专利名称：用于选择含有编码针对毒性分子的解毒剂蛋白的序列的重组克隆的方法
技术领域：
本发明属于重组DNA技术的领域。
更准确地说，本发明涉及一种方法，一种核酸构建体，一种载体和一种用于选择重组克隆的细胞，该重组克隆含有编码针对毒性分子的解毒剂蛋白的序列。
背景技术：
及现有技术有可能将DNA插入片段克隆到载体中而不需要选择重组体，却需要花费时间进行利用放射性标记探针的杂交鉴定，通过限制性酶切小规模制备的质粒进行筛选或在有X-Gal存在的条件下基于α互补失活进行筛选(蓝/白筛选)。
这些用了十多年的方法并不适应大规模的克隆计划，该计划将在完整基因组测序计划之后出现。可获得的序列信息已经迅猛增加而且在将来还将进一步增加。
为了评价已被鉴定的编码序列的生物学功能，必须对生物体基因组中的其相应基因进行特异性突变(缺失或修饰)(例如在剔除小鼠中)，以便研究与引入的突变相关的表型。突变的特异性是由导向载体(在大肠杆菌中构建的)所给予的，所述导向载体含有同源重组臂。
如果测序技术的发展能够满足测序基因数目迅猛增加的需要，为了获得重组克隆和得到相应基因功能的相关资料而对基因进行大规模的克隆和亚克隆仍然是功能性基因组计划的限制性步骤。
对每种基因进行克隆和亚克隆是“功能性基因组计划”的瓶颈。因此需要加快这些进程的新克隆方法。
由于重组体的鉴定是一个限制性步骤，因此很清楚需要进行重组体的正选择来由传统的方法进展到进行高产量克隆，从而能够处理成千上万的基因。
已经提出了能够直接选择(正选择)重组菌株的克隆载体(例如，参见Pierce等，1992；Kuhn等.1986)。然而，大多数克隆载体表现出下列缺点(i)它们不能被用来引入大的核苷酸片段，(ii)它们不易操作处理，以及(iv)它们不能由微生物以多拷贝来进行制备且不导致所述微生物死亡。
而且，传统的限制性酶切和连接酶反应可以被位点专一性重组所取代，而且重组体可以通过所感兴趣的插入片段取代ccdB基因(毒物/解毒剂基因家族的成员)来进行选择(美国专利US5,910,438，US6,180,407和国际专利WO 99/58652)。
含CcdB的载体比其它正选择系统具有下列主要优势i)其选择基因小(ccdB303bp)，ii)所述载体能在一种宿主中扩增，该宿主含有一个赋予其针对CcdB毒物的总体抗性的突变(gyrA462抗性菌株；Bernard和Couturier，1992)。由于大肠杆菌是大多数分子克隆技术方案所采用的宿主，所以研制能够增强和拓宽克隆可能性范围的新型系统是非常重要的。利用CcdB的正选择技术已被用来构建适于特殊目的的新载体PCR克隆载体(Gabant等，1997)，适于细菌遗传学的载体(Gabant等，1998)，而且最近采用一种属于CcdB家族的kid基因设计了新型的克隆载体(Gabant等，2000和WO01/46444)。
CcdB基因用途的另一个实例由美国专利US5,888,732给出。该文献公开了被称作″通道系统(the Gateway system)″的克隆方法的基本原理。在该方法中，传统的限制性酶切和连接酶反应被位点专一性重组位点所取代而且通过插入目的基因致使ccdB基因失活(通过缺失)来选择重组体。该方法使得生物体的所有基因通过自主亚克隆而快速并有效地由一个载体转移到不同的载体(即表达载体)。所产生的亚克隆保留了允许进行翻译融合的定向以及读框(有关综述参见Hartley等，2000)。
然而，所述技术是基于可反选择基因，需要使用rpsl，tetR，sacB或ccdB可反选择基因，从而产生一种无缝的第二轮产物，该产物没有从第一轮重组中携带上″疤(scar)″。
