专利名称：脂解酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过利用所谓的同源基因的家族改组(family shufful)而产生脂解酶多样性的方法。本发明还涉及该方法中所用到的多核苷酸，以及由该多核苷酸编码的脂解酶。
背景技术：
已知Thermomyces lanuginosus(也称Humicola lanuginosa)的脂酶可以用于诸如洗涤剂和烘烤等各种工业目的(EP 258068，WO 9404035)。其氨基酸和DNA序列在US 5869438中显示。
现有技术描述了修饰T.lanuginosus脂酶的氨基酸序列产生变体以达到改变酶特性的目的。因此US 5869438，WO 9522615，WO 9704079和WO0032758公开了利用脂酶基因突变制备所述的变体。WO 0032758还公开了通过PCR反应构建具有T.lanuginosus脂酶主链和尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)磷脂酶C-末端的变体。
Crameri等，1998，Nature，391288-291公开了对来源于多种种属的天然存在的同源基因家族的DNA改组以产生蛋白质的多样性。US 6159687公开了编码T.lanuginosus脂酶变体的基因改组。WO 9841623公开了异源多核苷酸序列的改组。
下面公布的曲霉属菌株的脂解酶的序列与T.lanuginosus脂酶具有49-51％的同一性臭曲霉(A.foetidus)的溶血磷脂酶(EMBL A93428，US6140094)，塔宾曲霉(A.tubingensis)的脂酶(EMBL A84589，WO 9845453)，米曲霉(A.oryzae)的磷脂酶A1(EMBL E16314，EP 575133，JP 10155493 A)和黑曲霉(A.niger)的溶血磷脂酶(EMBL A90761，WO 98/31790)。
R.Lattmann等，Biocatalysis，3(1-2)，137-144(1990)公开了嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)的酯酶。V.W.Ogundero，Mycologia，72(1)，118-126(1980)描述了嗜热踝节菌脂酶的活性。US 4275011和EP 258068中提到源于Thermomyces ibadanensis的脂酶。B.A.Oso，Canadian Journal ofBotany，561840-1843(1978)描述了Talaromyces emersonii脂酶的活性。
发明概述发明人已经分离了与T.lanuginosus脂酶基因具有高度同源性的新的脂解酶基因，极适用于基因改组。该新基因如SEQ ID NO3，5，7，9和11所示。一些蛋白和DNA序列同一性的表格在下面显示。所述的新序列鉴定如下· 源于嗜热踝节菌的Talthe 1MSEQ ID NO3和4。
· 源于Thermomyces ibadanensis的Theiba 1MSEQ ID NO5和6。
· 源于Talaromyces emersonii的Taleme 1MSEQ ID NO7和8。
· 源于Talaromyces byssochlamydoides的Talbys 1MSEQ ID NO9和10。
包括下面已知的序列用于比较·Thelan 1M源于Thermomyces lanuginosus的脂酶，SEQ ID NO1和2。
·Asptub 2M源于塔宾曲霉的脂酶EMBL A84589。
·Aspory 3M源于米曲霉的磷脂酶EMBL E16314。
·Aspnig 2M源于黑曲霉的溶血磷脂酶EMBL A90761。
下面是成熟蛋白的同一性表
下面是编码成熟蛋白的DNA序列(省略终止密码子)的同一性表格
因此，本发明提供一种通过两个或多个同源基因的家族改组产生脂解酶遗传多样性的方法，所述的同源基因编码脂解酶。一个基因编码与T.lanuginosus脂酶具有至少90％同一性的脂解酶，另一个基因编码与T.lanuginosus脂酶具有55-90％同一性的脂解酶。DNA改组技术用于产生嵌合改组基因库，其可在合适的表达载体系统中表达并且筛选有脂解酶活性的表达蛋白。进一步筛选表达的蛋白以鉴定具有改进特性的脂解酶。
本发明还提供一种包含编码脂解酶的核苷酸序列的多核苷酸和脂解酶(具有脂解酶活性的多肽)。
多核苷酸可以是克隆入质粒的DNA序列，该质粒存在于保藏号为DSM14047，14048，14049或14051的大肠杆菌中，可以是编码SEQ ID NO3，5，7或9所示成熟肽的DNA序列或衍生于它们的经过取代，缺失和/或插入一个或多个核苷酸的DNA序列。该多核苷酸与编码SEQ ID NO3所示的成熟肽的DNA序列具有至少90％的同一性，与编码SEQ ID NO5所示的成熟肽的DNA序列具有至少80％的同一性，与编码SEQ ID NO7所示的成熟肽的DNA序列具有至少65％的同一性，与编码SEQ ID NO9所示的成熟肽的DNA序列具有至少60％的同一性。其还可以是编码SEQ ID NO3，5，7或9所示的成熟肽的DNA序列的等位基因变体；或其可以在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO3，5，7或9所示的成熟肽的核酸序列，或其具有至少100个核苷酸的亚序列(subsequence)的互补链杂交。
脂解酶可以由克隆入质粒的DNA序列编码，该质粒存在于保藏号为DSM14047或14049的大肠杆菌中，或可以具有SEQ ID NO6或10所示成熟肽的氨基酸序列，或具有衍生于它们的经过取代，缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。脂解酶可以与SEQ ID NO6的多肽具有至少80％的同一性，与SEQ ID NO10的多肽具有至少60％的同一性。脂解酶可以进一步地与抗纯化形式的SEQ ID NO6或10的成熟肽的抗体进行免疫反应，或可以是SEQ ID NO6或10所示的成熟肽的等位基因变体；或可以由在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO5或9所示的成熟肽的核酸序列，或其具有至少100个核苷酸的亚序列的互补链杂交的核酸序列编码。
图1显示的是实施例7中所使用的PCR方案。
具体实施例方式
基因组DNA的来源使用基于本说明书中的DNA序列所设计的探针，本发明的脂解酶基因可以衍生自踝节菌属(Talaromyces)或Thermomyces属的菌株，尤其是嗜热踝节菌，Thermomyces ibadanensis，Talaromyces emersonii或Talaromycesbyssochlamydoides。
因此，序列表中所示的基因和多肽分离自下面所示的生物。本发明人按照布达佩斯条约在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ-DeutscheSammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg1b，D-38124 Braunschweig DE)保藏了含有该基因的大肠杆菌菌株，如下所示
根据贸易条款，上述来源的生物可以容易地从下面保藏中心得到
DSMZ(德意志微生物和细胞培养物保藏中心Deutsche Sammlung vonMicroorganismen und Zellkulturen GmbH)，MascheroderWeg lb，D-38124Braunschweig DE。
