生产重组胰蛋白酶的方法

专利名称：生产重组胰蛋白酶的方法
技术领域：
本发明涉及重组生产胰蛋白酶的方法。为此目的，优选使具有缩短的前肽序列的胰蛋白酶原在重组的宿主细胞内表达并以未切割的形式分泌到培养基中。随后进行经控制的前肽切割以形成活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，该酶催化在碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸的羧基基团上进行肽的水解切割(Keil B.，1971)。来自牛胰的胰蛋白酶是最早可以以纯的形式和足够的量用于提取化学和酶的研究的蛋白水解酶之一(Northrop等人，1948)。随后可归类于胰蛋白酶家族的蛋白酶也可以从其他高等脊椎动物中分离(猪-Charles等人，1963/绵羊-Bricteux-Gregoire等人(1966)；Travis(1968)/火鸡-Ryan(1965)/人-Travis等人(1969)等)。当时也在两个链霉菌(streptomyces)物种中分离了第一个属于胰蛋白酶家族的酶(Morihara和Tsuzuki(1968)；Trop和Birk(1968)；W_hlby和Engstr_m(1968)；W_hlby(1968)；Jurasek等人(1969))。
该酶是作为无活性的前体(胰蛋白酶原)在脊椎动物的胰细胞中合成的，并随后通过对前肽的切割而转变为活性形式(Northrop等人(1948)；Desnuelle(1959))。第一个胰蛋白酶原分子是以天然的方式通过在(Asp4)-Lys-↓-Ile间水解肽键从而切除前肽的肠肽酶肠激酶来活化的(Keil(1971))。肠激酶(Asp4)-Lys的识别序列在几乎所有的以前已知的胰蛋白酶原分子中直接位于前肽的C-末端(Light等人(1980))。活化反应也可在生理pH值下自身催化地进行，这是因为有一个赖氨酸位于肠激酶的识别序列的C-末端侧，因此Lys-↓-Ile肽键水解也可通过胰蛋白酶进行(Light等人(1980))。
胰蛋白酶由于其易于从多种哺乳动物获得、高的特异性(仅在赖氨酸或精氨酸的C-末端进行切割)和高的特异活性(～150U/mg)以及其良好的贮藏稳定性，所以始终是生物技术应用中有价值的蛋白酶。胰蛋白酶主要用于将肽用胰蛋白酶切割为用于测序的小段、用于使贴壁细胞从被覆盖的细胞培养物皿上脱离及用于将融合蛋白质切割为目标肽和融合成分、用于活化前肽(如胰蛋白酶原到胰蛋白酶)及用于肽激素的重组生产(如前胰岛素到胰岛素，在此参见WO 99/10503)。胰蛋白酶也是一些药物制剂的成分(药膏、糖衣丸和用于吸入的气雾剂(Rote Liste，1997；The United States Pharmacopeia，The NationalFormulary，USP23-NF18，1995))。由于动物来源的酶的使用在许多情况下(潜在的感染因素的污染)已经不再被允许，对于想要的生物技术应用必须提供来自微生物宿主的重组胰蛋白酶。
已知有几种从不同的生物中重组生产胰蛋白酶的方法。
Graf，L.等人(1987和1988)描述了大鼠胰蛋白酶和胰蛋白酶原突变体在大肠杆菌(E.coli)中的表达和分泌。为了将胰蛋白酶原分子分泌到大肠杆菌的周质，将细菌碱性磷酸酶(phoA)的信号序列置换天然的胰蛋白酶原信号序列。分泌的无活性胰蛋白酶原分子是从周质中分离的，并通过用纯化的肠激酶进行酶促切割而活化。
Vasquez，J.R.等人(1989)描述了阴离子大鼠胰蛋白酶和胰蛋白酶突变体在大肠杆菌中的表达和分泌。为了使活性的胰蛋白酶分子表达和分泌到大肠杆菌的周质，将天然的胰蛋白酶原前区段原(Prepro-Segment)(信号序列和活化肽)通过细菌碱性磷酸酶(phoA)的信号序列进行置换并使用了可由磷酸盐调节的phoA启动子。活性的胰蛋白酶是从周质分离的。然而产率非常低(约1mg/l)。
Higaki，J.N.等人(1989)描述了胰蛋白酶和胰蛋白酶突变体用tac启动子和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)hisJ信号序列表达并分泌到大肠杆菌周质中。活性胰蛋白酶的产率为约0.3mg/l。活性的阴离子大鼠胰蛋白酶的体积产率可通过高细胞密度的催化增加到约50mg/l(Yee，L.和Blanch，H.W.，(1993))。然而，作者提到了活性胰蛋白酶在大肠杆菌中表达和分泌的问题。酶促的活性胰蛋白酶是在切割了信号序列且天然的胰蛋白酶蛋白质折叠形成6个二硫键之后在大肠杆菌的周质中形成的。活性胰蛋白酶的形成对于细胞是毒性的，这是因为活性胰蛋白酶水解周质中的大肠杆菌蛋白质并致使细胞溶解。此外，胰蛋白酶的蛋白质折叠，特别是6个二硫键正确的天然形成在大肠杆菌周质中是很难发生的。该系统不适用于分离较大量的胰蛋白酶(＞10mg；Willett，E.S.等人(1995))。
为了生产较大量的胰蛋白酶(50-100mg)用于X-射线晶体学研究，在可调节的ADH/GAPDH启动子控制下并通过与酵母α因子前导肽融合在酵母中分泌无活性的胰蛋白酶原前体。分泌到培养基中的表达产物是在体外依靠肠激酶定量地转变为胰蛋白酶的。产率为10-15mg/l(Hedstrom，L.等人(1992))。
编码带有起始甲硫氨酸残基的成熟牛胰蛋白酶和牛胰蛋白酶原的基因序列描述于EP 0 597 681中。此外，也描述了在大肠杆菌中的表达，但对于活性胰蛋白酶如何在大肠杆菌中形成的策略未作解释。
一种在曲霉属中用重组方法生产来自猪胰的胰蛋白酶或其衍生物的方法描述于WO 97/00316中。使用了一种转化载体，该载体为胰蛋白酶原或其衍生物如此编码，即其N-末端与功能信号肽融合。酵母培养物与曲霉属培养物相比达到了较高的生物量浓度，且生长明显较快，以致为了获得经济的表达方法所必需的产率，每个酵母细胞的特异性表达能力可比曲霉属细胞小。
