专利名称：一种深海适冷耐盐胶原蛋白酶及其编码基因myr02与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种深海适冷耐盐胶原蛋白酶及其编码基因myr02与应用，属于生物技术技术领域。
背景技术：
胶原蛋白(collagen)广泛分布于动物的皮肤、骨骼、牙齿及血管等组织，是胞外基质的主要构成成分。它具有独特的三螺旋结构，很难被一般的蛋白酶水解，只能被胶原蛋白酶水解。胶原蛋白酶(collagenase)，也简称为胶原酶，是一种以水解不溶性胶原蛋白为特征的蛋白水解酶，在多个蛋白酶家族，如丝氨酸蛋白酶家族和金属蛋白酶家族中均有存在。目前，胶原蛋白酶在医疗及工业等各方面都有很好的应用价值。在医疗方面，胶原蛋白酶可使创口边缘胶原纤维降解，具有较好的清创作用，继而促使肉芽生长，上皮化，加快伤口愈合且对正常血管和神经组织无损伤作用。在临床上主要用于严重(II-III度)烧伤的清创、脱痂和植皮，亦可用于皮肤溃疡、褥疮等，治疗确切，安全可靠。另外，胶原蛋白酶也被广泛的应用于皮革工业的脱毛及软化过程，代替了传统的浸灰方法，既节省时间，又改善劳动卫生条件，且对环境危害小。同时，胶原蛋白酶还被广泛应用于蚕丝脱胶，肉类嫩化及酒类澄清等过程。目前已研究的胶原蛋白酶以动物基质金属蛋白酶(MMPs)为主，细菌产生的较少。 最早进行研究的微生物来源胶原酶是溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶，现已有临床应用。细菌来源胶原酶不同于动物胶原酶主要在于(1)底物种类不同微生物胶原酶底物范围更为广泛，对动物胶原酶不能降解的iv、v型胶原也能轻易降解；(2)裂解方式不同一般微生物胶原酶可作用于胶原的多个位点，产生小分子短肽或氨基酸，而动物胶原酶只作用于胶原N 端3/4处Gly-Lue或Gly-Ile肽键，产生一个3/4片段和1/4片段，分别命名为TCA和TCB ；
(3)获得的难易不同微生物胶原酶绝大多数可分泌到胞外，通过发酵培养可大量获得，而动物胶原酶需组织培养和提取，较难获得；(4)潜在的降解胶原能力不同微生物胶原酶具有更高的活性。因而，微生物来源的胶原酶具有更广的应用范围。目前，微生物胶原蛋白酶的相关研究较少，且已报道的几种细菌胶原酶多伴随有毒素的产生，限制了其应用。同时， 由于受到采样及培养条件限制，目前海洋来源的胶原蛋白酶相关报道还很少，值得深入探由于胶原蛋白是水不溶性蛋白，在海洋中大部分沉积于海底沉积物中，因此，深海沉积物是分离海洋细菌胶原酶的好材料，但由于受到采样及培养等困难的限制，目前深海来源的胶原蛋白酶还很少。来源于深海细菌的胶原蛋白酶由于经过对海底低温，弱碱和高盐环境长期的适应和进化，具有在低温下活性高、PH耐受范围广、耐高盐浓度等优点，而且由于其所处环境独特，还可能具有新的胶原蛋白降解机制，因而深海来源的胶原蛋白酶可能在医药、食品、化妆品和化工等领域具有广阔的应用前景
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种深海适冷耐盐胶原蛋白酶及其编码基因 myr02与应用。说明书中的术语解释PCR技术链式聚合酶反应，利用DNA聚合酶，模板，引物以及dNTP进行体外扩增特定DNA片段的技术。Tail PCR技术热不对称链式聚合酶反应，使用两种不同长度的引物，从而使两种引物的退火温度不同。长引物是以已知序列设计的三个嵌套引物，退火温度58-63°C，短引物是任意简并引物，可与DNA随机结合，退火温度47-48°C。PCR温度循环的每一个循环包括两个高温退火反应，这时只有长引物退火并延伸；一次低温退火反应，这时两种引物同时退火并扩增。CDD分析软件NCBI网站上提供的一种用来推测和分析特定氨基酸序列形成的结构域信息的软件。本发明技术方案如下一种深海适冷耐盐胶原蛋白酶基因myr02，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。胶原蛋白酶的基因myr02是从适冷菌(Myroides profundi)D25提取的基因组DNA 中克隆得到的。适冷菌(Myroides profundi)D25分离自日本南部冲绳槽海底沉积物，该菌株在2008年7月13日保存于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，菌种保藏号CCTCC NO. M 208030。