专利名称：一种海洋细菌适冷蛋白酶及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种克隆自海洋细菌Halobacillussp. SCSIO 20089的、能用于蛋白质水解的适冷蛋白酶及其编码基因和应用。
背景技术：
2010年世界工业酶的市场销售额为33亿美元，据估计在未来五年内会以平均每年6%的速度增长，即到2015年可达到44亿美元。适冷酶因其在低 温条件下比中温高温酶具有更高的催化活力，在当今提倡增效节能的背景下越来越受到研究者的关注。海洋占据了地球表面的70%，海洋拥有着与陆地迥然不同的生态环境，如低温、高压、特殊的光照条件等。据报道在任何纬度下，距海水表面IOOOm以下的温度不会超过5°C，这就意味着深海或者海底沉积物环境中的微生物是产适冷酶的重要来源。蛋白酶催化蛋白质肽键的水解，占据了工业酶市场份额的近60%，在洗涤、皮革、食品、医药等行业都有广泛的应用。蛋白酶广泛存在于动植物及微生物中，其中微生物蛋白酶因活力高易于规模生产被研究得最多。海洋沉积物中的微生物分泌的蛋白酶在整个生态系统氮循环中对海洋有机大颗粒蛋白的水解过程起着关键的作用，常年生活在海底沉积物中的微生物为了适应环境，进化出能分泌在低温下高效水解体外大分子蛋白质酶类的能力，因而海洋沉积物是挖掘产适冷蛋白酶微生物的优良资源。
发明内容
本发明的第一个的目的是提供一种新的适冷蛋白酶及其编码基因。本发明的适冷蛋白酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本发明的编码适冷蛋白酶的基因，其特征在于，编码氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的适冷蛋白酶的基因所述的编码适冷蛋白酶的基因优选，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本发明的第二个目的是提供一种表达载体，其特征在于，含有上述编码适冷蛋白酶的基因。本发明的第三个目的是提供一种含有上述表达载体的微生物。本发明的第四个目的是提供适冷蛋白酶在蛋白质水解中的应用。本发明利用兼并引物PCR，TAIL-PCR 从海洋细菌 Halobacillus sp. SCSIO 20089基因组DNA中扩增获得编码适冷蛋白酶的适冷蛋白酶基因hspal，其核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示，共有1590个核苷酸组成，blastn结果显示该基因序列与数据库中公布基因无显著相似性。按照密码子原则推测其编码的适冷蛋白酶HSPA2，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 2 所示，由 529 个氨基酸组成，使用 Blast (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/)搜索GenBank数据库，与适冷蛋白酶HSPA2催化功能域相似性最高的为越南芽孢杆菌(Bacillusvietnamensis)的M4家族蛋白酶BWMP(序列号为BAD13318)，其一致性为54%。用组件结构研究工具 Pfam(http://pfam. sanger. ac. uk/search)分析来源于海洋细菌 Halobacillussp. SCSIO 20089的适冷蛋白酶HSPA2的组件结构，结果显示自N端的第f 25位氨基酸为信号肽，自N端的第75 125位氨基酸为Thermolysin蛋白酶前导肽的Fungalysin区序列，自N端第136-221位氨基酸为蛋白酶前导肽的YPEB功能域，自N端的第225-377位氨基酸为Thermolysin金属蛋白酶的催化域序列，自N端379-528位氨基酸为Thermolysin金属蛋白酶的alpha螺旋区序列。将适冷蛋白酶基因hspal与表达载体pWB980连接，再转入枯草芽孢杆菌WB600中表达重组产物适冷蛋白酶HSPA2进行酶活的测定和酶学性质测定，结果表明适冷蛋白酶基因hspal的表达产物适冷蛋白酶HSPA2能够水解酪蛋白，其酶比活为3077U/mg蛋白。该适冷蛋白酶HSPA2的酶学性质如图5和图6所示，从图5和图6可以看出，本发明的适冷蛋白酶HSPA2在低温下也具有较好的酶活性，其最适作用温度为35°C，最适作用pH值为8. O。