一种酶活提高的胰蛋白酶突变体及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种酶活提高的胰蛋白酶突变体及其构建方法，属于基因工程【技术领域】。本发明的突变体是在序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将第1位的酪氨酸突变成了苯丙氨酸，同时将第123位的精氨酸突变成了异亮氨酸。本发明得到的突变体在毕赤酵母中表达，3L罐发酵酰胺酶(BAPNA)酶活为85.3U/mL,酯酶(BAEE)酶活为5954U/mL，相比突变前的菌株，酶活分别提高了3.3倍、2.7倍，解决了胰蛋白酶胞外酶活低的问题。应用该发明中的突变体生产胰蛋白酶，产量高、工艺简化、便于工业化应用。
【专利说明】一种酶活提高的胰蛋白酶突变体及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酶活提高的胰蛋白酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] 胰蛋白酶作为丝氨酸蛋白酶中的较早被发现应用的一种重要类型，最早被发现于 哺乳动物的肠道消化液中。商品化的胰蛋白酶多从哺乳动物胰脏提取，由于胰脏中含丰富 的蛋白酶，对胰蛋白酶分离提纯带来困难。另外，哺乳动物来源的胰蛋白酶多为胰酶混合 物，在医药应用上存在对人体的免疫原性危害。
[0003] 灰色链霉菌胰蛋白酶研究，Koo-Bon-Joon等利用链霉菌常用宿主Streptomyces lividansl326及链霉菌常用的pWHM3质粒（Ermp，红霉素启动子）获得在同属菌中分 泌表达的重组胰蛋白酶，Chi-Won-Jae等将此质粒转入到能够产胰蛋白酶的灰色链霉菌 StreptomycesgriseusIF013350 中表达，DaisukeNohara等人（1998)将链霉菌膜蛋白酶 以包涵体形式在E.coli系统中进行了表达。前期研究在毕赤酵母中以成熟胰蛋白酶形式 表达了灰色链霉菌来源的胰蛋白酶。本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过选 择特定氨基酸优化胰蛋白酶分子结构、提高酶活。
[0004] 异源表达胰蛋白酶突出的问题是，蛋白表达量低、胰蛋白酶酶活低。因此，定点突 变改造胰蛋白酶，提高胞外酶活，对于满足胰蛋白酶工业化成产需求和降低生产成本有重 要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种酶活提高的胰蛋白酶突变体及其构建方法。
[0006] 本发明提供一种酶活提高的胰蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸 序列是SEQIDNO. 1所示的序列。
[0007] 所述突变体的核苷酸序列是SEQIDN0. 3所示的序列。
[0008] 所述突变体是在如序列SEQIDN0. 2所示的氨基酸的基础上，将第1位的酪氨酸 突变成了苯丙氨酸（Y1F)，同时将第123位的精氨酸突变成了异亮氨酸（R123I)。
[0009] 前期研究工作中，本研究团队已获得一种产热稳定性胰蛋白酶的重组毕赤酵母工 程菌，该酵母菌表达核苷酸序列如SEQIDN0. 4所示的胰蛋白酶。
[0010] 所述编码SEQIDN0. 2所示氨基酸序列的核苷酸序列是SEQIDN0. 4所示的序列。
[0011] 本发明还提供一种表达所述胰蛋白酶突变体的基因工程菌。
[0012] 所述基因工程菌的制备方法，是在SEQIDN0. 4所示序列的基础上，将第123位的 精氨酸突变成了异亮氨酸，得到突变体R123I，同时将第1位的酪氨酸突变成苯丙氨酸（以 Y1F表示），得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到酵 母宿主菌中即得到酵母基因工程菌。
[0013]所述表达载体是以下任意一种：pGAPZA、pA0815、pGAPaA、pPIC9K、pPICZB。
[0014] 所述表达载体，在本发明的一种实施方式中是pPIC9K。
[0015]所述酵母宿主菌是以下任意一种：pichiapastorisGS115、pichiapastoris KM71、pichiapastorisX-33、pichiapastorisSMD1168。