ATCC(美国典型培养物保藏中心American Type Culture Collection)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。
CBS(荷兰真菌菌种保藏中心Centraalbureau voor Schimmelcultures)，Uppsalalaan 8，3584 CT Utrecht，The Netherlands。
UAMH(加拿大阿尔伯达大学植物霉菌培养物保藏中心University ofAlberta Mold Herbarium & Culture Collection)，Devonian Botanic Garden，Edmonton，Alberta，Canada T6G 3GI。
IMI国际微生物研究所(International Mycological Institute)，BakehamLane，Englefield Green，EGHAM，Surrey TW20 9TY，United Kingdom。
多核苷酸用于重组(改组)的多核苷酸是两个或多个编码脂解酶的基因，包括一个与T.lanuginosus脂酶具有至少90％同一性的基因，一个与T.lanuginosus脂酶具有55-90％同一性的基因。这些多核苷酸至少有一个核苷酸不同。
起始材料可以包括SEQ ID NO1，3，5，7和/或9的两个或多个(例如3个，4个或5个)成熟部分。它还可以包括编码两个或多个(例如3个，4个或5个)SEQ ID NO2，4，6，8或10变体的基因，该变体通过缺失，取代，和/或插入一个或多个氨基酸或通过将延伸的肽片段附着在N和/或C-末端得到。T.lanuginosus脂酶变体的实例在例如US 5869438，WO 9522615，WO 9704079和WO 0032758中描述，并且类似的变体可通过在其它序列中改变相应的氨基酸得到。
基因中的内含子可以任选地在改组前除去。
DNA重组(改组)在两个或多个同源输入型多核苷酸(input polynucleotides)(起点多核苷酸)间的改组涉及片段化该多核苷酸并重组所述的片段，以获得输出型(output)多核苷酸(即已经过改组循环的多核苷酸)，与输入型多核苷酸相比其中已经有许多核苷酸片段发生了交换。
DNA重组或改组可以是(部分)随机方法，其中，嵌合基因库从两个或多个起始基因产生的。可利用多种已知的形式实施该改组或重组方法。
该方法涉及亲代DNA随机片段化，接着通过PCR重新组装成新的全长基因，例如US5605793，US5811238，US5830721，US6117679中所述。基因的体外重组可以按照例如如US6159687，WO98/41623，US6159688，US5965408，US6153510中所述的实施。重组的方法可以在体内例如如WO97/07205和WO 98/28416中所述在活细胞中进行。
亲代DNA可以通过DNA酶I处理或如Kikuchi等(2000a，Gene 236159-167)所述的用限制性核酸内切酶消化成片段。如Kikuchi等(2000b，Gene 243133-137)所述两个亲代的改组可以通过改组两亲代的单链亲代DNA进行。
具体的改组方法按在Crameri等，1998，Nature，391288-291和Ness等Nature Biotechnology 17893-896中所述的方法进行。其它的方法描述在US6159687实施例1和2。
脂解酶特性本发明得到的脂解酶能水解羧酸酯键，根据酶分类命名法1992Academic Press，Inc分类为EC 3.1.1。它特别具有脂酶(三酰基甘油脂酶)(EC3.1.1.3)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)，磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)，胆固醇酯酶(EC3.1.1.13)和/或半乳糖脂酶(EC 3.1.1.26)的活性。
热稳定性通过差示扫描量热器(DSC)评价。与现有技术的T.lanuginosus脂酶的稍高于70℃的变性峰相比，在pH5，以90deg/hr加热时，来源于T.ibadanensis脂解酶的变性峰(Td)稍高于75℃的温度。来源于T.ibadanensis的脂解酶在碱性pH最佳的活性(类似于T.lanuginosus脂酶)，且其等电点约4.3(比T.lanuginosus脂酶稍低)。
同源性和序列对比SEQ ID NO2，4，6，8和10成熟部分的最好的序列对比通过在SEQ IDNO2，4和6的Q249和P/G250之间插入一个氨基酸的缺口得到。
这种序列对比确定相应的氨基酸。
同源性程度可以通过本领域已知的计算机程序诸如GCG程序包中提供的GAP进行测定(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-45)，利用GAP进行多肽序列比较时采用下列设定值GAP生成罚分(creation penalty)为3.0和GAP延伸罚分(extension penalty)为0.1。
还可以使用来自fasta package version v20u6的Align进行同源性的测定。Align是Needleman-Wunsch序列对比(即总体序列对比)，用于蛋白质和DNA的序列对比。默认得分矩阵(default scoring matrices)BLOSUM50和同一性矩阵(identity matrix)分别用于蛋白质和DNA的序列对比。缺口中的第一个残基的罚分对于蛋白质是-12，对于DNA是-16。而缺口中的其它残基的罚分对于蛋白质是-2，对于DNA是-4。
本说明书中所讨论的同源性可以相当于是具有至少60％同源性，尤其至少是70％或至少是80％的同一性，例如至少90％或至少95％的同一性。
脂解酶的用途根据底物的特异性，本发明的酶可以用于例如改进过滤，植物油的处理，烘烤，洗涤剂或制备溶血磷脂。因此，根据现有技术类推，它还可以具有脂解酶已知的用途，例如*在纸浆和造纸工业中，用以除去树脂(pitch)或从用过的纸除去墨水。WO 9213130，WO 9207138，JP 2160984 A，EP 374700。
*烘烤。WO 94/04035，WO 00/32758。
*洗涤剂。WO 97/04079，WO 97/07202，WO 97/41212，WO 98/08939和WO 97/43375。
*皮革工业。GB 2233665，EP 505920。
*具有脂酶活性的酶可以用于脂水解和修饰甘油三酯以及制备甘油一酯和甘油二酯。
*具有脂酶活性的酶可以用于大多数脂肪的酯交换，制备炸用脂油，起酥油和人造奶油成分。
*具有磷脂酶(A1，A2)活性的酶可以用于植物油的脱胶和制备溶血磷脂。
改进滤清(filtration)具有溶血磷脂酶活性的酶可以用于改进碳水化合物源的水溶液或浆的滤过性，是通过用变体处理进行的。这特别适用于包含淀粉水解产物尤其是小麦淀粉水解产物(由于这往往是很难过滤的并且过滤后是浑浊的滤液)的溶液或浆。该处理可以类似于EP 219,269(CPC International)进行。
洗涤剂由本发明制备的脂解酶可以用作洗涤剂添加剂，例如浓度(表示为纯酶蛋白)为0.001-10(例如0.01-1)mg/g洗涤剂或0.001-100(例如0.01-10)mg/l的洗涤溶液。
本发明的洗涤剂组合物可以例如配制成手洗或机洗洗涤剂组合物，包括适合用于污染织物预处理的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，或制成通常家庭硬表面清洗操作中使用的洗涤剂组合物。在洗衣洗涤剂中，该变体可以有效地除去脂污染，保持洁白和除脏。洗衣洗涤剂组合物可以按照WO 97/04079，WO 97/07202，WO 97/41212，PCT/DK WO98/08939和WO 97/43375中所述制成。