综上所示，本发明的适冷蛋白酶HSPA2是一种在低温下也具有较好活性的新的蛋 白酶，其编码基因一适冷蛋白酶基因hspal也是一种新的基因。本发明提供了一种新的编码适冷蛋白酶HSPA2的基因适冷蛋白酶基因hspal及其编码的适冷蛋白酶HSPA2，该适冷蛋白酶HSPA2具有优良的适冷性能，在蛋白质的水解中具有广泛的用途。用于本发明的海洋细菌Halobacillus sp. SCSIO 20089为本发明人所在实验室从海洋沉积物中分离得到并保藏，但已经公开于非专利文献一 UNIPR0T数据库中，分类识别号(Taxon identifer):1151003,学名(Scientific name) Halobacillus sp. SCSIO 20089,链接网页http://www. uniprot. orR/taxonomy/1151003#。本申请人保证自申请曰起20年内向公众提供该海洋细菌Halobacillus sp. SCSIO 20089。
图I为PCR产物电泳图，其中M为Marker，I为PCR产物；图2为质粒双酶切产物电泳图，其中Ml和M2为Marker，I为质粒双酶切产物；图3为适冷蛋白酶基因hspal在枯草杆菌WB600中表达的平板照；图4为适冷蛋白酶HSPA2的纯化电泳图，其中I为Marker，2和3为纯化后的适冷蛋白酶HSPA2纯酶液；图5为适冷蛋白酶HSPA2的最适作用温度的测定；图6为适冷蛋白酶HSPA2的最适作用pH的测定。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。在本发明的实施例中所用到的材料包括Bacillus subtilis WB600、表达载体PffB 980为市售产品，LA taq酶，pMD18_T载体，限制性内切酶购自TaKaRa公司，胶回收试剂盒购自OMEGA公司。实施例I :UHalobacillus sp. SCSIO 20089 基因组 DNA 的提取参考《分子克隆实验指南》(I)培养5ml海洋细菌Halobacillus sp. SCSIO 20089的培养物，取Iml的培养物12000rpm离心2min,收集菌体；(2)菌体沉淀物中加入567 ii I TE buffer中，反复吹打使之重悬。加入30yl20mg/ml溶菌酶，37°C水浴Ih ；(3)加入 300 u 110%SDS 和 30 20mg/ml 蛋白酶 K，混匀，37 °C 水浴 Ih ；(4)加入100 U I 5MNaC l，充分混匀，再加入80 U I CTAB/NaCl溶液，混匀，65度水浴 IOmin ；(5)分别加入等体积酚/氯仿，氯仿溶液抽提一次；(6)加入0. 6倍体积异丙醇,轻轻混合，12000rpm离心5min,弃上清,70%乙醇洗漆
两次，超净台风干；(7)加入50 ill TE缓冲液，4°C过夜溶解DNA，由此得到海洋细菌Halobacillussp. SCSIO 20089的基因组DNA，保存备用。2、兼并引物PCR克隆适冷蛋白酶基因hspal的部分序列根据芽孢杆菌属M4家族蛋白酶保守氨基酸设计两条兼并引物20089thermysin-sense CAGATGGTGTACGGCGAYGGNGAYGG ；20089thermysin-antisense CGCGGAGTTGGCGCCRTANARRTC,以 20089thermysin-sense,20089thermysin-antisense 为弓丨物，Halobacillussp. SCSIO 20089 基因组 DNA 为模板，PCR 扩增。PCR 反应条件为，94°C，5min ;94°C，lmin，55°C，lmin，72°C，2min，30个循环；72°C，延伸IOmin0获得约400bp的片段，胶回收纯化后连接pMD18-T载体进行测序，同源比对发现获得437bp序列与Genebank中芽孢杆菌属的中性蛋白酶有较高的相似性。3、利用TAIL-PCR克隆适冷蛋白酶基因hspal的全基因根据已获得的437bp的基因序列分别设计3条特异性的引物以扩增5’端序列(20089M4-5-1 :5’ -GGCGTTAAATAAACAGTTAGTGCACGATAGTA-3’ ；20089M4-5-2 :5’ -TGGTATGGACGCCACCCCAGTC ；20089M4-5-3, 5’ -GGTAGATTCTGATACTCATCCATAGAATCCGG-3’ )和两条3’端特异性引物(20089M4-3-1 :5’ -GACTGGGGTGGCGTCCATACCA-3’ ；20089M4-3-2, 5’ -TACTATCGTGCACTAACTGTTTATTTAACGCC-3’ )；TAIL-PCR所用的通用引物为AD-I :5，-ACGATGGACTCCAGAGVNVNNNGGAA-3，；AC I :5，-ACGATGGACTCCAGAG-3，。