[0016] 所述酵母宿主菌，在本发明的一种实施方式中是PichiapastorisGS115。
[0017] 所述的制备方法，具体是：
[0018] (1)以3￡〇10勵.4所示核苷酸序列为模板，？让1^11^(序列如5￡〇10勵.5所 示）、Rlprimer(序列如SEQIDN0. 6所示）为引物，进行PCR得到R123I突变体；
[0019] (2)以上一步得到的突变体的基因序列为模板，F2primer(序列如SEQIDN0. 7所 示）、R2primer(序列如SEQIDNO. 8所示）为引物，进行PCR，即得到序列如SEQIDNO. 3 所示的重组基因。
[0020] (3)将上一步得到的重组基因序列，连接到PPIC9K表达载体中，得到重组质粒 PPIC9K-重组基因，重组质粒电转化PichiapastorisGS115,获得重组酵母工程菌株，命名 为FemiGS115。
[0021] 本发明在热稳定性胰蛋白酶基础上，通过定点突变生物技术改造胰蛋白酶分子结 构，得到一株高产胰蛋白酶毕赤酵母工程菌，发酵工艺简单、酶活高，在3L罐发酵重组菌FemiGS115的胰蛋白酶酰胺酶酶活较突变前菌株提高了 3. 3倍，胰蛋白酶酯酶酶活提高了 2. 7倍。同时突变体酶ExmtlY1F的底物亲和力提高1.3倍，催化效率提高35. 7%，同时比 酶活提高35.4%。R123I自降解位点的突变，避免了胰蛋白酶胞外成熟后的自降解作用， Y1F突变提高了胰蛋白酶的胞外分泌。本发明解决了胰蛋白酶异源表达酶活低得限制性问 题，为胰蛋白酶分子改造提供了一条新的思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1 :定点突变改造的胰蛋白酶表达载体构建图；
[0023] 图2:重组菌FemiGS115的胰蛋白酶酰胺酶酶活图；
[0024] 图3:重组菌FemiGS115与原始菌株（WT)酰胺酶酶活比较图；
[0025] 图4:重组菌FemiGS1153L罐发酵胞外胰蛋白酶SDS-PAGE图；其中1代表CK(对 照菌株），2-7 分别代表FemiGS115 培养 0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h的情况。
【具体实施方式】
[0026] 胰蛋白酶酰胺酶酶活测定方法：在37°C下，测定100yL粗酶液同900iiLBAPNA溶 液在光径〇. 5cm的反应池中，在410nm下10min内的吸光值变化，得到A410nm/min。酶活定 义为：在37°C下，AA410nm/min升高0. 1所需要的酶量为1个酰胺酶水解单位。（酰胺酶 酶活是更严谨的胰蛋白酶酶活定义方式，因为底物为胰蛋白酶特异性底物。）
[0027] 胰蛋白酶酯酶酶活测定方法：在25°C下，测定200yL粗酶液同3mLBAEE底物溶 液在光径lcm的反应池中，在253nm下lmin内的吸光值变化，得到AA253nm/min。酶活定 义为：在25°C下，AA253nm/min升高0. 001即为胰蛋白酶的1个酯酶水解单位。
[0028] 实施例1含胰蛋白酶突变体的重组载体的构建
[0029] 采用图1所示的方法构建重组质粒载体。
[0030](1)R123I突变体获得：以SEQIDN0. 4所示的序列为模板，以Flprimer(序列如 5￡010勵.5所示）、1?让1^11161'(序列如3￡0 10勵.6所示）为引物，进行？〇?得到编码氨基 酸序列第123位精氨酸突变为异亮氨酸的突变体（R123I)基因序列。
[0031] (2)以上一步得到的突变体的基因序列为模板，用F2primer(序列如SEQIDN0. 7 所示）、1?2口1^11161'(序列如3￡0 10勵.8所示）为引物，进行？〇?，获得序列如3￡0 10勵.3 所示的重组基因（即编码Y1F突变体的序列）。将重组基因连接到SampleT载体上。
[0032] (3)将上一步得到的含有重组基因的SampleT载体与pPIC9K分别用Notl、 EcoRI双酶切，纯化后T4连接酶16°C过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。 转化液涂布含卡那霉素（50mg/L)LB平板，提取质粒双酶切验证构建的重组质粒，命名为 pPIC9K-ExmtIYlF。测序工作由上海生工完成。