该菌株生物学特征详见文献Myroidesprofundi sp. nov., isolatedfrom deep-sea sediment of the southern Okinawa Trough. (Xi-Ying Zhang et al.，2008，FEMSMicrobiol Lett, 287 :108-102)。一种含有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的表达载体。含有上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或上述表达载体的重组细胞。上述胶原蛋白酶基因myr02编码的胶原蛋白酶myr02，其氨基酸序列SEQ ID N0. 12所示。本发明首先分离纯化了Myroides profundi D25所产的胶原蛋白酶myr02，测定了该酶的N端序列。根据其N端序列和丝氨酸蛋白酶保守基因序列设计引物，利用PCR和Tail PCR技术从Myroides profundi D25的基因组DNA中克隆了编码胶原蛋白酶myr02的基因。 对该基因的核酸序列进行了测定。测序结果表明获得的DNA片段中含有一个具有2040个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架即是编码胶原蛋白酶myr02的基因myr02，共编码 679个氨基酸。利用CDD分析软件对根据基因序列推导的氨基酸序列进行分析表明，胶原蛋白酶myr02前体的结构包括信号肽、前导肽，催化结构域以及C端结构域四个部分。胶原蛋白酶myr02的前体是一个含有679个氨基酸的多肽。胶原蛋白酶mry02的前体结构包括信号肽，前导肽，催化结构域及C端结构域四部分。成熟酶含有584个氨基酸， 是丝氨酸蛋白酶S8家族中的一个尚未报道的具有新的序列的胶原蛋白酶。上述胶原蛋白酶的基因myr02中核苷酸与编码氨基酸对应关系如图7所示，起始密码子用方框标示；信号肽、前导肽及成熟酶切割位点用箭头标示。本发明将菌株Myroides profundiD25分泌的一种胶原蛋白酶命名为myr02，该蛋白酶的基因命名为myr02。对纯化的胶原蛋白酶myr02进行性质测定。结果表明该酶对胶原蛋白具有很强的降解活性。最适酶活温度为601，最适？!1为8.5。耐盐性强。因此，胶原蛋白酶myr02是一个具有新型胶原蛋白降解机制的S8家族蛋白酶。上述胶原蛋白酶基因myr02和/或胶原蛋白酶myr02在降解不可溶性胶原蛋白方面的应用。有益效果1、本发明所述的胶原蛋白酶myr02具有低温高盐条件下高活性的特点；该酶在 0°c仍保持10%的酶活性；在4M NaCl中具有50%的酶活性；2、本发明所述的胶原蛋白酶myr02可降解不溶性I型胶原蛋白，同时对明胶等可溶性底物也有较高活性，具有较好的适冷性和耐盐性；3、本发明所述的胶原蛋白酶myr02不仅可应用于医疗，日化等方面，在海洋生物医药、水产品加工等方面也具有重要的应用潜力；4、本发明还提供一株用于制备基因myr02的由日本南部冲绳槽海底沉积物中分离得到的适冷菌(Myroides profundi) D25。
图1.提取的适冷菌(Myroides profundi)D25的基因组DNA的电泳图；M =DNA分 ^fi marker ；1 :3^7^ (Myroides profundi) D25 ^ ^^! DNA ；图2. PCR扩增得到myr02的完整基因；M =DNA分子量marker ；1 基因 myr02(2040bp)；图3.纯化的胶原蛋白酶myr02 ；M :marker ；A 经阴离子层析柱纯化后的胶原蛋白酶myr02 ；B 经分子筛G75纯化的myr02 (红色箭头所示)；图4.胶原蛋白酶myr02的最适酶活温度；图5.胶原蛋白酶myr02的最适pH ；图6.胶原蛋白酶myr02的耐盐性；图7.胶原蛋白酶基因myr02核苷酸与其编码氨基酸对应关系图；图中，起始密码子用方框标示；信号肽、前导肽及成熟酶切割位点用箭头标示。