经过两组TAIL-PCR后，分别获得约1500bp和300bp的片段，连接pMD18_T载体测序，与前面获得的437bp片段拼接成完整的适冷蛋白酶基因hspal，适冷蛋白酶基因hspal的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。4、适冷蛋白酶基因hspal的核苷酸序列分析用 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www. ncbi.nlm. nih. gov/)上的软件如ORF finder, Blast对DNA序列进行分析。适冷蛋白酶基因hspal的开放阅读框由1590个脱氧核苷酸组成,序列如SEQ ID NO. I所示,其中起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。blastn结果显示该基因序列与数据库中公布基因无显著相似性。5、适冷蛋白酶基因hspal的编码产物适冷蛋白酶HSPA2的氨基酸序列分析适冷蛋白酶基因hspal编码一个含529个氨基酸的蛋白质一适冷蛋白酶HSPA2，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示,使用 Blast (http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/)搜索GenBank数据库，与适冷蛋白酶HSPA2催化功能域相似性最高的为越南芽孢杆菌(Bacillusvietnamensis)的M4家族蛋白酶BWMP (序列号为BAD13318)，其一致性为54%。用组件结构研究工具Pfam(http://pfam. sanger.ac.uk/search)分析来源于海洋细菌Halobacillus sp. SCSIO 20089的适冷蛋白酶HSPA2的组件结构，结果显示自N端的第1-25位氨基酸为信号肽，自N端的第75-125位氨基酸为Thermolysin蛋白酶前导肽的Fungalysin区序列，自N端第136-221位氨基酸为蛋白酶前导肽的YPEB功能域，自N端 的第225-377位氨基酸为Thermolysin金属蛋白酶的催化域序列，自N端379-528位氨基酸为Thermolysin金属蛋白酶的alpha螺旋区序列。6、适冷蛋白酶基因hspal的克隆和表达使用上下游引物hspal-XhoI GCGC CTCGAG GGAAAAAGGAACAGATGTCCAAAAG,hspal-Pstl GCGC CTGCAG ATATACTCCTACATTATCCCAA,以Halobacillus sp. SCSIO 20089基因组DNA为模板进行PCR扩增适冷蛋白酶基因 hspal，PCR 反应程序为95°C 5min; 95 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C I. 5min，30 个循环；72°C lOmin，将PCR产物进行琼脂糖电泳，电泳图如图I所示，PCR产物的大小与适冷蛋白酶基因hspal的大小基本一致，割胶回收PCR产物，由此得到适冷蛋白酶基因hspalPCR产物。用限制性内切酶Pst I和Xho I酶切适冷蛋白酶基因hspalPCR产物后，与经Pst I和Xho I酶切的表达载体PWB980进行连接。将连接产物转化至枯草芽孢杆菌WB 600中，涂布到含100 u g/ml氨苄青霉素和含质量分数1%脱脂奶粉的LB培养基平板上筛选阳性克隆，将能在含100 u g/ml氨苄青霉素和含质量分数1%脱脂奶粉的的LB培养基上生长的菌落进一步提取质粒DNA，然后再用内切酶Pst I和Xho I进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其电泳图如图2所示，由图2可以看出，双酶切产物的大小与适冷蛋白酶基因hspal的大小基本一致,进一步测序分析表明，序列与适冷蛋白酶基因hspal的序列一致，验证正确后命名重组质粒为pWB980-hspal。