本发明洗涤剂组合物尤其可以配制用于在手洗或机洗餐具洗涤过程中使用，如GB 2,247,025(Unilever)或WO 99/01531(Procter & Gamble)中所述。在餐具洗涤组合物中，该变体可有效地除去油脂/油污，有效地防止高色成分对餐具和餐具清洗机塑料成分的染色/变色和避免钙皂在餐具表面的沉积。
本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如可以是棒，片，粉末，颗粒，糊或液体。液体洗涤剂可以是水溶液，通常包含70％水和0-30％有机溶剂或非水物。
洗涤剂组合物包括一种或多种表面活性剂，其可以是包括半极性的非离子物质和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子物质。表面活性物存在的通常的重量比为0.1％-60％，例如0.5-40％，例如1-30％，典型的是1.5-20％。
生面团和烘烤产品脂解酶可在生面团和由生面团制得的烘烤产品例如面包和蛋糕的制备中使用，以提高生面团的稳定性和生面团的可操作性能，或改进面包或蛋糕的弹性。因此，它可以在制备面包的方法中使用，包括将它添加到生面团成分中，揉捏并烘培该面团以制成面包。可以按照US 4,567,046(KyowaHakko)，JP-A 60-78529(QP Corp.)，JP-A 62-111629(QP Corp.)，JP-A63-258528(QP Corp.)或EP 426211(Unilever)中所述操作。与WO 99/53769(Novo Nordisk)类似，脂解酶可以和抗变味(anti-staling)淀粉酶尤其是内淀粉酶诸如麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase)一起使用。因此脂解酶可以掺入面粉组合物例如生面团或生面团的预拌和料(premix)中。
材料与方法菌株和质粒质粒pMT2188米曲霉(Aspergillus oryzae)表达质粒pCaHj 483(WO 98/00529)由表达盒组成，该表达盒基于与构巢曲霉(Aspergillus nidulans)丙糖磷酸异构酶非翻译的前导序列(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉糖苷酶终止子(Tamg)融合的黑曲霉(Aspergillus niger)中性淀粉酶II启动子。来源于能在以乙酰胺为唯一氮源下生长的构巢曲霉的曲霉选择性标记amdS也存在于该质粒中。将这些元件克隆入大肠杆菌载体pUC19(New England Biolabs)。用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的URA3标记替换能在该质粒的大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性标记，URA3标记可以弥补大肠杆菌中的pyrF突变，这种替换按照下面的方式进行自pCaHj483用引物142779(SEQ ID NO35)和142780(SEQ ID NO36)PCR扩增pUC19的复制起点。
引物142780在PCR片段中引入Bbul位点。按照制造商的说明使用Expand PCR系统(Roche Molecular Biochemicals，Basel，Switserland)进行该引入以及后面的PCR扩增。
使用引物140288(SEQ ID NO37)和142778(SEQ ID NO38)自一般的酿酒酵母克隆载体pYES2(Invitrogen corporation，Carlsbad，Ca，USA)扩增URA3基因。
引物140288在PCR片段中引入EcoRl位点。这两种PCR片段通过将它们混合并使用引物142780和140288扩增由重叠的方法在剪接中得以融合(Horton et al(1989)Gene，77，61-68)。
所得的片段用EcoRI和BbuI消化并连接到用相同的酶消化的最大的pCaHj 483片段。连接的混合物用于转化用Mandel和Higa(Mandel，M.andA.Higa(1970)J.Mol.Biol.45，154)的方法制备的感受态pyrF大肠杆菌菌株DB6507(ATCC 35673)。在添加有1g/l酪蛋白氨基酸，500μg/l硫铵和10mg/l卡那霉素的固体M9培养基(Sambrook et.al(1989)Molecularcloning，a laboratory manual，2.edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)上筛选转化体。
来自所筛选的转化体的质粒命名为pCaHj 527。将存在于pCaHj527上的Pna2/tpi启动子通过单PCR方法进行定点突变。
使用致突变引物141223(SEQ ID NO41)将核苷酸134-144自SEQ IDNO39改变为SEQ ID NO40。
使用致突变引物141222(SEQ ID 44)将核苷酸423-436自SEQ ID NO42改变为SEQ ID NO43。
所得的质粒命名为pMT2188。
质粒pENI1861制备质粒pENI1861使其在表达质粒中具有曲霉属菌株启动子作用状态以及具有许多用于克隆的唯一的限制性位点。
利用pMT2188(见上)作为模板以及利用引物051199J1(SEQ ID 45)和1298TAKA(SEQ ID 46)制备PCR片段(约620bp)。
用BssHII和Bgl II切割，并克隆入同样用BssHII和Bgl II切割的pENI1849。所述克隆通过测序验证。制备质粒pENI1902以使其具有的启动子可以在大肠杆菌和曲霉菌属菌株中起作用。这可利用Stratagene推荐的″Chameleon双链定点突变试剂盒″通过唯一位点的消除来进行。
质粒pENI1861质粒pENI1861用作模板并且下面具有5′磷酸化的引物用作筛选引物177996(SEQ ID 47)，135640(SEQ ID 48)和135638(SEQ ID 49)。
具有5′磷酸化的080399J19引物(SEQ ID NO50)用作突变引物以在曲霉属菌株表达载体中引入-35和-10启动子共有序列(自大肠杆菌)。引入的突变通过测序验证。
质粒pENI1960利用Gateway VectorTM转化系统(Lifetechnology cat no.11828-019)制备质粒pENI1960，是通过用BamHI切割pENI1902，使用Klenow片段聚合酶和核苷酸填充DNA末端(由此制备钝末端)，接着连接到读框A GatewayTMPCR片段进行的。通过测序证实处于正确方向的克隆。
培养基和底物YPG4g/L酵母提取物，1g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4-7aq，5g/L葡萄糖，pH6.0。
实施例实施例1携带脂解酶基因的质粒制备基因组DNA使用Thermomyces ibadanensis，Talaromyces emersonii，Talaromycesbyssochlamydoides和嗜热踝节菌菌株作为基因组DNA供体。将各菌株在100ml的YPG中于合适的温度培养几天。收获菌丝体并在液氮中研磨。用2ml的其中包括100mM NaCl，25mM EDTA和1％SDS的50mM Tris-HCI(pH8.0)缓冲液悬浮，然后添加12μl蛋白酶K(25mg/ml)。悬浮液于65℃温育30-60分钟。进行酚提取以除去蛋白质而DNA通过0.7体积的异丙醇沉淀。用已灭菌的水溶解沉淀并添加RNase。酚/异戊醇提取后，DNA通过EtOH沉淀。
