的1条基因，该基因具有如SEQ ID No. 1 所示的核苷酸序列。具体方法如下本发明以含HSYA和IQBA的红花品系No. 16为母本，不含HSYA和IQBA的红花 No. 25为父本进行杂交，获得Fl代种子，Fl代种子进行自交加代获得的F2种子，继续种植， 从单粒F2种子获得F2代群体共计215个单株。然后进行以下步骤1.根据F2代群体的HSYA和IQBA的含量有无，取等量含HSYA和IQBA的F2代个体的花冠混成有池，另取不含HSYA和IQBA的F2代个体的花冠混成无池；2.提取红花总RNA，反转录成双链cDNA ；3.通过cDNA-AFLP对含有HSYA和IQBA与不含HSYA和IQBA的红花的差异表达分析，在I^stl-CT/Msel-AG的引物组合中获得TDF-I —条片段；4.对该条片段进行回收，克隆和测序。TDF-I具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。本发明提供了一种含HSYA和IQBA的红花的筛选方法，该方法是用cDNA序列分析方法鉴定红花基因中含有如SEQ ID No. 1所示的一个核苷酸序列。上述序列分析方法包括RT-PCR方法、Northerning Bloting法以及cDNA末端快速扩增(RACE)法等。上述方法包括以下步骤A、根据TDF-I (SEQ ID No. 1)序列设计并合成RT-PCR引物，TDF-I 引物5，-CTTGCAGCCCGATGTGA-3，5， -CACCATAATAAGCCACCT-3，B、提取红花的总RNA;C、以红花总RNA为模板，翻转录成第一链cDNA ；D、以第一链cDNA为模板加入合成的引物，进行PCR扩增；E、琼脂糖电泳，紫外显色；F、测序。在含HSYA和IQBA的红花中得到与SEQ ID No. 1相同序列基因，而在不含HSYA和 IQBA的红花中未得到，证明cDNA-AFLP实验的可靠性。按照上述筛选含HSYA和IQBA的红花的方法，在含HSYA和IQBA的红花品种和不含HSYA和IQBA的红花品种共18个不同红花品种之间应用此方法，均发现在含有HSYA和 IQBA的红花中有与TDF-I相同的基因片段，而在不含HSYA和IQBA的红花中不存在。本发明为筛选含HSYA和IQBA的红花品种提供新方法，进而为实现红花高品质性状的定向调控奠定基础。
图1 红花cDNA-AFLP差异表达的银染结果。其中箭头代表TDF-I ；M =DL 2000 DNA相对分子标记；1 不含HSYA池；2 含HSYA 池；3 父本；4-7 不含HSYA和IQBA的F2代单株；8 母本；9-21 含HSYA和IQBA的F2代单株；引物:PstI-CT/MseI-AG图2 :cDNA-AFLP差异表达片段在RT-PCR的验证结果。其中1-5 不含HSYA和IQBA的F2代单株；6-10 含HSYA和IQBA的F2代单株
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。实施例1 本发明TDF-I片段的分离1.应用高效液相色谱方法、薄层色谱法及紫外分光光度法测定F2代群体的HSYA和IQBA的含量，检测其有无。2.根据测定结果各取含与不含HSYA和IQBA的红花花冠，提取总RNA，并转化成双链 cDNA。3.构建含与不含HSYA和IQBA的近等基因池，取含HSYA和IQBA单株的cDNA各 1 μ g，共10株混成有池；另取不含HSYA和IQBA的cDNA单株各1 μ g共10株混成无池。4. cDNA-AFLP差异表达分析(1)限制性酶切与接头连接采用I3StI和MseI两种限制性内切酶对cDNA双酶切， 酶切时间37°C 6h ；然后用T4DNA连接酶将I^stI和MseI接头与酶切片段连接，16°C 12h。(2)片段的预扩增本研究用连接产物做模板，采用预扩增引物组合Pck/M^G' -G ACTGCGTACATGCAG-3 ‘ /5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAA-3 ‘)。对连接产物稀释 10 倍。在 Biometra PTC-200 型 PCR 仪上按以下程序扩增:94°C 3min,94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin，30 个循环； 72°C 5min ；4°C保温。预扩增产物在1. 5%琼脂糖凝胶上检测，-20°C保存备用。(3)选择性扩增采用选择性扩增引物组合P+nn/M+nn(5 ‘ -GACTGCGTACATGCAGNN-3 ‘/5' -GATGAGTCCTGAGTAANN-3 ‘ (N 代表 ACGT，N 代表 ACGT 任意一种，P1-P16 共 16 条引物，M1-M16共16条引物))，对预扩产物稀释150倍。选扩反应体系根据Bachem等体系作略微调整。扩增程序94°C 3min，94°C 30s,65°C 30s每循环降低0. 7°C，72°C Imin 12个循环，94°C 30s，退火温度56°C 30s。72°C Imin 30个循环，72°C IOmin ；4°C保温。扩增产物在 1. 5%琼脂糖检测，-20°C保存备用。(4) cDNA-AFLP扩增产物的电泳按30V/em的电压进行30min预电泳。扩增产物 溴酚兰8 3混合，95°C变性8min，立即冰浴。去除在预电泳时扩散出来的尿素后加样， 1800V电泳，恒压。(5)银染检测固定胶将胶浸在固定液中振荡20min至电泳染料颜色消失。用超纯水洗胶三次，每次8min。