由于目的重组只是若干种反选择压力方案中的一种，所以反选择(用于选择毒性基因的失活或缺失)通常比正选择(新性能的获得)效率低。任何消除可反选择基因表达的突变事件也将在反选择压力下生长。
因此对于罕见的遗传事件(其发生频率与可反选择基因的突变失活相当)来说，需要对来自第二轮反选择策略的候选物进行筛选从而找出所需的重组事件。
在实践中，由于存在着一些仍然不确定的因素，目的产物与不需要的产物之比的变化范围似乎很宽(从＜1％至15％-85％)(Muyrers G.P.P.，Trends in Biochemical Sciences，Vol.26，no.5，p.325-331，2001)。
本发明的目的本发明的目的在于提供一种新的和改进的方法和产品，其克服了现有技术的缺点并使得对重组克隆的正选择得到改进。
本发明的具体目的是提供这样的方法和产品，其能进行罕见遗传事件的选择，尤其是能选择整合了长DNA片段的重组克隆。
本发明的另一个目的是提供一种方法和产品，其不受用于所述正选择的在细胞中发生的抗性突变的影响或者受其影响较小。
本发明的概述本发明的第一个方面涉及一种用于选择整合了一个目的基因和一条编码针对毒性分子(针对一种细胞，优选原核细胞)的功能性解毒剂蛋白的核苷酸序列的重组克隆的方法，其中所述重组克隆是被整合到宿主细胞中后仍存活的重组克隆，所述宿主细胞的基因组中含有编码所述毒性分子的核苷酸序列。
本发明的另一个方面涉及被用来实施所述方法的产品，具体地是含有至少一条盒式核苷酸序列的核酸构建体，所述盒式核苷酸序列由至 少一条编码针对毒性分子(针对一种细胞，优选地一种原核细胞)的解毒剂蛋白的核苷酸序列和一个目的基因或一个用于所述目的基因的插入位点(优选地，所述插入位点不在编码所述解毒剂蛋白的核苷酸序列中)构成；所述盒式核苷酸序列处于所述核酸构建体的第一个重组位点和第二个重组位点之间(所述第一个重组位点和所述的第二个重组位点互相不重组)。
根据本发明的一个优选实施方案，解毒剂蛋白和毒性分子分别是一种抗-毒物蛋白和一种毒物蛋白。所述抗-毒物或毒物蛋白可以是野生型蛋白或者经修饰的蛋白，其天然具有毒性或经人工的方式而具有毒性，影响细胞(优选原核细胞)的一种或多种生活机能并且可能导致杀死细胞。
解毒剂蛋白和毒性分子优选地选自CcdA/CcdB蛋白，Kis/Kid蛋白，Phd/Doc蛋白，SoK/HoK蛋白，RelB/relE蛋白，PasB(或PasC)/PasA蛋白，mazF/mazE蛋白或任何其它质粒来源或非质粒来源的抗-毒物/毒物分子对。
毒性分子也可以是一种天然具有毒性或经人工的方式而具有毒性的毒素蛋白并且影响细胞(原核细胞)的一种或多种生活机能。
由基因sacB编码的蛋白(来源于解淀粉芽孢杆菌)，蛋白GpE，蛋白GATA-1和蛋白Crp是这种毒性分子的其它实例。
基因sacB编码能催化蔗糖水解成对大肠杆菌具有毒性的产物的果聚糖蔗糖酶(Pierce等.Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.89，N°6(1992)，pp2056-2060)。源自噬菌体X174的E基因编码蛋白GpE，所述E基因含有六个独特的限制位点和编码gpE并且引起大肠杆菌细胞的裂解(Heinrich等，Gene，Vol.42n°3(1986)，pp345-349)。蛋白GATA-1由Trudel等记载(Biotechniques 1996，Vol.20(4)，PP684-693)。蛋白Crp已由Schlieper等记载(Anal.Biochem.1998，Vol.257(2)，p.203-209)。