PCR筛选脂解酶基因用基于脂解酶对比而设计的HL 2和HL12(SEQ ID NO51和52)或HL2和HL6(SEQ ID NO51和53)进行各基因组DNA的PCR反应。
将反应成分(2.6ng/μl基因组DNA，250mM各dNTP，引物各250nM，1X缓冲液中的(Roche Diagnostics，Japan)0.1U/μlTaq聚合酶)混合并在下面的条件下进行PCR。
步骤1到3重复30次。
分别由引物组HL2/H 12和HL2/HL6扩增540bp片段和380bp片段。用GFXTMPCR DNA和Gel Band Purification试剂盒(amersham pharmaciabiotech)对它们进行凝胶纯化。对各DNA测序并与脂酶比较，显示克隆编码脂酶的内部部分。
克隆脂酶基因按照制造商的说明使用LA PCRTM体外克隆试剂盒(TaKaRa)克隆所有的脂酶基因。因此，用各种限制性内切酶切割基因组DNA并且将各DNA连接到试剂盒中合适的表达盒。将各种连接溶液应用于PCR，所用引物为按照内部序列设计的引物和试剂盒的表达盒引物。对扩增的DAN片段测序。重复该步骤直到确定ORF。
试剂盒LA-taq聚合酶的保真性不好，所以为得到正确的序列按照制造商的说明通过Expand高保真性聚合酶扩增全部基因。
扩增的DNA片段用GFXTMPCR DNA和Gel Band纯化试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)进行凝胶纯化并用ligation high(TOYOBO，日本)连接到pT7Blue载体或pST BLue-1 AccepTor载体(Novagen)。将连接混合物转化入大肠杆菌JM109或DH5α。测定各基因4种质粒的序列并且比较它们的序列。大多数的序列确定为正确的核苷酸序列。
实施例2脂酶克隆入曲霉菌表达载体在下面的反应中进行3种不同的PCR反应，使用PWO聚合酶(94℃5分钟，30*(94℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟)，72℃5分钟)。在各情形中，模板为如实施例1中制备的携带脂解酶基因的质粒，使用下面的引物A具有来自嗜热踝节菌的基因的质粒和寡05 1200j1/051200j8(SEQ IDNO11和18)。
B具有来自Talaromyces emersonii的基因的质粒和寡051200j9/051200j16(SEQ ID NO19和26)。
C具有来自Thermomyces Ibadanensis的基因的质粒和寡051200j17/051200j24(SEQ ID NO27和34)。
自1％琼脂糖凝胶对PCR片段进行电泳并纯化，如供货商(LifeTechnologies)所推荐的使用Gateway克隆法克隆入pENI1960(参见上述)，转化入大肠杆菌DH10b(Life Technologies，Gaithersburg，MD)并测序，由此生成pENI 2146(Talaromyces emersonii脂酶基因)，pENI2147(ThermomycesIbadanensis脂酶基因)和pENI2148(嗜热踝节菌脂酶基因)将它们转化入JaI250(在WO 00/39322中描述)而且如专利WO 00/24883中所提到的鉴定脂酶活性。
实施例3构建内含子较少的脂酶基因自Talaromvces thermophilus脂酶基因中除去内含子使用PWO聚合酶和利用pENI2148为模板以及下面的寡核苷酸(oligoes)进行4项PCR反应(94℃，5分钟；30*(94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟)；72℃，5分钟)1051200j1和051200j3(SEQ ID NO11和13)。
2051200j2和051200j5(SEQ ID NO12和15)。
3051200j4和051200j7(SEQ ID NO14和17)。
4051200j6和051200j8(SEQ ID NO16和18)。
自1.5％琼脂糖凝胶纯化所得到的特异带。将等量PCR片段与PWO聚合酶，缓冲液，dNTP，寡051200j1和051200j8(SEQ ID NO11和18，总量为50μl，按照供应商Boehringer Mannheim的推荐)混合，进行第二次的PCR(94℃，5分钟；30*(94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，2分钟)；72℃，5分钟)。
在1.5％琼脂糖凝胶上检测正确大小的(约900bp)带并且其它的PCR-片段使用Biorad spin柱(cat no.732-6225)纯化。
使用厂商(Life Technologies)推荐的Gateway克隆的方法将PCR-片段克隆入用ScaI(以切割ccdB基因)切割的pENI1960，转化大肠杆菌DH10b并测序，由此生成内含子较少的嗜热踝节菌脂酶基因。
从Talaromvces emersonii脂酶基因中去除内含子使用PWO聚合酶和利用pENI2146为模板以及下面的寡核苷酸进行4项PCR反应(94℃，5分钟；30*(94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟)；72℃，5分钟)1051200j9和051200j11(SEQ ID NO19和21)。
2051200j10和051200j13(SEQ ID NO20和23)。
3051200j12和051200j15(SEQ ID NO22和25)。
4051200j14和051200j16(SEQ ID NO24和26)。
自1.5％琼脂糖凝胶纯化所得到的特异带。将等量PCR片段与PWO聚合酶，缓冲液，dNTP，寡051200j9和051200j16(SEQ ID NO19和26，总量为50μl，按照供应商的推荐)混合，进行第二次的PCR(94℃，5分钟；30*(94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，2分钟)；72℃，5分钟)。
在1.5％琼脂糖凝胶上检测正确大小的(约900bp)带并且其它的PCR-片段使用Biorad spin柱纯化。
使用厂商(Life Technologies)推荐的Gateway克隆的方法将PCR-片段克隆入用ScaI切割的pENI1960，转化入大肠杆菌DH10b并测序，由此生成内含子较少的Talaromyces emersonii脂酶基因。
从Talaromvces Ibadanensis脂酶基因中去除内含子使用PWO聚合酶和利用pENI2147为模板以及下面的寡核苷酸进行4项PCR反应(94℃，5分钟；30*(94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，1分钟)；72℃，5分钟)。1051200j17和051200j19(SEQ ID NO27和29)。
2051200j18和051200j21(SEQ ID NO28和31)。
3051200j20和051200j23(SEQ ID NO30和33)。
4051200j22和051200j24(SEQ ID NO32和34)。
自1.5％琼脂糖凝胶纯化所得到的特异带。将等量PCR片段与PWO聚合酶，缓冲液，dNTP，寡051200j17和051200j24(SEQ IDNO27和34，总量为50μl，按照供应商Boehringer Mannheim的推荐)混合，进行第二次的PCR(94℃，5分钟；30*(94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，2分钟)；72℃，5分钟)。