染色30min。将胶浸入超纯水中、取出浙水、立即放入盛有预冷显色液显色胶在摇床上摇动至出现模板带或可见第一条带。将胶转至剩余的1升预冷的显色液中，继续显色3-5min或至全部条带显现出来。加入1升固定/终止溶液，在摇床上反应2-aiiin，终止显色反应。用超纯水漂洗聚丙烯酰胺凝胶两次，每次5min，室温放置干胶， 如图1所示。5. TDF-I的分离克隆和测序引物Pstl-CT/Msel-AG筛选得到1条特异性片段 TDF-1，从PAGE胶上回收多态性TDF片段，并以此片段为模板作PCR，琼脂糖扩增产物采用 Watson小量胶回收试剂盒进行回收，回收多态性片段连接至PMD-18T vector中，并转化 E. coli DH5ci。通过氨苄抗性筛选转化子，挑选阳性克隆，将阳性克隆扩倍后送往htrogen 公司测序，测得序列为bp，如SEQ ID No. 1所示。SEQ ID No. 1(TDF-1)136bpCGGCGGCCGGATTTGAAGTGGAGAAACGGGTGGTAACAAGATCTTGCAGCCGATGTGAGCAGAAGGTGGCTTATTATGGTGGCGGGCGTTCATCGCTGGCGATATACAAGCCGGCAATGCTGTCAATGGTGGCAAT实施例2 RT-PCR对TDF-1基因表达验证A、根据TDF-1 (SEQ ID No. 1)序列设计并合成RT-PCR引物，5，-CTTGCAGCCCGATGTGA-3，(SEQ ID No. 2)
5，-CACCATAATAAGCCACCT-3，(SEQ ID No. 3)B、提取吉木萨尔红花的总RNA ；C、以红花总RNA为模板，翻转录成第一链cDNA ；D、以第一链cDNA为模板，加入合成的引物，进行PCR扩增；E、琼脂糖电泳，紫外显色。F、测序。在含HSYA和IQBA的红花中得到与SEQ ID No. 1相同序列基因，而在不含HSYA和 IQBA红花中未得到，证明cDNA-AFLP实验的可靠性，如图2所示。实施例3 本筛选方法的应用1.分别提取各产地含与不含HSYA和IQBA的红花总RNA，转成双链cDNA。2.应用Pstl-CT/Msel-AG引物组合，用实施1的方法对含有HSYA和IQBA与不含 HSYA和IQBA的红花进行cDNA-AFLP差异表达分析，在哈密红花，吉木萨尔红花，昌吉红花， 新乡红花，菏泽红花，毫州红花，简阳红花，开封红花，郑州红花，成都红花，微山红花，酒泉红花，昆明红花中获得1条特异性片段，而若羌红花，塔城红花，乌鲁木齐红花，清徐红花， 海南红花中未获得。3.含有该条特异性片段的上述红花品种经用高效液相方法测定，均含HSYA和 IQBA ；而不含上述该条片段的品种，均不含HSYA和IQBA。4.对该条片段进行回收，克隆和测序，均与TDF-I序列相同。5.用实施2的方法进行RT-PCR验证，发现在含有HSYA和IQBA的红花品种如哈密红花，吉木萨尔红花，昌吉红花，新乡红花，菏泽红花，毫州红花，简阳红花，开封红花，郑州红花，成都红花，微山红花，酒泉红花，昆明红花中存在，而不含HSYA和IQBA的红花品种如若羌红花，塔城红花，乌鲁木齐红花，清徐红花，海南红花中不存在。
权利要求
1.一种含羟基红花黄色素A和4-{11，_羟基-11，-巯基-11，-{1，-[2，-(N—0)-异喹啉基]}-1-苯甲酸的红花的筛选方法，其特征在于该方法是用CDNA序列分析方法鉴定红花基因中含有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种含羟基红花黄色素A和4-{11’-羟基-11’ -巯基-11’-{1’-[2’-(N — 0)-异喹啉基]}-1_苯甲酸的红花的筛选方法，其特征在于其中的 cDNA序列分析方法是RT-PCR方法、Northerning Bloting法或cDNA末端快速扩增法。
3.根据权利要求1或2所述的一种含羟基红花黄色素A和4-{11’-羟基-11’ -巯基-11’-{1’-[2’-(N—0)-异喹啉基]}-1_苯甲酸的红花的筛选方法，其特征在于该方法包括以下步骤A、设计并合成下述RT-PCR引物；5' -CTTGCAGCCCGATGTGA-3‘5' -CACCATAATAAGCCACCT-3‘B、提取红花的总RNA；C、以红花总RNA为模板，翻转录成第一链cDNA；D、以第一链cDNA为模板加入合成的引物，进行PCR扩增；E、琼脂糖电泳，紫外显色；F、测序。
全文摘要
本发明涉及生物科学技术领域，由于红花的两种有效成分羟基红花黄色素A(HSYA)和4-{11’-羟基-11’-巯基-11’-{1’-[2’-(N→O)-异喹啉基]}-1-苯甲酸(IQBA)含量的高低，直接影响红花品质。本发明采用cDNA-AFLP对两者的表达特性进行分析，分离与两种有效成分HSYA和IQBA密切相关的差异表达基因，通过RT-PCR进一步验证其特征基因型及cDNA-AFLP方法的正确性。本发明获得的特异性DNA片段具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。本发明将上述特异性DNA片段用于筛选含两种有效成分HSYA和IQBA的红花品种，进而为实现红花高品质性状的定向调控提供良好条件。
文档编号C12Q1/68GK102154463SQ201110003520
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月10日 优先权日2011年1月10日
发明者刘宏艳, 王章建, 郭美丽 申请人:中国人民解放军第二军医大学