针对所述毒性分子的解毒剂蛋白是任何能够减少或抑制相应毒性分子对细胞(优选地是原核细胞)的作用的蛋白，其中所述毒性分子由所述细胞产生。
根据本发明的另一个实施方案，编码解毒剂蛋白的核苷酸序列是编码无活性解毒剂蛋白的第一核苷酸片段，在将目的基因正确整合到盒式序列中后，可使其具有活性(有功能)。
优选地，本发明的核酸构建体中的盒式序列还含有启动子/操纵子序列用于实现解毒剂蛋白表达，所述解毒剂蛋白可以组成型表达或在插入目的基因(插入基因)后或通过重组事件进行表达。
例如，当目的基因(插入基因)带有一条含有使解毒剂蛋白进行表达的转录和/或翻译信号的序列时，或者当所述目的基因通过插入或通过重组事件整合了另一条解毒剂序列、其一部分或其C-转录或翻译信号时，可以获得解毒剂活性。
通过所述机理，也可以有利地选择目的基因正确插入所述核酸构建体内。
所述目的基因还可含有一条实现或改善所述解毒剂蛋白表达的启动子/活化子序列或者含有一个第二核苷酸片段，该第二核苷酸片段将补充所述解毒剂蛋白的第一核苷酸片段，从而使所述解毒剂蛋白具有功能(对毒性分子有活性)。
根据本发明的另一个实施方案，目的基因的插入位点是一个克隆位点，诸如重组位点或被一种或多种限制酶特异性切割的核苷酸序列。
有利地是，所述目的基因的插入位点包含在编码毒性分子优选毒物蛋白的核苷酸序列中。因此，本发明的核苷酸构建体首先基于一种负选择，其在目的基因整合到编码毒性分子的核苷酸序列中后使所述序列失活；其次基于一种正选择，该正选择致使解毒剂蛋白在此之后进行表达。
所述双选择有利地使对发生了罕见遗传事件的重组克隆的选择得到了改进，所述事件如很长的DNA片段整合到本发明的核酸构建体中。
在本发明的核酸构建体中，由重组(recombinance)识别的第一和第二重组位点优选地是基于噬菌体λ的att位点(特异性重组位点如由Ptashne M等记载的位点(Genetic switch，Cell Press，Cambridge，1992))。优选地，所述att位点通过由Landy A等记载的方法(AnnualReview，Biochemistry，Vol.58，p.913，1989)被整合到本发明的核酸构建体中。
然而，也可以将其它类型的重组位点整合到本发明的核酸构建体中。
本发明的另一方面涉及一种包含本发明的核酸构建体的载体(一种自主复制载体如质粒、噬菌体、病毒、阳离子囊泡或任何其它类型的载体)。
本发明的一个优选实施方案涉及一种载体供体DNA分子，含有第一DNA片段和第二DNA片段，所述第一或第二DNA片段含有至少一条核苷酸序列作为可选择标记，该序列编码针对毒性分子的解毒剂蛋白，而且其中所述第一和第二DNA片段的侧翼是至少第一和第二重组位点，所述重组位点互相不重组。
本发明载体DNA分子中的所述可选择标记还可含有所述解毒剂序列的至少一个失活片段，当通过所述第一和第二重组位点与另一个含有所述可选择标记的失活片段的DNA片段(解毒剂序列的其它片段)进行重组时，就可获得有功能的可选择标记。
在载体供体DNA分子中，重组位点是上述的重组位点，优选地选自多种重组位点，如美国专利US5,888,732中记载的重组位点。
本发明的载体供体DNA分子有利地在一个试剂盒(优选地在一种克隆试剂盒中)中与插入供体DNA分子相组合，所述插入供体DNA分子含有侧翼为第一重组位点和第二重组位点的第一DNA序列，所述第一重组位点和第二重组位点相互不重组。所述插入DNA分子的特征是美国专利US5,888,732和专利WO99/21977，WO01/31039，WO01/42509中记载的特征，这些文献被引入本文作参考。