具体实施例方式实施例中的适冷菌(Myroides profundi)D25，该菌株在2008年7月13日保存于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，菌种保藏号CCTCC NO. M 208030。实施例1一株适冷菌(Myroides profundi)D25，该菌株在2008年7月13日保存于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，菌种保藏号CCTCC NO. M 208030。实施例2上述适冷菌(Myroides profundi)D25提取的胶原蛋白酶基因myr02，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。上述胶原蛋白酶基因myr02编码的胶原蛋白酶myr02，其氨基酸序列SEQ ID N0. 12所示。胶原蛋白酶基因myr02包含有一个2040bp的开放阅读框架编码胶原蛋白酶 myr02，起始密码子位于lbp，终止密码子位于2038bp，共编码679个氨基酸。该基因中核苷酸与编码氨基酸对应关系如图7所示。胶原蛋白酶基因myr02的制备方法如下1.胶原蛋白酶myr02编码基因的克隆1. 1适冷菌(Myroides profundi) D25基因组DNA的提取，参照百泰克公司基因组提取试剂盒说明书(1)取 Iml 适冷菌(Myroides profundi) D25 菌液，IOOOOrpm 离心 30sec，弃上清， 收集菌体，尽可能的吸净上清；(2)向步骤(1)制得的菌体中加入200 μ 1缓冲液RB重悬洗涤细胞，IOOOOrpm离心30seC，弃上清后将细胞震荡或者吹打重悬于200 μ 1缓冲液RB中，得重悬液；(3)向步骤( 制得的重悬液中加入200 μ 1结合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇充分混勻，再加入20 μ 1蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混勻，70°C放置IOmin ；(4)冷却后加入100μ 1的异丙醇，剧烈颠倒轻摇充分混勻，得溶液，此时可能出现絮状沉淀；(5)将步骤(4)制得的溶液和絮状沉淀都加入吸附柱AC中，IOOOOrpm离心30sec， 倒掉收集管中的废液；(6)加入500 μ 1抑制物去除液IR, 12，OOOrpm离心30sec,弃废液；(7)加入700 μ 1漂洗液WB, 12，OOOrpm离心30sec,弃掉废液；(8)加入500 μ 1漂洗液WB, 12，OOOrpm离心30sec,弃掉废液；(9)将吸附柱AC放回空收集管中，13，OOOrpm离心aiiin，尽量出去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；(10)取出吸附柱AC放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μ 1洗脱缓冲液EB (洗脱缓冲液事先在65-70°C水浴中预热)，室温放置3-5min，12，OOOrpm离心 Imin ；将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12，OOOrpm离心Imin ；(Il)DNA置于4°C冰箱保存。1.2引物设计与合成根据myr02的成熟酶N端序列NYGSRLTARVNAIQK设计三条兼并引物SPl TAYGGNAGYCGNCTNGGNGC(SEQ ID N0. 2)，SP2 :CGNCTNGGNGCNCGNGTNAA(SEQ ID NO. 3), SP3 NCGNGTNAAYGCNATHCARAAR (SEQ ID NO. 4)，再根据丝氨酸蛋白酶S8家族保守序列设计C端引物M2 =CRTGNGGNGYNGCCATNSffNGTNCC(SEQ ID N0. 5)，由上海生工生物技术公司合成。1. 3利用PCR进行基因序列扩增(1)分别以SP1，SP2，SP3和M2为引物，以基因组DNA为模板，做PCR扩增。PCR反应条件为95°C，5分钟；然后95°C，1分钟；55°C，1分钟；72°C，2分钟，30个循环后，72°C， 延伸10分钟；(2)对PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，结果表明以SP3和M2为引物扩增获得一条约900bp的DNA片段，然后用OMEGA公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增 DNA片段。2.基因序列测定(I)DNA片段与克隆载体连接将回收DNA片段连接到TaKaRa公司的pMD_18T载体上，连接反应体系