在1.5％琼脂糖凝胶上检测正确大小的(约900bp)带并且其它的PCR-片段使用Biorad spin柱纯化。
使用厂商(Life Technologies)推荐的Gateway克隆的方法将PCR-片段克隆入用ScaI切割的pENI1960，转化大肠杆菌DH10b并测序，由此生成内含子较少的Talaromyces Ibadanensis脂酶基因实施例4脂解酶基因的改组包含编码脂解酶的DNA序列的质粒等摩尔混合。下面的成分在微量管中混合2μl质粒混合物(0.15μg/μl)，侧接该基因的特异引物(1pmol/μ，2μl 2.5mM dNTP，2.5mM MgCl2，2μl 10*taq缓冲液(Perkin Elmer)，0.5μl taq酶，总体积为20μl。
将管放置在Perkin Elmer 2400热循环仪上，运行下面的PCR-程序(94℃，5分钟)1个循环(94℃，30秒，70℃，0秒)99个循环(72℃，2分钟，4℃不限定)1个循环。
将PCR反应的产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。从琼脂糖凝胶上切下特定预测长度的DNA泳带，使用JETsorb(来自GENOMED Inc.)纯化。将纯化的PCR产物克隆入TA-载体(来自Invitrogen(最初的TA克隆试剂盒)。将连接产物转化入标准的大肠杆菌菌株(DH5a)。
然后将改组序列自大肠杆菌TA载体亚克隆入酵母载体pJS0026(WO9928448)为BamHI-XbaI片段(见WO 97/07205)，并且例如筛选具有改进特性的新改组的序列，所述特性例如在洗涤剂中改进的性能(见WO97/07205)。
实施例5脂解酶基因的改组如前面实施例所述制备脂解酶基因的PCR产物并以等摩尔汇聚。在合适的管中制备下面的混合物1μl PCR混合物(0.1μg)，十聚体(decamer)随机引物，(300pmol)，2μl10*Klenow缓冲液(Promega)，0.25mM dNTP，2.5mMMgCl2，总体积为20μl。
将混合物置于PE 2400热循环仪中，运行下面的程序96℃，5分钟，25℃，5分钟，添加0.5ml Klenow酶，25℃，60分钟，35℃，90分钟。
这种方法产生大量小的源于该基因所有部分的DNA聚合物。
取出10μl用于在琼脂糖凝胶上检测。
将10μl PCR混合物(0.25mM dNTP，1μl 10*Taq缓冲液(PerkinElmer)，2.5mM MgCl2，0.5μl Taq酶)添加到热循环仪的管中至10μl。然后运行下面的标准PCR程序(94℃，5分钟)1个循环，(94℃，30秒，45℃，30秒，72℃，30秒)25个循环，72℃，7分钟，4℃不限定。
将PCR反应的产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。观察到清晰的不偏的成片条带。在400和800bp间的DNA自凝胶中分离。
一半该纯化的PCR产物在管中与侧接于目的基因的两种特异引物(40pmol)，0.25mM dNTP，2μl10*Taq缓冲液，2.5mM MgCl2混合。然后运行下面的标准PCR程序(94℃，5分钟)1个循环，(94℃，30秒，50℃，30秒，72℃，30秒)25个循环，72℃，7分钟，4℃不限定。
将PCR反应的产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。分离所需大小的带。使用特异引物再进行其它的PCR(如上面所提到的)以在克隆前扩增PCR产物。
PCR产物和所需的载体用合适的限制酶(BamHI/XhoI)切割。将载体和PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳并且从胶中纯化。
切割的PCR产物和切割的载体在连接缓冲液中与T4 DNA连接酶(Promega)混合。在16℃过夜连接后，将该混合物转化到大肠杆菌菌株DH5a。
实施例6生成内含子较少的脂酶基因将许多与Thermomyces lanuginosus脂酶基因具有同源性的脂酶基因克隆。这些基因克隆为基因组DNA并因此已知包含内含子。
本发明改组这些基因以获得嵌合基因。为最大可能的获得高质量的库，必须要除去内含子。这通过生成与外显子的各侧翼序列匹配并且与下一个相邻的外显子具有同源性的DNA寡核苷酸进行的。
这些寡核苷酸用于标准的PCR中(本领域的技术人员已知)，由此生成PCR片段携带有基因中的每个外显子(编码序列)。在1％琼脂糖凝胶上纯化这些PCR片段。在第二次PCR中使用侧翼于整个基因的DNA寡核苷酸为引物，将这些PCR片段装配成全长基因。
如专利申请PCT/DK02/00050所述，将包含内含子较少的编码脂酶的全长基因的PCR片段克隆入pENI 1960。
下面的引物用于组装各内含子较少的基因嗜热踝节菌051200j1，051200J2，051200J3，051200J4，051200J5，051200J6，051200J7和051200J8(SEQ ID NO11-18)，从而在克隆入pENI1960时生成pENI2178。
Talaromyces emersonii051200J9，051200J10，051200J11，051200J12，051200J13，051200J14，051200J15和051200J16(SEQ ID NO19-26)，在克隆入pENI1960时由此生成pENI2159。
Thermomyces ibadanensis051200J 17，051200J 18，051200J 19，051200J20，051200J21，051200J22，051200J23和051200J24(SEQ ID NO27-34)，在克隆入pENI1960时由此生成pENI2160。
Talaromyces byssochlamydoides080201 P1，080201 P2，080201 P3，080201 P4，080201 P5，080201 P6，080201 P7和080201 P8(SEQ ID NO54-61)，在克隆入pENI1960时由此生成pENI2230。
实施例7改组内含子较少的脂酶基因实施使用dUTP和尿嘧啶-DNA糖基化酶的方法以制备充足量的DNA片段进行DNA改组。3种基因T.lanuginosus，嗜热踝节菌和T.ibadanensis彼此间具有极大的同源性(由此命名为组A)，同样地T.emersonii和T.byssochlamydoides也具有极大的同源性(命名为组B)。由此为了改进在两组间的重组而实施下面的PCR方案(见图1)，利用下述的作为模板pENI2178，pENI2159，pENI2160，pENI2230，并且将T.lanuginosus基因克隆入pENI1902(BamHI和SacII切割)(专利PCT/DK02/00050)。
下面的寡核苷酸在图1中显示1298-taka，19670，19672，115120和050401 P6(SEQ ID NO62-65和68)。050401 P1(SEQ ID NO66)与5′T.lanuginose脂酶基因杂交。030501 P1(SEQ ID NO67)与其它4种脂酶基因的5′杂交。
最终的PCR片段首先用BstEII切割然后用SfiI切割，同样地切割载体pENI2376。pEM2376是pENI1861的衍生物(专利PCT/DK02/00050)。
将载体和PCR片段在1％凝胶中纯化并过夜连接。将连接的DNA库转化到电致感受态大肠杆菌细胞DH10B，由此生成约700.000个独立的克隆的库。
针对各种底物诸如卵磷脂，DGDG，甘油三酸酯例如三丁酸甘油酯，橄榄油，PNP-戊酸酯或PNP-棕榈酸酯的活性可在不同条件如高pH，低pH，高温，在有洗涤剂，在有离子或没有离子的条件下筛选所述的库。