本发明的另一方面涉及一种细胞，可能包括在上述试剂盒中，优选地是本发明的载体或核酸构建体的原核宿主细胞，所述细胞在其染色体DNA中掺入了至少一条(优选至少两条或多条)编码毒性分子(存在于所述核酸构建体中的核苷酸序列编码一种针对该毒性分子的解毒剂)的核苷酸序列，所述毒性分子的表达优选地通过转录和/或翻译阻遏工具而被负阻遏(受控制)，例如通过向所述编码毒性分子的核苷酸序列中添加一条阻遏型启动子/操纵子核苷酸序列，所述阻遏型启动子/操纵子核苷酸序列可实现对所述蛋白毒物的转录和/或翻译阻遏调控从而避免了细胞的死亡。
然而，所述阻遏调控可以通过向细胞中加入或抑制加入一种特定化合物(即一种糖)来消除，所述特定化合物使得细胞进行毒性分子的表达。
而且，毒性分子的活性也可以是有条件的(例如，通过在细胞中引入一种热敏等位基因或一种特定的琥珀突变抑制)。
而且，所述细胞还可以含有一种解毒剂，该解毒剂在特定条件下被表达并且能够在细胞中阻断所述毒性分子的有害作用。
优选地，本发明的细胞的保藏号为LMGP-21399。
所述细胞于2002年2月15日被保藏在Laboratorium voorMicrobiologie-Universiteit Généralement，K.L.ledeganckstraat 35，B-9000Gent，比利时微生物协调保藏中心(Collection of the BelgianCoordinated Collection of micro-organisms)，BCCM，保藏号为LMGP-21399。已经按照布达佩斯条约关于微生物保藏国际再委托的规定进行了所述保藏。
本发明的另一方面涉及所述产品用于选择重组体的用途以及涉及一种用于选择重组克隆的方法，该方法包括以下步骤提供一种在本发明的核酸构建体或载体中的盒式序列，或将目的基因插入到在所述盒式序列中提供的插入位点中，用本发明的核酸构建体或载体转化本发明的细胞，以及选择存活下来的重组细胞克隆。
本发明将通过以下非限制性酶切实施例进行更详细的描述。
本发明的详细描述质粒和菌株的描述
图1描述了本发明的核酸构建体1，该构建体1含有盒式核苷酸序列2，该序列由核苷酸序列3(编码针对毒性分子5的解毒剂蛋白4)和目的基因6或用于插入目的基因6的插入位点构成，以及一个启动子/操纵子序列9；所述盒式序列2位于第一重组位点7和第二重组位点8之间，所述第一和第二重组位点7、8彼此不重组。
所述核酸构建体1有利地被整合到一个载体中，该载体是含有另一个可选择标记11的插入供体DNA载体10。所述插入供体DNA载体10可以与含有重组位点13和另一个可选择标记14的插入受体DNA载体12相结合，所述插入供体DNA载体10和所述插入受体载体或分子12在重组后形成本发明的重组载体15。正确的重组取向通过利用选择标记11的特性并且通过利用在其染色体中表达一种或多种编码毒性分子5的基因序列的细菌菌株来选择。
在本例中，编码解毒剂蛋白4的核苷酸序列是编码CcdA蛋白的核苷酸序列，所述CcdA蛋白是针对由细菌表达的毒性分子5(CcdB蛋白)的解毒剂。
存在于插入供体DNA载体10中的第一可选择标记11是蛋白毒物kid而第二可选择标记14是一种对抗生素(氨苄青霉素(ampicyline))的基因抗性。
有利地是，所述插入供体DNA载体10可以在细菌中扩增，所述细菌对第一可选择标记11的活性具有抗性，例如一种表达针对蛋白毒物kid的解毒剂蛋白kis的细菌。
这种组成型包含kis序列的细菌被记载在文献WO01/46444中并且受到保护，保藏号为LMGP-19171。
本发明的另一个方面涉及菌株宿主细胞20，在其中进行重组克隆的选择。