一种蛋白酶酶原前体重组生产的方法描述于WO 99/10503中，该前体含有一个天然不存在的自身催化切割位点。该方法包括酶原前体在大肠杆菌中以内含体的形式表达及随后在一定条件下的纯化和复性，在该条件下酶原前体的蛋白酶部分以其天然构形形成且然后经复性的酶原前体的切割是自身催化进行的。该方法的缺点是在复性和工业生产所必需的大容积中经常会发生高损失。
胰蛋白酶类似物在巴斯德毕氏酵母中的重组生产描述于WO00/17332中。用于转化使用一种载体，其为一种胰蛋白酶原类似物(牛胰蛋白酶原的衍生物)编码，其中前肽C-末端的氨基酸赖氨酸通过突变交换为另一种氨基酸(除精氨酸或赖氨酸之外的)且其N-末端与功能信号肽融合。其中胰蛋白酶类似物以可溶的形式分泌到培养基中，且作为插入的突变结果即便在催化过程的相对高的pH值下不被不想要的自身催化作用活化和进一步降解。然后将氨肽酶用于活化。然而，该方法的缺点是需要去除额外的氨肽酶，该氨肽酶可以对于胰蛋白酶在最终过程中的进一步使用有不利的副作用。
天然存在的胰蛋白酶原基因在巴斯德毕氏酵母中的表达描述于WO 01/55429中。为了避免自身催化活化，例如催化是在约为6的微酸性pH范围中进行的。因而在最适pH范围之外防止了在表达阶段较长的运行期中自身催化性活化。该方法其他的缺点是胰蛋白酶原基因对于在巴斯德毕氏酵母中的表达不是密码子最适化的及相关的低表达产率。
本发明的目的是提供一种重组生产胰蛋白酶的方法，其中至少部分地消除了现有技术的缺点且允许活性胰蛋白酶能够以简单的方式以高的产率和活性获得。特别地，胰蛋白酶原应该可以以溶解形式作为中间产物从表达宿主的培养基中分离，且在催化和纯化过程中不遭受进一步的自身催化性活化。此外应该可能的是随后使胰蛋白酶原自身催化地活化和/或通过加入重组胰蛋白酶而活化。
本发明的目的是通过一种重组生产胰蛋白酶的方法实现的，该方法包含步骤a)用重组核酸转化宿主细胞，该核酸编码在前肽序列中具有肠激酶识别位点的可分泌型的胰蛋白酶原，该胰蛋白酶原优选地与介导分泌的信号肽融合，b)在一定条件下培养宿主细胞，该条件使得重组核酸能够表达且表达产物能够分泌到培养基中，该条件是为了至少基本防止前肽序列的自身催化性切割而选择的，c)从培养基中分离表达产物，d)切割前肽序列以形成活性胰蛋白酶且e)视需要从活性胰蛋白酶中除去未切割的胰蛋白酶原分子。
在根据本发明的方法中所用的宿主细胞可为真核的或原核的宿主细胞，如现有技术已知的。宿主细胞优选地为真核细胞，特别优选地为真菌细胞，且最优选地为酵母细胞。适宜的酵母细胞的实例为巴斯德毕氏酵母、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombae)，其中优选甲基营养酵母如巴斯德毕氏酵母或多形汉逊酵母，特别优选使用巴斯德毕氏酵母。
有利的是使用能够在一定条件下表达重组核酸并使表达产物分泌到培养基中的宿主细胞，在该条件下至少基本地且优选基本定量地防止前肽序列的自身催化性切割。这种条件有利地包括培养基的酸性pH值，特别优选为3和4范围内的pH值。胰蛋白酶原在酸性pH值且尤其在达到4的pH值时是稳定的，然而胰蛋白酶在中性或碱性培养基中发生自身催化性活化(Keil，B.(1971))。
在适当条件下通过在根据本发明的方法进行的培养防止了由宿主细胞分泌的重组胰蛋白酶原的过早活化，借此也能基本阻止所得的胰蛋白酶直至无活性的肽的进一步降解。在培养条件下重组胰蛋白酶原的稳定性是重要的，这是因为表达应由分泌伴随。从宿主细胞的分泌可以理解为胰蛋白酶原经过细胞膜从胞质向培养基中的释放。这通常通过胰蛋白酶原与功能信号肽的N-末端融合而发生。适当的信号肽的实例为已知的来自酵母的信号肽，且尤其优选地为来自酿酒酵母的α因子的信号肽。然而，当然同样可能的是使用其他的信号肽如天然控制胰蛋白酶原分泌的信号肽。
为了改进重组胰蛋白酶的表达能力，优选使用具有对各个宿主细胞为最适化的应用密码子的重组核酸。因此，有利的是对酵母细胞使用具有对酵母最适化的应用密码子的核酸。这种具有最适化应用密码子的核酸可例如平行地合成单独的寡核苷酸并随后将它们结合到一起。
倘若作为表达产物而由宿主细胞分泌的各个胰蛋白酶原在培养条件下基本是稳定的，那么根据本发明的方法基本上是适合于生产任何类型的重组胰蛋白酶的。该方法优选地用于生产脊椎动物胰蛋白酶，特别是哺乳动物如猪、绵羊或人中。特别优选生产猪胰蛋白酶。
此外优选的是使用编码具有缩短的前肽序列的胰蛋白酶原的重组核酸。胰蛋白酶原应理解为一种蛋白质，该蛋白质尽管形成了基本正确的蛋白质结构，但与活性胰蛋白酶相比没有或只具有非常低的蛋白水解活性，该活性有利地比活性形式的蛋白水解活性低至少5倍，且特别优选地低至少10倍。前肽部分的天然长度，如在猪胰蛋白酶原的情况下为25个氨基酸，优选地缩短为仅由肠肽酶如肠激酶的识别序列如氨基酸序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys组成的前肽序列。归因于克隆所需的少数额外的氨基酸如多达5个的氨基酸可视需要地附着在肠激酶识别序列的N-末端。
已发现根据本发明具有克隆所需的附着在肠激酶识别位点N-末端的氨基酸Glu-Phe的缩短的重组胰蛋白酶原的表达，相比于天然胰蛋白酶原在根据本发明的方法的表达，实现了显著更高的产率。因此，在根据本发明的方法的一个特别优选的实施方案中，使用了具有在SEQ ID NO22中所示的核苷酸序列的重组核酸，其编码具有缩短的前肽序列的猪胰蛋白酶原。
在根据本发明的方法中，重组胰蛋白酶原的表达优选地是由诱导型表达控制序列控制的。因此，宿主细胞的生长可在一定条件下发生于表达诱导之前，该条件对于宿主细胞的生长是便利的或最适的。因而如生长可发生于pH5-7，特别地为pH5-6中直至预定的光学密度，其间可调节的表达控制序列是受抑制的。表达可通过改变温度和/或通过添加诱导剂而诱导。优选的表达控制序列的实例是来自巴斯德毕氏酵母的可由甲醇诱导的AOX1-启动子，该启动子特别适合于甲基营养酵母中的诱导表达。培养条件是以这样一种方式在表达控制序列的诱导之前有利地进行改变的，如通过将pH改变为3-4的范围，以使由重组核酸表达形成的胰蛋白酶原以完整的形式在培养基中富集。