这种筛选可用来发现例如热稳定脂酶，洗涤剂磷脂酶，具有首洗性能的洗涤剂脂酶，和在中性PH时没有活性的洗涤剂脂酶等。
DNA-寡核苷酸(oligoes)1298-takagcaagcgcgcgcaatacatggtgttttgatcat19670ccccatcctttaactatagcg19672ccacacttctcttccttcctc115120gctttgtgcagggtaaatc050401P1cggccgggccgcggaggccagggatccaccatgaggagctcccttgtgctg030501P1cggccgggccgcggaggccacaagtttgtacaaaaaagcagg(与其它4种脂酶基因5′杂交)050401P6cggccgggtcaccccccatcctttaactatagcg实施例8脂解酶的特征Thermomyces ibadanensis和嗜热踝节菌脂解酶按照上述制备，纯化并用于鉴定特征。
特异性脂酶活性通过WO 0032758中所述的LU方法测定，用280nm的最佳密度测定脂酶蛋白的量。对于Th.ibadanensis脂酶发现特异性活性为3181LU/mg和嗜热踝节菌脂酶为1000LU/mg。
通过LU方法在pH5，6，7，8，9和10测定脂酶寻找pH-活性之间的关系。两种酶在pH10均有最高的脂酶活性。Th.ibadanensis脂酶显示宽的适宜度，在pH6-10时其活性高于最大活性的50％，而嗜热踝节菌脂酶在较低pH时活性降低较大，在pH5-8时其活性低于最大活性的30％。
通过差示扫描量热法(DSC)在pH5(50mM醋酸缓冲液)，pH7(50mMHEPES缓冲液)和pH10(50mM甘氨酸缓冲液)时，以90℃/小时的扫描率测定热稳定性。在变性峰顶的温度(Td)如下
实施例9溶血磷脂酶活性通过在pH5和7温育作为底物的溶血卵磷脂，检测纯化自T.ibadanensis和嗜热踝节菌的脂解酶，使用NEFA试剂盒了解反应的程度。
结果显示来自T.ibadanensis的酶在pH5显示高的溶血磷脂脂酶活性并在pH7显示一些活性。来自嗜热踝节菌的酶显示微活性。
仅用于接受局
仅用于国际局
序列表<110>诺维信公司(Novozymes A/S)<120>脂解酶基因<130>10130<160>68<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>918<212>DNA<213>Thermomyces lanuginosus<220>
<221>CDS<222>(1)..(873)<223>
<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(66)<223>
<220>
<221>mat_peptide<222>(67)..()<223>
<400>1atg agg agc tcc ctt gtg ctg ttc ttt gtc tct gcg tgg acg gcc ttg 48Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu-20 -15 -10gcc agt cct att cgt cga gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttc 96Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe-5 -1 1 5 10aat ctc ttt gca cag tat tct gca gcc gca tac tgc gga aaa aac aat144Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn15 20 25gat gcc cca gct ggt aca aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc ccc192Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro30 35 40gag gta gag aag gcg gat gca acg ttt ctc tac tcg ttt gaa gac tct240Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser45 50 55gga gtg ggc gat gtc acc ggc ttc ctt gct ctc gac aac acg aac aaa288Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys60 65 70ttg atc gtc ctc tct ttc cgt ggc tct cgt tcc ata gag aac tgg atc336
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-20 -15 -10Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe-5 -1 1 5 10Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn15 20 25Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro30 35 40Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser45 50 55Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys60 65 70Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile75 80 85 90Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly95 100 105Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp110 115 120Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr125 130 135Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val140 145 150Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser155 160 165 170Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr175 180 185Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile190 195 200Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro205 210 215
Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp220 225 230Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro235 240 245 250Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly255 260 265Thr Cys Leu<210>3<211>1083<212>DNA<213>嗜热踝节菌属(Talaromyces thermophilus)<220>