优选的菌株是大肠杆菌菌株CYS10，该菌株来源于DH10B菌株(mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZdM15ΔlacW74endAl recAldeoRΔ(ara，leu)7697araD139ga/U ga/K nupG rpsL，Invitrogen的商品)。该菌株携带一个受染色体dcm基因中的Ptac启动子22调控的ccdB毒物基因21，一个受λPERFLUOROCARBON LIQUID启动子和温度敏感性CI857阻遏物(该系统的描述见Yu等，2000，PNAS 975978-5983)调控的表达Red和Gam功能的缺陷型λ和两个质粒(Pulb356623n Psc101Laclq 24)。pULB3566质粒23在Pbad启动子的调控下产生CcdA解毒剂3并且携带氨苄青霉素抗性基因。Psc101laclq 24质粒产生Laclq阻遏物并且携带壮观霉素抗性基因。控制ccdB毒物基因表达的Ptac启动子22受Laclq蛋白阻遏，并且通过向培养基中添加IPTG 26(异丙基β-D硫代半乳糖苷，C9H18O5S，Roche；0,5毫摩尔/升)而被诱导。然而，即使在有Laclq蛋白存在的条件下，Ptac启动子22也不被完全阻遏，引起残余表达。控制ccdA解毒剂基因3表达的Pbad启动子在没有阿拉伯糖25存在的条件下被完全阻遏并且通过在培养基中加入阿拉伯糖25(1％)而被诱导(Guzman等，1995，Journal of bacteriology，Vol.177，p.4121-4130)。
由于温度敏感性DI857阻遏物的作用，菌株仅在30℃下生长。由于染色体中ccdB的存在，菌株仅在阿拉伯糖存在的条件下生长从而能够产生CcdA解毒剂。因此，所述菌株在30℃下，于LB培养基中并在有阿拉伯糖(1％)存在的条件下生长。
CYS10的构建图解见图2。
然而，所述菌株的特性可以通过去除热敏感特性和通过引入编码更多毒性分子的附加基因序列来得到改进，从而减少或避免选择对所述毒性分子的活性具有抗性的突变体(产生ccdB)。
权利要求
1.一种用于选择整合了目的基因(6)和编码针对毒性分子(5)的功能性解毒剂蛋白(4)的核苷酸序列(3)的重组克隆的方法，其中所述重组克隆是被整合到宿主细胞(20)中后仍存活的重组克隆，所述宿主细胞的基因组中含有编码所述毒性分子(5)的核苷酸序列(21)。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述解毒剂蛋白(4)和毒性分子(5)分别是抗-毒物蛋白和毒物蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述抗-毒物蛋白和毒物蛋白选自下列成对蛋白CcdA/CcdB蛋白，Kis/Kid蛋白，Phd/Doc蛋白，SoK/HoK蛋白，RelB/relE蛋白，PasB(或PasC)/PasA蛋白，mazF/mazE蛋白或任何其它质粒来源或非质粒来源的抗-毒物/毒物蛋白对。
4.一种核酸构建体(1)，其含有一个盒式序列(2)，该盒式序列(2)由编码针对毒性分子(5)的解毒剂蛋白(4)的核苷酸序列(3)和目的基因(6)或用于整合所述目的基因的位点构成；所述盒式序列(2)被置于第一个重组位点(7)和第二个重组位点(8)之间。
5.如权利要求4所述的核酸构建体(1)，其中编码解毒剂蛋白(4)的核苷酸序列(3)含有至少一个编码无活性解毒剂蛋白(4)的核苷酸，其中在将目的基因(6)正确整合到盒式序列(2)中之后，所述解毒剂蛋白(4)重组为有功能的解毒剂蛋白(4)。