在根据本发明的方法中的培养条件是这样选择的，从而基本阻止前肽序列的自身催化性切割。在从培养基中分离表达产物之后，前肽序列可在控制的条件下被切除。该切割可通过如添加重组胰蛋白酶和/或通过自身催化切割来实施。自身催化切割应在此理解为重组胰蛋白酶原的自身活化，这可选择性地通过添加少量的重组胰蛋白酶但不添加外源蛋白质而加速。在该方式中，不必使用通常是源自动物原材料的并随后必须再次除去的额外的外源蛋白质，其可能在随后的应用中会导致不希望的切割。自身催化活化优选地于7-8的pH范围内进行。以这种方式确保在表达中形成的胰蛋白酶原可以首先在强酸性范围内被高度纯化，且活化可特定地通过缓冲变换优选地在少量如20mMCaCl2存在下在中性至弱碱性pH范围内开始。活化可通过将pH再次改变到强酸性范围而终止。胰蛋白酶可通过在离子交换材料如SP-Sepharose_XL或苄脒-琼脂糖上的层析来纯化。
为了纯化来自培养基中的表达产物，可首先如在实施例6.1中描述将培养物上清液从细胞中去除。随后的纯化包含胰蛋白酶的自身催化活化是优选地通过适当的层析纯化程序实施的。在一个特别优选的实施方案中，如在实施例6.2中描述的，在不对细胞的预先分离的情形下实施层析，其中将含有钙离子的缓冲液加入到仍然含有细胞的培养基中，优选终浓度为1-30mM钙。随后，根据本发明的方法的步骤(c)、(d)和可选择的(e)，例如用适当的层析纯化程序和用于表达产物的自身催化性切割的缓冲变换步骤实施。
因此，根据本发明的方法的特别优选的实施方案特征在于a)用重组核酸转化宿主细胞，该核酸编码来自猪的酶原前体胰蛋白酶原，该胰蛋白酶原与信号肽融合并含有缩短到肠激酶识别序列的前体，在此该切割位点是在确定的缓冲液条件下由重组胰蛋白酶或者自身催化切割的，缩短的胰蛋白酶原可被切割以形成活性胰蛋白酶，b)在表达阶段于酸性pH培养宿主细胞，优选地为pH 3-4，从而缩短的胰蛋白酶原以可溶性形式存在且分泌到培养基中，但自身催化性活化被基本阻止，c)从培养物上清液中分离缩短的重组胰蛋白酶原并在一定条件下使其活化，该条件允许通过重组胰蛋白酶或通过自身催化切割对缩短的胰蛋白酶原进行有效切割，且d)从活性胰蛋白酶中可选择地分离去未切割的胰蛋白酶原分子。
在本发明中描述的前肽的缩短尤其对表达和自身催化活化具有有利作用。此外，在成功的自身催化活化后，不想要的进一步的自溶在pH＞4.0时相对于培养物的生长期和表达期显著地增加了。
在根据本发明的方法中表达产率的额外增加可通过用多个载体转化宿主细胞而实现，每一个载体都含有上述的重组核酸，在此所述载体含有不同的选择标记如Zeocin和G418。在多选择条件下的培养显著地使得重组胰蛋白酶原的表达产率能够惊人地进一步增加。
本发明的另一个目的是一个重组核酸，该重组核酸编码在前肽序列中具有肠激酶识别位点的胰蛋白酶原，在此前肽序列相对于天然的前肽序列是缩短的，且优选地与信号肽序列融合。根据本发明的缩短的前肽序列优选地由具有氨基酸序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的肠激酶识别位点和位于其N-末端的可选择地达5个的额外氨基酸组成。根据本发明的核酸特别优选地具有在SEQ ID NO22中所示的核苷酸序列。
根据本发明的核酸优选地与可调节的表达控制序列操作性连接，该控制序列是如酵母细胞中基因表达的适当的表达控制序列，如来自巴斯德毕氏酵母的AOX1启动子。
本发明还涉及含有至少一个拷贝的上述重组核酸的重组载体。该载体优选地是适合于酵母细胞内基因表达的载体。这类载体的实例描述于Sambrook等人，分子克隆实验室手册(Molecular CloningALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York。
除重组核酸之外，载体含有用于各个应用目的的其他适宜的遗传元件，特别是一个选择标记基因。可以以多拷贝而存在于细胞内的载体是特别优选使用的，尤其是可以以多倍形式整合入宿主细胞基因组的载体。本发明也涉及载体的组合，每一个载体都含有不同的选择标记基因，且可同时在宿主细胞内增殖。
此外，本发明涉及用根据本发明的核酸或根据本发明的载体转化的重组细胞。该重组细胞优选酵母细胞，特别地是甲基营养酵母细胞如巴斯德毕氏酵母或多形汉逊酵母。
最后本发明涉及由根据本发明的核酸编码的重组胰蛋白酶原。该重组胰蛋白酶原具有与天然前肽序列相比缩短的前肽序列，并含有肠激酶识别位点。根据本发明的重组胰蛋白酶原优选地具有在SEQ IDNO23中所示的氨基酸序列。
本发明应该通过下面的附图和实施例进一步阐明。


图1表示具有完整重组胰蛋白酶原的表达质粒pTRYP-9的质粒图谱。
图2表示具有缩短的重组胰蛋白酶原(sh-胰蛋白酶原)和Zeocin抗性标记基因(ZeoR)的表达质粒pTRYP-11的质粒图谱。
图3表示含有缩短的重组胰蛋白酶原(sh-胰蛋白酶原)和卡那霉素/G418选择标记基因(KanR)的表达质粒pTRYP-13的质粒图谱。
实施例方法重组DNA技术使用了标准方法来扩增DNA，如描述于Sambrook，J.等人，(1989)分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork。所使用的分子生物学试剂是根据生产商的说明书来使用的。
蛋白质确定纯化的胰蛋白酶的蛋白质确定是通过在280nm的吸收测量来实施的。在1cm透射路径下对于吸收率(E)1％280nm使用13.6折算数值。
计算蛋白质[mg/ml]＝(10[mg/ml]*ΔE样品*稀释度)/13.6巴斯德毕氏酵母和巴斯德毕氏酵母的表达载体将来自Invitrogen的目录和说明书手册用作处理巴斯德毕氏酵母和其表达载体的说明书。用于表达缩短的重组胰蛋白酶原的载体是基于来自Invitrogen的载体pPICZαA和pPIC9K的。