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外源DNA片段 4 μ 1盖紧盖子，手指轻弹离心管，混勻样品，在离心机上转2sec，把样品集中在管底， 15°C过夜连接；(2)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5 α感受态；(3)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组载体转至大肠杆菌 DH5 α感受态；(4)转化的大肠杆菌DH5 α涂布于含100 μ g/mL氨苄青霉素的麦康凯培养基，37°C 过夜培养，挑选白色转化子接种于LB培养基，37°C培养后取Iml提取质粒验证；( 将质粒含有PCR扩增的DNA片段的转化子送上海生工生物技术有限公司测序， 因此，获得一段841bp的序列。3. Tail PCR继续进行序列扩增根据已得序列设计三轮嵌套引物SUl GCCATTTGTCCCATCTTGCG, (SEQ ID NO. 6)SU2 CGACTCTTTTGATACCCTTTAG, (SEQ ID NO. 7)SU3 :CGAGAGTAACCTTAGGAGAGTC。(SEQ ID NO. 8)SDl TGTATTATCAGCGGCTTATCG, (SEQ ID NO. 9)SD2 GAGTAAGATAGTGGTGACGTTGG, (SEQ ID NO. 10)SD3 :GAGCGATCCAAGGAGTCAATG。(SEQ ID NO. 11)另外再设计两条随机兼并引物N :AAKYRTATG、C :GCAGCGTTA。对于已得片段N端方向的未知序列，先以SUl和N为引物，以基因组为模板，进行第一轮PCR，条件为94°C，30秒钟，53 °C，1分钟；72 °C，2分钟，5个循环后，94°C，30秒钟，观°C，3分钟，72 °C，2分钟，94°C， 20秒钟，40°C，1分钟，72°C，2分钟，10个循环后，94°C，20秒钟，53°C，1分钟，72°C，2分钟， 940C，20 秒钟，53°C，1 分钟，72°C，2 分钟，94°C，30 秒钟，40°C，1 分钟，72°C，2 分钟，12 个循环后72°C延伸10分钟。然后将所得PCR产物作为模板以SU2和N为引物进行第二轮PCR，条件为94°C，20 秒钟，55°C，1 分钟，72°C，2 分钟，94°C，20 秒钟，55°C，1 分钟，72°C，2 分钟，94°C，20 秒钟， 40°C，1. 5分钟，72°C，2分钟，16个循环后，72°C，延伸10分钟。再以第二轮PCR产物为模板，以SU3和N为模板进行第三轮PCR，条件为94°C，30 秒钟，55 °C，1分钟；72 °C，2分钟，25个循环后，72 °C，延伸10分钟。对第三轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，发现获得一条900bp左右的条带。对已知序列C端方向的未知序列用相同方法进行PCR扩增。结果出现一条650bp左右的条带。 后用2中相同方法进行测序并进行拼接。通过NCBI网站的blastX软件分析发现其中含有一个2040bp的编码胶原酶myr02的开放阅读框架。起始密码子位于lbp，终止密码子位于 2038bp，共编码679个氨基酸。胶原蛋白酶myr02的完整基因序列及其编码的氨基酸序列如图7所示。 实施例3 胶原蛋白酶myr02的纯化
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适冷菌(Myroides profundi)D25接种于发酵培养基(人工海水中含0. 2%酵母粉，明胶，pH8. 5)，在15°C，200rpm培养84h。发酵液在4°C，IOOOOg离心IOmin0收集上清液进行55%硫酸铵沉淀，过夜静置，4°C，IOOOOg离心IOmin收集沉淀，用50mM Tris-HCl 缓冲液(pH 9. 5)重溶并过夜透析脱盐后4°C，IOOOOg离心15min。上清液以0. 4ml/min速度穿过DEAE-kpharose Fast Flow层析柱后用0_0. 8M NaCl进行梯度洗脱。收集洗脱后的活性部分，浓缩后过supherdex G75进一步分离纯化。