6.如权利要求4或5所述的核酸构建体(1)，其中解毒剂蛋白(4)和毒性分子(5)分别是抗-毒物蛋白和毒物蛋白。
7.如权利要求6所述的核酸构建体(1)，其中抗-毒物蛋白和毒物蛋白选自下列成对蛋白CcdA/CcdB蛋白，Kis/Kid蛋白，Phd/Doc蛋白，SoK/HoK蛋白，RelB/relE蛋白，PasB(或PasC)/PasA蛋白，mazF/mazE蛋白或任何其它质粒来源或非质粒来源的抗-毒物/毒物蛋白对。
8.如权利要求4至7中任一项权利要求所述的核酸构建体，其中含有用于插入目的基因(6)的位点的核苷酸序列是编码毒性分子的核苷酸序列。
9.如权利要求4至8中任一项权利要求所述的核酸构建体(1)，其中编码解毒剂蛋白(4)的核苷酸序列(3)或目的基因(6)被连接到启动子/操纵子序列(9)上。
10.如权利要求4至9中任一项权利要求所述的核酸构建体，其中第一个重组位点(7)和第二个重组位点(8)是基于噬菌体λ的att位点。
11.含有权利要求4至10中任一项权利要求所述的核酸构建体的载体。
12.如权利要求11所述的载体，其是一种自主复制载体，优选病毒或质粒载体。
13.如权利要求11所述的载体，其是一种载体供体DNA分子(10)。
14.一种载体供体DNA分子(10)，其含有包含至少一个可选择标记的第一DNA片段和/或第二DNA片段，其中所述第一或第二DNA片段的侧翼是互相不重组的至少第一重组位点第二重组位点，并且其中可选择标记是编码针对毒性分子的解毒剂蛋白的核苷酸序列。
15.如权利要求14所述的载体，其中所述可选择标记是编码针对毒物蛋白的抗-毒物蛋白的核苷酸序列。
16.如权利要求15所述的载体，其中所述抗-毒物蛋白和毒物蛋白选自下列成对蛋白CcdA/CcdB蛋白，Kis/Kid蛋白，Phd/Doc蛋白，SoK/HoK蛋白，RelB/relE蛋白，PasB(或PasC)/PasA蛋白，mazF/mazE蛋白或任何其它质粒来源或非质粒来源的抗-毒物/毒物蛋白对。
17.如权利要求4至16中任一项权利要求所述的载体或核酸构建体的宿主细胞(20)，所述细胞(20)在其染色体DNA中掺入了至少一个编码毒性分子(5)的第一核苷酸序列(21)，所述第一核苷酸序列被阻遏，优选地受阻遏型启动子/操纵子核苷酸序列的调控，和/或受编码针对所述毒性分子的解毒剂蛋白的第二基因序列的调控，所述第二核苷酸序列可能被阻遏，优选地受阻遏型启动子/操纵子核苷酸序列的调控。
18.如权利要求12所述的细胞，其具有保藏号LMGP-21399。
19.一种克隆和/或测序试剂盒，其包含如权利要求4至10中任一项权利要求所述的核酸构建体，如权利要求11至16中任一项权利要求所述的载体和/或如权利要求17或18所述的细胞，并且可能含有插入供体DNA分子(11)，该供体DNA分子(11)含有侧翼是至少第一重组位点和可能的第二重组位点的第一DNA片段，所述第一重组位点与第二重组位点相互不重组。
全文摘要
本发明涉及一种用于选择整合了目的基因(6)和编码针对毒性分子(5)的功能性解毒剂蛋白(4)的核苷酸序列(3)的重组克隆的方法，其中所述重组克隆是被整合到宿主细胞(20)中后仍存活的重组克隆，所述宿主细胞的基因组中含有编码所述毒性分子(5)的核苷酸序列(21)。本发明还涉及核酸构建体，含有所述核酸构建体的载体，宿主细胞和用于实施所述方法的克隆和/或测序试剂盒。
文档编号C12N15/70GK1688699SQ02805357
公开日2005年10月26日 申请日期2002年2月22日 优先权日2001年2月23日
发明者P·伽班特, L·范枚尔德伦, C·Y·斯皮尔 申请人:布鲁塞尔自由大学