实施例1具有在酵母中表达的最适的应用密码子的完整重组胰蛋白酶原的基因合成提供根据本发明的方法的优选措施之一是密码子最适化的基因序列的合成。为了使每一个用于在酵母中表达的密码子均最适化，必需的是对于编码完整重组胰蛋白酶原的约700bp长的基因进行完全从头的合成。如果必需，通过根据SEQ ID NO1的猪胰蛋白酶原的氨基酸序列的反翻译可以利用简并密码子而使每一个密码子最适化。为此目的，将基因分为18个具有54～90个核苷酸长度的寡核苷酸。将所述寡核苷酸设计为交换顺序的有义链和相反链片段，各自的5’及3’端以互补的方式与邻近的寡核苷酸重叠。在每一种情况下均选择重叠区域，从而在随后PCR反应的退火反应中大大防止了非特异性的结合。在基因5’及3’端的寡核苷酸在编码区限制性内切核酸酶识别位点的上游和下游，该位点可用于后面将根据SEQ ID NO2的合成基因插入到载体中。因而将限制性内切核酸酶EcoR I的识别位点插入到上游，且将限制性内切核酸酶Xba I的识别位点插入到下游。该寡核苷酸的序列在SEQ ID NO3～20中显示。
基因合成是依靠PCR反应实施的。为此，首先将编码区分为3个区段(寡核苷酸3～8、9～14、15～20)，且这些区段是用重叠互补寡核苷酸在公开的PCR反应中生成的。在此该基因片段是以逐步的方式延伸的，直到形成了全长产物，然后该产物在随后的循环中扩增。退火温度在此是根据具有最低熔点温度的重叠区进行选择的。
随后所述3个区段是用琼脂糖凝胶电泳进行分析的，将具有预期长度的产物依靠QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen)从凝胶中分离，且在进一步的PCR反应中合成为完整基因产物。PCR反应的前5个循环是在没有给入整体基因的5’端和3’端添加引物而实施的，从而最初从3个区段中形成了少数具有预期长度的基因产物的片段。退火温度是根据具有最低熔点温度的重叠区进行选择的。然后添加末端引物，且将退火温度提高到根据具有最低熔点温度的引物的退火温度。然后在进一步的25个循环中大量扩增具有预期长度的基因片段。PCR片段是通过测序来检查的。
实施例2缩短的胰蛋白酶原基因的生成天然存在的胰蛋白酶原的前20个氨基酸的密码子是依靠根据SEQ.ID NO21的特定设计的5’引物来探测的，从而只有肠肽酶肠激酶识别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的密码子和归因于EcoR I限制性内切核酸酶识别位点的用于克隆进巴斯德毕氏酵母表达载体中所必需的Glu-Phe密码子，保留在缩短的重组胰蛋白酶原的N-末端的前肽序列。缺失是通过PCR反应用根据SEQ ID NO21的5’引物和根据SEQ ID NO20的3’引物在完整重组胰蛋白酶原基因的PCR片断上引入的。缩短的重组胰蛋白酶原的DNA序列及氨基酸序列分别在SEQID NO22和SEQ ID NO23中显示。
实施例3将由基因合成产生的完整重组胰蛋白酶原和缩短的重组胰蛋白酶原的PCR片段克隆入巴斯德毕氏酵母的表达载体中将PCR片段用EcoR I和Xba I(Roche Diagnostics GmbH)再次切割，再次分离(QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen)并随后连接到表达载体pPICZαA(Invitrogen)的片段中，该片断是用EcoRI和Xba I(Roche Diagnostics GmbH)线形化的并用QIAquick GelExtraction Kit/Qiagen分离。为此，用移液管分别取1μl(20ng)载体片段和3μl(100ng)PCR片段、1μl 10x连接缓冲液(Sambrook等人，1989 B.27)、1μl T4 DNA连接酶、4μl无菌H2O重蒸馏的，谨慎地混合并于16℃温育过夜。在该载体中，合成基因是在用甲醇(Mallinckrodt Baker B.V.)可诱导的AOX 1启动子(来自巴斯德毕氏酵母的醇氧化酶1的启动子)的控制下的，并在正确的读框中位于来自酿酒酵母的α因子的信号肽之后。为了用于检查并分离质粒，将5μl连接混合物在200μl感受态细胞(Hanahan(1983)的大肠杆菌XL1Blue(Stratagene))中进行转化。在冰上30分钟的温育之后伴随着热休克(于42℃进行90秒)。随后，将细胞转移到1ml LB培养基中并于37℃在LB培养基中温育1小时以进行表型表达。将该转化混合物的等分试样用100μg/ml的Zeocin作为选择标记平板培养于LB平板中，并于37℃温育15小时。质粒是从生长的克隆中分离的(Sambrook，J.等人，(1989)分子克隆实验室手册(MolecularCloningA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)，然后依靠限制性分析和测序来检查无错误的碱基序列。将在这种方式中形成的表达载体命名为pTRYP-9(参见图1)及pTRYP-11(参见图2)，该载体含有完整重组胰蛋白酶原及缩短的重组胰蛋白酶原的合成基因。
pTRYP-9和pTRYP-11向巴斯德毕氏酵母中的转化对于pTRYP-9和pTRYP-11向巴斯德毕氏酵母X-33、GS115或KM71H中的转化及随后整合入基因组中，首先将载体用Sac I(RocheDiagnostics GmbH)进行线形化。该转化是用Gene Pulser II(Biorad)通过电穿孔来实施的。为此，将巴斯德毕氏酵母菌落用5ml YPD培养基(Invitrogen)进行接种，并在振荡中于30℃温育过夜。随后将过夜培养物在200ml新鲜的YPD培养基(Invitrogen)中于1∶2000进行过量接种并在振荡中于30℃温育过夜，直到达到1.3～1.5的OD600。将细胞进行离心(1500xg/5分钟)并将沉淀悬浮于200ml冰冷的无菌水(0℃)中。再次将细胞进行离心(1500xg/5分钟)并悬浮于100ml冰冷的无菌水(0℃)中。再次将细胞进行离心并悬浮于10ml冰冷的(0℃)1M山梨糖醇(ICN)中。再次将细胞进行离心并悬浮于0.5ml冰冷的(0℃)1M山梨糖醇(ICN)中。将以这种方式分离的细胞贮存于冰上并立即用于转化。