纯化后的蛋白酶用7. 5% SDS-PAGE 检测纯度(图3)实施例4 胶原蛋白酶myr02的性质测定4. 1最适酶活温度分别在0、10、20、30、40、50、60、70、80、90°C条件下测定胶原蛋白酶myr02的酶活， 以确定酶的最适反应温度。测定酶活的具体方法为称取5mg的胶原蛋白加入Iml浓度约为20 μ g/ml的myr02酶液，不同温度条件下反应5h，IOOOOg离心IOmin终止反应。取20 μ 1上清加入100 μ 1茚三酮-柠檬酸钠混合液，沸水浴反应20min，冷却后加入500 μ 1正丙醇，混勻显色。取200 μ 1上清于600nm处测定吸光值。结果表明该酶的最适酶活温度为60°C (如图4)。4. 2 最适 pH分别在ρΗ6.0、7· 0、7· 5、8· 0、8· 5、9· 0、9· 5、10. 00 条件下测定胶原蛋白酶myr02 的酶活，以确定该酶的最适pH。缓冲体系为50mmol/L Tris-HCl缓冲液。具体方法是按照4. 1中的方法在60°C下测定胶原蛋白酶myr02在上述不同pH缓冲液中的酶活。结果表明该酶的最适pH为8.5(如图5)。4. 3耐盐性在pH8.5,50mmol/L Tris-HCl 缓冲液中加入NaCl 至终浓度为 0. 5，1，2，3，4M，按照 4. 1中的方法在60°C测定胶原蛋白酶myr02的酶活，以确定该酶的耐盐性。结果表明该酶耐盐性强，在4 M NaCl中仍然保持50%的活性(如图6)。结果利用试剂盒提取了适冷菌(Myroides profundi)D25的基因组DNA(图1)。根据数据库中已有的该蛋白酶家族的保守区设计引物序列，以基因组DNA为模板，通过PCR以及 TailPCR方式扩增得到编码胶原蛋白酶myr02的基因DNA片段(图2、经过测序获得编码胶原蛋白酶myr02的基因myr02的核酸序列。其基因含有一个2040bp的开放阅读框架编码胶原蛋白酶myr02，起始密码子位于lbp，终止密码子位于2038bp，共编码679个氨基酸。利用NCBI网站的CDD软件分析胶原蛋白酶myr02的结构，发现胶原蛋白酶myr02的前体的结构至少包括信号肽，前导肽、催化结构域以及C端功能未知结构域四个部分。成熟酶myr02 含有585个氨基酸，是丝氨酸蛋白酶S8家族中的一个尚未报道的具有新的序列的酶。该酶对胶原蛋白有很高活性。最适酶活温度为60°C，在0°C仍然能保持10%以上的酶活(图 4)，最适pH为8.5(图5)，耐盐性强，4M NaCl中可保持50%以上的活性(图6)。因此，基因myr02编码的胶原蛋白酶myr02是一个新型适冷胶原蛋白酶。
权利要求
1.一种深海适冷耐盐胶原蛋白酶基因myr02，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种含有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的表达载体。
3.含有权利要求1所述SEQID No. 1所示核苷酸序列或权利要求2所述表达载体的重组细胞。
4.权利要求1所述胶原蛋白酶基因myr02编码的胶原蛋白酶myr02，其氨基酸序列SEQ IDN0. 12 所示。
5.如权利要求1所述胶原蛋白酶基因myr02和/或权利要求2所述胶原蛋白酶myr02 在降解不可溶性胶原蛋白方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种深海适冷耐盐胶原蛋白酶及其编码基因myr02与应用，属于生物技术领域。一种深海适冷耐盐胶原蛋白酶基因myr02，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。胶原蛋白酶基因myr02编码的胶原蛋白酶myr02，其氨基酸序列SEQ ID NO.12所示。本发明所述的胶原蛋白酶myr02可降解不溶性I型胶原蛋白，同时对明胶等可溶性底物也有较高活性，具有较好的适冷性和耐盐性。
文档编号C12N15/57GK102174548SQ201110048859
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月1日 优先权日2011年3月1日
发明者何海伦, 冉丽媛, 周明扬, 周百成, 张熙颖, 张玉忠, 石梅, 解彬彬, 陈秀兰 申请人:山东大学