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<220>
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<220>
<221>CDS<222>(370)..(703)<223>
<220>
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<220>
<221>mat_peptide<222>(67)..()<223>
<400>3atg agg agc tcg ctc gtg ctg ttc ttc gtt tct gcg tgg acg gcc ttg 48Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu-20 -15 -10gcc agt cct gtc cga cga g gtatgtaaat cacggggtat acttttcatg 97Ala Ser Pro Val Arg Arg-5 -1cattgcatgt cgaacctgct gtactaagat tgcgcgcaca g ag gtc tcg cag gat 152Glu Val Ser Gln Asp
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175 180 185acc ggc ggc acc ttg tac cgc atc acc cac acc aat gat att gtc ccc885Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro190 195 200aga ctc ccg cca cgc gaa ttg ggt tac agc cat tct agc cca gag tat933Arg Leu Pro Pro Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr205 210 215 220tgg atc acg tct gga acc ctc gtc cca gtg acc aag aac gat atc gtc981Trp Ile Thr Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp Ile Val225 230 235aag gtg gag ggc atc gat tcc acc gat gga aac aac cag cca aat acc 1029Lys Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn Thr240 245 250ccg gac att gct gcg cac cta tgg tac ttc ggg tca atg gcg acg tgt 1077Pro Asp Ile Ala Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Ser Met Ala Thr Cys255 260 265ttg taa 1083Leu<210>4<211>291<212>PRT<213>嗜热踝节菌属(Talaromyces thermophilus)<400>4Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu-20 -15 -10Ala Ser Pro Val Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe-5 -1 1 5 10Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn15 20 25Asp Ala Pro Ala Gly Gly Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro30 35 40Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser45 50 55Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg60 65 70Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400>5atg cgg agc tcc ctc gtg ctg ttc ttc ctc tct gcg tgg acg gcc ttg 48Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Leu Ser Ala Trp Thr Ala Leu-20 -15 -10gcg cgg cct gtt cga cga g gtatgtagca agggacacta ttacatgttg97Ala Arg Pro Val Arg Arg-5 -1accttggtga ttctaagact gcatgcgcag cg gtt ccg caa gat ctg ctc gac 150Ala Val Pro Gln Asp Leu Leu Asp5cag ttt gaa ctc ttt tca caa tat tcg gcg gcc gca tac tgt gcg gca 198Gln Phe Glu Leu Phe Ser Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Ala10 15 20aac aat cat gct cca gtg ggc tca gac gta acg tgc tcg gag aat gtc 246Asn Asn His Ala Pro Val Gly Ser Asp Val Thr Cys Ser Glu Asn Val25 30 35 40tgc cct gag gta gat gcg gcg gac gca acg ttt ctc tat tct ttt gaa 294Cys Pro Glu Val Asp Ala Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu45 50 55ga gtgggtgtcg acaaagcaca gagacagtag tagagacagc agtctaactg 346Aspagatgtgcag t tct gga tta ggc gat gtt acc ggc ctt ctc gct ctc gac 396Ser Gly Leu Gly Asp Val Thr Gly Leu Leu Ala Leu Asp60 65 70aac acg aat aaa ctg atc gtc ctc tct ttc cgc ggc tct cgc tca gta 444Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Val75 80 85
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<221>misc_feature<223>050401P6<400>68cggccgggtc accccccatc ctttaactat agcg 3权利要求
1.一种制备脂解酶的方法，包括a)改组至少两种多核苷酸，包括i)一种编码多肽的多核苷酸，该多肽具有脂解酶的活性并且具有与SEQ ID NO2的成熟肽具有至少90％同一性的氨基酸序列，和ii)一种编码多肽的多核苷酸，该多肽具有脂解酶的活性并且具有与SEQ ID NO2的成熟肽具有55-90％同一性的氨基酸序列，b)表达该改组多核苷酸以形成重组多肽，c)筛选该多肽以选择具有脂解酶活性的多肽，和d)制备所选择的多肽。