将80μl细胞与约1μg线形化的pTRYP-9及pTRYP-11载体DNA混合，将整个混合物转移到冰冷的(0℃)电穿孔杯中并在冰上进一步温育5分钟。随后，将该杯置于Gene Pulser II(Biorad)上，且转化是在1kV、1kΩ和25μF时实施的。电穿孔后，将混合物与1ml 1M的山梨糖醇(ICN)混合，且随后将100～150μl平板培养于含有100μg/ml Zeocin(Invitrogen)的YPDS琼脂平板(Invitrogen)上。随后将该平板于30℃温育2-4天。
将克隆在Raster-MD(＝最小右旋糖)平板上进行过量接种，并进一步地进行分析。挑取生长的克隆、重悬于20μl无菌水中、用17.5U溶细胞酶(Roche Diagnostics GmbH)进行溶解(1小时，30℃，10分钟，-80℃)，并直接依靠PCR来确定合成的胰蛋白酶原表达盒的正确整合。
然后将在转化入基因组过程中整合了完整的表达盒的克隆用于表达实验中。
完整及缩短的重组胰蛋白酶原的表达将阳性克隆接种于3ml BMGY培养基(Invitrogen)中并在振荡中于30℃温育过夜。随后在600nm确定OD，并将它们过量接种于10ml BMMY培养基(Invitrogen)pH3.0中，从而结果所得的OD600为1。BMMY培养基(Invitrogen)pH3.0含有甲醇(Mallinckrodt BakerB.V.)，该甲醇可通过AOX1启动子诱导完整及缩短的重组胰蛋白酶原的表达。
将摇瓶在振荡中于30℃温育，每24小时进行一次采样，确定OD600，获取等分试样以通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来检查完整和缩短的重组胰蛋白酶原，且每一份都用0.5％的甲醇(MallinckrodtBaker B.V.)进行补充以进行进一步的诱导。表达实验进行了72小时。
依靠SDS凝胶电泳对完整及缩短的重组胰蛋白酶原表达的分析从每一表达培养物中获取500μl，确定OD600并对细胞进行了离心。将培养物上清液贮藏，并将细胞沉淀重悬在OD600的适应量的Y-PERTM(50～300μl/穿刺(Pierce))中进行溶解，并在室温振荡1小时。随后将溶胞产物离心以分离细胞残渣(15000xg/5分钟)，并将上清液转移到新鲜的反应容器中。将10μl溶胞产物和10μl培养物上清液加置于SDS聚丙烯酰胺凝胶中，且该蛋白质是根据大小通过应用电场而分离的。
令人惊讶地，在此可以鉴定出培养物上清液具有弱的条带，该上清液不论是含有完整重组胰蛋白酶原的克隆还是含有缩短的重组胰蛋白酶原的克隆，而不发生于对照克隆中。对照克隆应理解为巴斯德毕氏酵母X33细胞，该细胞已用起始的载体pPICZαA转化并已与胰蛋白酶原的表达克隆类似地进行了生长和诱导。表达克隆中新蛋白质条带的迁移性质相应于计算的分子量并略高于用作对照标记的牛胰蛋白酶。该大小中的微小差异指示了完整的、非活性的胰蛋白酶原。
令人惊讶地，重组的缩短的胰蛋白酶原显著比重组完整胰蛋白酶原表达更强。
实施例4
通过多重转化来增加表达量再次将来自具有重组的缩短的胰蛋白酶原的表达实验的最好克隆用于上述的电穿孔，并再次用1μg线形化的pTRYP-11载体DNA进行转化，将转化混合物平板培养于含有1000～2000μg/ml Zeocin(Invitrogen)的YPDS琼脂平板(Invitrogen)上。以这样一种途径增加了选择压力，即只有多个拷贝的表达载体pTRYP-11及因此同样具有多个拷贝的各种抗性基因(在该情况下为Zeocin_)整合入基因组的克隆可以生长。该Zeocin_抗性蛋白质来自印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)的博来霉素基因(Calmels，T.等人，(1991)；Drocourt，D.等人，(1990))，该产物以化学计量浓度比例结合Zeocin_，并因此使得对Zeocin_有抗性。YPDS琼脂平板中Zeocin_的浓度越高，则必须通过细胞生产更多的抗性蛋白质以定量结合Zeocin_并因此使得能够生长。这，也是可能的，当多拷贝的抗性基因整合入基因组。如上所述，将克隆在Raster MD平板上进行接种。随后如上所述再次检查这些克隆的胰蛋白酶原的表达和分泌。
令人惊讶地，在这些措施之后可以根据SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定在培养物上清液中分泌了明显增加表达量的缩短的重组胰蛋白酶原的克隆。
实施例5通过用第二个选择压力来增加表达量将Zeocin_的浓度增加到超过2000μg/ml不导致缩短的重组胰蛋白酶原表达能力的改进。为了进一步增加根据SEQ ID NO22的基因表达克隆中的基因拷贝数目，该基因编码重组的缩短的胰蛋白酶原且对酵母中的表达是密码子最适化的，将额外的表达载体依靠第二个选择压力优选G418(Roche Diagnostics GmbH)整合入实施例3和4中制备的具有最大表达能力的表达克隆基因组中。
为此目的，用限制性内切核酸酶Sac I和Xba I将来自pTRYP-11的表达盒的一部分，(由AOX1-启动子的一部分、酿酒酵母α因子的信号肽基因、根据SEQ ID NO22的重组的缩短的胰蛋白酶原的密码子最适化基因组成)从pTRYP-11中切除，该限制性混合物是在1％的琼脂糖凝胶上进行分离的，且从凝胶上分离了1693bp的片段(QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen)。同时，将载体pPIC9K(Invitrogen)用Sac I和Not I切割，限制性混合物在1％的琼脂糖凝胶上进行分离，且从凝胶上分离了8956bp的片段(QIAquick GelExtraction Kit/Qiagen)。将来自pTRYP-11的片段的Xba I突出端和来自pPIC9K的Not I突出端根据生产商的说明书用克列诺聚合酶(Klenow polymerase)(Roche Diagnostics GmbH)进行填充以形成平端。随后将以这种方式获得的两个片段如上所述进行连接。如上所述将连接混合物在大肠杆菌XL1 Blue(Stratagene)中进行转化(含有质粒的克隆是用100μg/ml的氨苄青霉素在营养平板上进行选择的)，并依靠限制性分析和测序来检查。将在这种途径中形成的表达载体命名为pTRYP-13(参见图3)。