将含有重组质粒pWB980-hspal的Bacillus subtilis WB 600点接种到含1%脱脂奶粉的LB固体培养基平板上，在37°C下培养I天，以转入空质粒PWB980的Bacillussubtilis WB 600作为对照。其生长图如图3所示，由图3表明，含有重组质粒pWB980-hspal的Bacillus subtisffB 600 (图3的左图)能够水解含1%脱脂奶粉的LB固体培养基中的牛奶中的蛋白成份，形成清晰的水解圈，而转入空质粒PWB980的Bacillus subtilis WB 600(图3的右图)则没有，由此可见适冷蛋白酶基因hspal编码的适冷蛋白酶HSPA2能够水解牛奶中的蛋白成份。将含有重组质粒pWB980_hspal的Bacillus subtilis WB 600单菌落接种至5ml含卡纳霉素的LB培养基中，37°C振荡培养过夜。以2%的接种量将过夜培养物转接至superrich培养基中，30°C，200rpm振荡培养40h。9000转/分钟离心10分钟，上清即为含有适冷蛋白酶HSPA2的粗酶液。
7、适冷蛋白酶HSPA2的酶活测定粗酶液经离子交换层析与分子筛凝胶纯化后得到电泳适冷蛋白酶HSPA2纯酶液，纯化过程参照《蛋白质技术手册》，纯酶液的电泳如图4所示。取300iU稀释一定倍数的适冷蛋白酶HSPA2纯酶液，加入到300 ill 2%的酪蛋白溶液中，35°C水浴10分钟后，加入600 u I 0. 4mol/l三氯乙酸溶液,室温静置20min, 12000r/min离心IOmin0取100 U I上清与500iU 0. 4mol/l碳酸钠溶液混合后再加入IOOiU Folin试剂，40°C水浴20min后测定在660nm的吸光值。吸光值测定值与不同含量的酪氨酸吸光度标准曲线图做比较计算酶活。测得适冷蛋白酶HSPA2的酶比活为3077U/mg蛋白(1U定义为在上述条件下每分钟转化生成I U g酪氨酸所需的酶量)。8、蛋白酶HSPA2酶学性质的测定参照步骤7测定酶活的方法，测定适冷蛋白酶HSPA2纯酶液在(T90°C (间隔5°C )下的酶活，以确定最适作用温度。适冷蛋白酶HSPA2的酶活随温度变化如图5所示，从图5可以看出，本发明的适冷蛋白酶HSPA2在低温条件下也具有活性，其最适作用温度为35°C。参照步骤7测定酶活的方法，以不同pH的缓冲液(pH 3. 0-6. 5柠檬酸钠缓冲液；pH 7. 0-8. 0磷酸缓冲液；pH 9. 0-10. 0甘氨酸-NaOH缓冲液)溶解的酪蛋白为底物，测定在不同PH下的酶活，以确定最适作用pH。适冷蛋白酶HSPA2的酶活随pH变化如图6所示，从图6可以看出，本发明的适冷蛋白酶HSPA2的最适作用pH为8.0。综上所述，本发明的适冷蛋白酶HSPA2是一种新的蛋白酶，其编码基因一适冷蛋白酶基因hspal也是一种新的基因。权利要求
1.一种适冷蛋白酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.一种编码权利要求I所述的适冷蛋白酶的基因。
3.根据权利要求2所述的编码适冷蛋白酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO. I 所示。
4.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求2或3所述的编码适冷蛋白酶的基因。
5.一种含有权利要求4所述的表达载体的微生物。
6.权利要求I所述的适冷蛋白酶在蛋白质水解中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种海洋细菌适冷蛋白酶及其编码基因和应用。本发明的适冷蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码所述的适冷蛋白酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供了一种新的编码适冷蛋白酶HSPA2的基因适冷蛋白酶基因hspa1及其编码的适冷蛋白酶HSPA2，该适冷蛋白酶HSPA2具有优良的适冷性能，在蛋白质的水解中具有广泛的用途。
文档编号C12P21/06GK102719421SQ201210180260
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者尹浩, 张偲, 李洁, 杨键, 田新朋, 麦志茂 申请人:中国科学院南海海洋研究所