2.权利要求1的方法，其中由(ii)多核苷酸编码的氨基酸序列与SEQ IDNO4，6，8或10的成熟部分具有至少90％的同一性。
3.权利要求1或2的方法，其中所述多核苷酸包括这样的多核苷酸，其具有与SEQ ID NO1，3，5，7或9的成熟部分有至少90％同一性的核苷酸序列。
4.一种多核苷酸，包括编码脂解酶的核苷酸序列，并且其a)是克隆入保藏号DSM 14047，14048，14049，或14051的大肠杆菌中的质粒中的DNA序列，或b)是编码SEQ ID NO3，5，7或9所示成熟肽的DNA序列或衍生于它们的一个或多个核苷酸发生取代，缺失和/或插入的DNA序列，或c)与编码SEQ ID NO3所示的成熟肽的DNA序列具有至少90％的同一性，与编码SEQ ID NO5所示的成熟肽的DNA序列具有至少80％的同一性，与编码SEQ ID NO7所示的成熟肽的DNA序列具有至少65％的同一性，与编码SEQ ID NO9所示的成熟肽的DNA序列具有至少60％的同一性，或d)是编码SEQ ID NO3，5，7或9所示的成熟肽的DNA序列的等位基因变体；或e)在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO3，5，7或9所示成熟肽的核酸序列其或其具有至少100个核苷酸的亚序列的互补链杂交。
5.权利要求4中的多核苷酸，进一步包括一个或多个控制序列，该控制序列可操纵地与所述的核苷酸序列连接，并且能够在合适的表达宿主中指导脂解酶的表达。
6.一种重组表达载体，包括权利要求5的多核苷酸，启动子和转录与翻译终止信号。
7.一种重组宿主细胞，转化有权利要求5的多核苷酸或权利要求6的载体。
8.一种制备具有脂解酶活性的多肽的方法，包括在适宜制备该多肽的条件下培养权利要求7的宿主细胞，并且回收该多肽。
9.一种多肽，具有脂解酶活性并且f)由克隆入保藏号DSM 14047或14049的大肠杆菌的质粒中的DNA序列编码，或g)具有SEQ ID NO6或10所示成熟肽的氨基酸序列，或衍生于它们的一个或多个氨基酸发生取代，缺失和/或插入的氨基酸序列，或h)具有与SEQ ID NO6的成熟肽具有至少80％同一性或与SEQ ID NO10的成熟肽具有至少60％同一性的氨基酸序列，或i)能与抗纯化形式的SEQ ID NO6或10的成熟肽的抗体进行免疫反应，或j)是SEQ ID NO6或10所示的成熟肽的等位基因变体；或k)由在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO5或9所示的成熟肽的核酸序列，或其具有至少100个核苷酸的亚序列的互补链杂交的核酸序列编码。
10.权利要求9的多肽，是Talaromyces或Thermomyces，尤其是Thermomyces ibadanensis或Talaromyces byssochlamydoides菌株天然的。
11.一种核酸序列，包括编码权利要求9或10多肽的核酸序列。
12.一种水解溶血磷脂中脂酰基的方法，包括用多肽处理溶血磷脂，该多肽具有溶血磷脂酶的活性并且其a)由克隆入保藏号DSM 14047，14048，14049，或14051的大肠杆菌中的质粒中的DNA序列编码，或b)具有编码SEQ IDNO4，6，8或10所示成熟肽的氨基酸序列，或衍生于它们的一个或多个氨基酸发生取代，缺失和/或插入的氨基酸序列，或c)具有与SEQ ID NO4，6，8或10所示成熟肽有至少55％同一性的氨基酸序列，或d)能与抗纯化形式的SEQ ID NO4，6，8或10的成熟肽的抗体进行免疫反应，或e)是SEQ ID NO4，6，8或10的成熟肽的等位基因变体；或f)由在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO3，5，7或9所示的成熟肽的核酸序列，或其具有至少100个核苷酸的亚序列的互补链杂交的核酸序列编码。
13.权利要求12的方法，用以改进包含溶血磷脂的碳水化合物源的水溶液或浆的滤过性。
14.前述权利要求任一项的方法，其中所述的溶液或浆包含淀粉水解物，尤其是小麦淀粉水解物。
15.一种洗涤剂组合物，包含表面活性剂和具有脂解酶活性的多肽，并且该多肽a)由克隆入保藏号DSM 14047，14048，14049，或14051的大肠杆菌中的质粒中的DNA序列编码，或b)具有编码SEQ ID NO4，6，8或10所示成熟肽的氨基酸序列，或衍生于它们的一个或多个氨基酸发生取代，缺失和/或插入的氨基酸序列，或c)具有与SEQ ID NO4，6，8或10所示成熟肽有至少55％同一性的氨基酸序列，或d)能与抗纯化形式的SEQ ID NO4，6，8或10的成熟肽的抗体进行免疫反应，或e)是SEQ ID NO4，6，8或10的成熟肽的等位基因变体；或f)由在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO3，5，7或9所示的成熟肽的核酸序列，或其具有至少100个核苷酸的亚序列的互补链杂交的核酸序列编码。
16.一种面粉组合物，包括面粉和具有脂解酶活性的多肽，并且该多肽a)由克隆入保藏号DSM 14047，14048，14049，或14051的大肠杆菌中的质粒中的DNA序列编码，或b)具有编码SEQ ID NO4，6，8或10所示成熟肽的氨基酸序列，或衍生于它们的一个或多个氨基酸发生取代，缺失和/或插入的氨基酸序列，或c)具有与SEQ ID NO4，6，8或10所示成熟肽有至少55％同一性的氨基酸序列，或d)能与抗纯化形式的SEQ ID NO4，6，8或10的成熟肽的抗体进行免疫反应，或e)是SEQ ID NO4，6，8或10的成熟肽的等位基因变体；或f)由在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO3，5，7或9所示的成熟肽的核酸序列，或其具有至少100个核苷酸的亚序列的互补链杂交的核酸序列编码。
17.一种制备生面团或制备自生面团的烘烤产品的方法，包括添加到生面团中一种具有脂解酶活性的多肽，并且该多肽g)由克隆入保藏号DSM 14047，14048，14049，或14051的大肠杆菌中的质粒中的DNA序列编码，或h)具有编码SEQ ID NO4，6，8或10所示成熟肽的氨基酸序列，或衍生于它们的一个或多个氨基酸发生取代，缺失和/或插入的氨基酸序列，或i)具有与SEQ ID NO4，6，8或10所示成熟肽有至少55％同一性的氨基酸序列，或j)能与抗纯化形式的SEQ ID NO4，6，8或10的成熟肽的抗体进行免疫反应，或k)是SEQ ID NO4，6，8或10的成熟肽的等位基因变体；或l)由在高度严谨条件下与编码SEQ ID NO3，5，7或9所示的成熟肽的核酸序列，或其具有至少100个核苷酸的亚序列的互补链杂交的核酸序列编码。
全文摘要
本发明已经分离了与T.lanuginosus脂酶基因具有高度同源性的新基因，因此而适于应用于基因改组中。因此，本发明通过两个或多个编码脂解酶的同源基因的家族改组提供了一种产生脂解酶遗传多样性的方法。该DNA改组技术用于生成改组基因的库，其在合适的表达系统中表达，筛选具有脂解酶活性的表达的蛋白质。进一步筛选表达的蛋白质以鉴定具有改进特性的脂解酶。本发明还提供一种包括编码脂解酶的核苷酸序列的多核苷酸和脂解酶(具有脂解酶活性的多肽)。
文档编号C12N9/20GK1526013SQ02805472
公开日2004年9月1日 申请日期2002年2月25日 优先权日2001年2月23日
发明者诺里科·楚楚米, 杰斯珀·文德, 沙姆坎特·A·帕特卡尔, 文德, 特 A 帕特卡尔, 诺里科 楚楚米 申请人:诺维信公司