表达载体pTRYP-13向巴斯德毕氏酵母基因组中的整合是依靠G418(Roche Diagnostics GmbH)进行选择的。
将来自用pTRYP-11(Zeocin抗性)多重转化的具有最高胰蛋白酶原表达能力的克隆如上所述为电穿孔进行制备，并用1μg来自pTRYP-13(G418抗性)用Sal I(Roche Diagnostics GmbH)线形化的载体片段进行转化。随后将转化混合物于4℃在1M山梨糖醇(ICN)中贮藏1～3天(以形成G418抗性)，然后将100～200μl平板培养于含有1、2和4mg/ml G418(Roche Diagnostics GmbH)的YPD平板(Invitrogen)上，并于30℃温育3～5天。将由此优选地从具有最高G418浓度的YPD平板上所得的克隆再次用如上所述的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检查缩短的重组胰蛋白酶原的增加的表达。
在这些措施之后，令人惊讶地可能的是依据SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，再次在培养物上清液中鉴定出具有缩短的重组胰蛋白酶原的增加了表达能力的克隆。
实施例6从培养物上清液中分离胰蛋白酶原并活化6.1培养物上清液是用微量过滤、离心或过滤与细胞分离的。胰蛋白酶原是通过用苯基琼脂糖的层析快速流动(phenyl Sepharose fastflow)(Pharmacia)进行纯化的。层析是在pH2-4的范围内实施的。自身催化性活化是通过在20mM CaCl2存在下将pH缓冲更换到7-8启动的。该自身催化性活化可通过将pH重新改变回2-4的范围而再次终止。活化的胰蛋白酶是通过苄脒琼脂糖上的层析(如SP-Sepharose_XL，ff)(Pharmacia/Beipackzettel)或在离子交换剂上进行纯化的。将胰蛋白酶贮藏于pH1.5-3以防止自身降解。纯化的胰蛋白酶的特定的活性为180-200U/mg蛋白质。
6.2整个催化液体培养基是以约1∶2～1∶4的比例用含有5-30mM氯化钙的乙酸铵缓冲液(5-20mM)，pH3.5进行稀释的，并依靠使用阳离子交换剂(如Streamline_SP，XL)的膨胀床层析(McCornick(1993)；EP 0 699 687)进行纯化。在这种情况下，层析是在细胞存在下实施的。然后通过层析步骤同时分离细胞。随后，程序如在实施例6.1中所描述的(更换缓冲/活化等)。
实施例7活性确定胰蛋白酶的活性是用Chromozym TRY(Pentapharm Ltd)于25℃在100mM Tris pH8.0，20mM CaCl2中确定的。光度测量是在405nm实施的。
缩写YPD酵母蛋白胨右旋糖YPDS酵母蛋白胨右旋糖山梨糖醇BMGY缓冲的甘油复合培养基BMMY缓冲的甲醇复合培养基SDS十二烷基硫酸钠参考文献列表Bricteux-Gregoire，Schyns R.，Florkin M(1966)Biochim.Biophys.Acta 127pp 277Calmels T.，Parriche M.，Durand H.，Tiraby G.(1991)，Curr.Genet.20pp.309Charles M.，Rovery M.，Guidoni A.，Desnuelle P.(1963)Biochim.Biophys.Acta 69pp115-129Desnuelle P.(1959)The Enzymes 2ndEdition Vol 4 Editor Boyer，Acad.Press NY.pp.119Drocourt，D.，Calmels T.，Reynes J.P.，Baron M.，Tiraby G.(1990)，Nucleic Acid Research 18pp.4009Graf L.，Craik C.S.，Patthy A.，Roczniak S.，Fletterick RJ.，Rutter W.J.(1987)Biochem.26pp.2616Graf L.，Jancso A.，Szilagyi L.，Hegyi G.，Pinter K.，Naray-Szabo G.，HeppJ.，Medzihradszky K.，Rutter W.J.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85，pp.4961Hanahan(1983)J.Mol.Biol.，166pp.557)Higaki J.N.，Evnin L.B.，Craik C.S.(1989)Biochem.28pp.9256
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序列表<110>Roche Diagnostics GmbH<120>生产重组胰蛋白酶的方法<130>5515/00/EP<140>
<141>
<150>01102342.1<151>2001-02-01<160>23<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>247<212>PRT<213>Porc<400>1Ile Pro Asn Thr Phe Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ala Ala Val Ala1 5 10 15Phe Pro Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala20 25 30Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe35 40 45Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His50 55 60Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp65 70 75 80Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr85 90 95His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile100 105 110
Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser115 120 125Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly130 135 140Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln145 150 155 160Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr165 170 175Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly180 185 190Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn195 200 205Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys210 215 220Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile225 230 235 240Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn245<210>2<211>744<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成基团<400>2attccaaata cttttgtttt gttggctttg ttgggtgctg ctgttgcttt tccaactgat 60gatgatgata aaattgttgg tggttatact tgtgctgcta attctattcc atatcaagtt 120tctttaaatt ctggttctca tttttgtggt ggttctttga ttaattctca atgggttgtt 180tctgctgctc attgttacaa atcaagaatc caagttagat tgggtgaaca taatattgat 240gttttggaag gtaatgaaca atttattaat gctgctaaaa ttattactca tccaaatttt 300aatggtaata ctttggataa tgatattatg ttgattaaat tgtcttctcc agctacttta 360aattcaagag ttgctactgt ttctttgcca agatcttgtg ctgctgctgg tactgaatgt 420ttgatttctg gttggggtaa tactaaatct tctggttctt cttatccatc tttgttgcaa 480
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<223>人工序列描述合成基团<400>22gatgatgatg ataaaattgt tggtggttat acttgtgctg ctaattctat tccatatcaa 60gtttctttaa attctggttc tcatttttgt ggtggttctt tgattaattc tcaatgggtt 120gtttctgctg ctcattgtta caaatcaaga atccaagtta gattgggtga acataatatt 180gatgttttgg aaggtaatga acaatttatt aatgctgcta aaattattac tcatccaaat 240tttaatggta atactttgga taatgatatt atgttgatta aattgtcttc tccagctact 300ttaaattcaa gagttgctac tgtttctttg ccaagatctt gtgctgctgc tggtactgaa 360tgtttgattt ctggttgggg taatactaaa tcttctggtt cttcttatcc atctttgttg 420caatgtttga aagctccagt tttgtctgat tcttcttgta aatcttctta cccaggtcaa 480attactggta atatgatttg tgttggtttt ttggaaggtg gtaaagattc ttgtcaaggt 540gattctggtg gtccagttgt ttgtaatggt caattgcaag gtattgtttc ttggggttat 600ggttgtgctc aaaaaaataa accaggtgtt tacactaaag tttgtaatta tgttaattgg 660attcaacaaa ctattgctgc taattag 687<210>23<211>228<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述缩短的胰蛋白酶原<400>23Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser1 5 10 15Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly20 25 30Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys35 40 45Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu50 55 60Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Asn65 70 75 80
Phe Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser85 90 95Ser Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser Leu Pro Arg100 105 110Ser Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn115 120 125Thr Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Lys130 135 140Ala Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln145 150 155 160Ile Thr Gly Asn Met Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp165 170 175Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu180 185 190Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro195 200 205Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr210 215 220Ile Ala Ala Asn22权利要求
1.重组生产胰蛋白酶的方法，该方法包含步骤a)用重组核酸转化宿主细胞，该核酸编码一种由宿主可分泌的形式的前肽序列中具有肠激酶识别位点的胰蛋白酶原，b)在一定条件下培养宿主细胞，该条件使得重组核酸能够表达且表达产物能够分泌到培养基中，该条件是为了基本防止前肽序列的自身催化性切割而选择的，c)从培养基中分离表达产物，d)切割前肽序列以形成活性胰蛋白酶且e)从活性胰蛋白酶中可选择地分离未切割的胰蛋白酶原分子。
2.如权利要求1的方法，其特征在于，将一种酵母细胞用作为宿主细胞。
3.如权利要求1或2的方法，其特征在于，将巴斯德毕氏酵母或多形汉逊酵母用作为宿主细胞。
4.如权利要求1～3之一的方法，其特征在于，使用编码与介导分泌的信号肽融合的胰蛋白酶原的重组核酸。
5.如权利要求1～4之一的方法，其特征在于，使用具有对于宿主细胞最适化的应用密码子的重组核酸。
6.如权利要求1～5之一的方法，其特征在于，使用编码具有缩短的前肽序列的胰蛋白酶原的重组核酸。
7.如权利要求1～6之一的方法，其特征在于，使用编码猪胰蛋白酶原的重组核酸。
8.如权利要求1～7之一的方法，其特征在于，使用具有在SEQID NO22中所示的核苷酸序列的重组核酸。
9.如权利要求1～8之一的方法，其特征在于，重组核酸的表达是在酸性条件下进行的，特别是在pH3-4。
10.如权利要求9的方法，其特征在于，在重组核酸表达之前宿主细胞是在一定条件下进行培养的，该条件对于宿主细胞的生长基本是最适的。
11.如权利要求10的方法，其特征在于，在重组核酸表达之前宿主细胞是于pH5-7下培养至预定的光学密度的，然后诱导了重组核酸的表达。
12.如权利要求1～11之一的方法，其特征在于，前肽的切割是通过添加重组胰蛋白酶或/和通过自身切割进行的。
13.如权利要求1～12之一的方法，其特征在于，含有宿主细胞的培养基与含有钙离子的缓冲液进行混合，且随后实施了步骤(c)、(d)和可选择的(e)。
14.编码在前肽序列中具有肠激酶识别位点的胰蛋白酶原的重组核酸，其特征在于，该前肽序列与天然的前肽序列相比是缩短的。
15.如权利要求14的核酸，其特征在于，所述前肽序列由具有氨基酸序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的肠激酶识别位点和可选择地位于其N-末端的多达5个的额外氨基酸组成。
16.如权利要求14或15的核酸，其特征在于，该核酸具有在SEQID NO22中所示的核苷酸序列。
17.如权利要求14～16之一的核酸，其特征在于，该核酸与可调节的表达控制序列可操作地进行连接。
18.重组载体，其特征在于，该载体含有至少一个拷贝的如权利要求14～17之一的重组核酸。
19.重组细胞，其特征在于，该细胞是用如权利要求14～17之一的核酸或用如权利要求18的载体转化的。
20.重组胰蛋白酶原，其特征在于，该胰蛋白酶原具有与天然前肽序列相比缩短的前肽序列并含有一个肠激酶识别位点。
21.如权利要求20的胰蛋白酶原，其特征在于，所述前肽序列由具有氨基酸序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的肠激酶识别位点和可选择地位于其N-末端的达5个的额外氨基酸组成。
22.如权利要求20或21的胰蛋白酶原，其特征在于，具有在SEQID NO23中所示的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及生产来自猪胰的重组胰蛋白酶的方法，该胰蛋白酶在巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)中是可溶的且分泌到培养基中，其中在pH3.0－4.0的表达防止了胰蛋白酶原到β胰蛋白酶的活化和β胰蛋白酶由胰蛋白酶自溶为ε胰蛋白酶及由此变为失活的肽。
文档编号C12N1/15GK1545553SQ02805619
公开日2004年11月10日 申请日期2002年2月1日 优先权日2001年2月1日
发明者R·米勒, S·格莱泽, F·盖佩尔, J-P·塔尔霍费尔, B·雷克塞尔, C·施奈德, M·拉特卡, S·伦宁, H·埃克施泰因, C·吉塞尔, R 米勒, 乜, 吃, 宥 , 巳, 耸┨┮, 舴讯, 蔚 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司, 弗 哈夫曼-拉罗切有限公司