[0033] 实施例2产成熟胰蛋白酶酵母工程菌构建
[0034] 将实施例1得到的重组质粒pPIC9K_ExmtIYlF用SalI线性化，电击转化 pichiapastorisGS115感受态细胞，具体方法如下：
[0035] 1)接种YPD平板活化的pichiapastorisGS115 于 25mL/250mL三角瓶，30°C过夜 培养；1%接种上述培养液于50mL/500mL三角瓶，培养菌体浓度0D600为1. 3?1. 5 ;
[0036] 2) 5000r/min，4°C离心10min收集菌体，分别用50mL、25mL无菌水悬浮细胞；
[0037] 3)5mLlM山梨醇重悬上述细胞，5000r/min，4°C离心10min收集菌体；
[0038] 4)500iiLlM山梨醇重悬上述细胞，分装80iiL/1.5mLEP管用于电转化感受态细 胞；
[0039] 5) 20iiL线性化质粒与上述80iiL感受态细胞混合，冰上静置15min ;
[0040]6)上述混合物加入预冷的无菌电转化杯（0. 2cm)，1500V、25iiF、200Q电击一次， 加入lmLIM山梨醇；
[0041] 7)取上述混合物150iiL涂布MD平板，30°C培养3天；
[0042] 8)挑取上述平板中白色菌落，验证正确的重组菌。分别点种在l、2、3、4mg/mL(遗 传霉素）YPD平板中，挑选在4mg/mL遗传霉素平板中的单菌落用于摇瓶发酵，测胰蛋白酶酶 活，挑选酶活最高的重组菌，命名为重组菌FemiGS115。
[0043] 实施例3重组毕赤酵母3L罐培养
[0044] 将实施例2构建的重组菌FemiGS115作为生产菌株，在YPD平板活化。种子液培 养，接种50mL/250mL种子培养基，30°C，220r/min培养24h。10 %接种800mL/3L发酵培养 基，口册.5,301：分阶段培养：0-1711，5001'11^/111111培养，00从100%下降至8%左右，然后上 升至60%左右；17-30h，转速逐渐上升至1000rmp/min，指数流加50%甘油，D0开始下降至 10%左右，随后上升至70%;30-144h，流加1.8% (V/V)甲醇诱导产胰蛋白酶。以表达核苷 酸序列如SEQIDN0. 4所示的胰蛋白酶的毕赤酵母菌为对照（即没有发生突变的菌株）。
[0045] 种子培养基（g/L):蛋白胨20,酵母提取物10,葡萄糖20。
[0046] 发酵培养基（g/L):甘油 40 ;K2S0418 ;K0H4. 13 ;MgS04 ? 7H2014. 9 ;H3P0427mL; CaS040. 948 ;微量元素离子液（PTM1)4. 4mL;121°C灭菌 15min。
[0047] PTM1(g?I/1) :CuS04 ? 5H206 ;KI0. 09 ;MnS04 ?H203 ;H3B030. 02 ;MoNa204 ? 2H200. 2 ; CoC120. 5 ;ZnC1220 ;FeS04 ? 7H2065 ;Biotin0. 2 ;H2S045mL;0? 22iim过滤除菌。
[0048] 补料生长培养基：50% (w/v)的甘油（含12ml?L-ipTMl)。
[0049] 发酵过程中，酵母工程菌的酶活如图2所示。从图2可以看出，在发酵40h开始 诱导产酶，酶活随着诱导时间增加，发酵133h时胰蛋白酶酰胺酶酶活达85. 3U/mL。而突变 前的重组菌3L发酵酰胺酶酶活最高为19. 8U/mL，酶活提高了 3. 3倍。同时测定了重组菌 FemiGS115和对照菌株的胰蛋白酶酯酶酶活，结果显示：重组菌FemiGS115的酯酶酶活高达 5954U/mL，相比对照菌株的1624U/mL，提高了 2. 72倍。
[0050] 分析纯化后的重组胰蛋白酶（ExmtlY1F)酶学性质，如表1，ExmtlY1F底物亲和 力提高L3倍，催化效率提高35. 7%，同时比酶活提高35.4%。由于底物亲和力及催化效率 的提高，增加了突变体ExmtIY1F的比酶活。这表明该发明通过突变的创新方式提高了胰蛋 白酶的酶学性质。另一方面，由于第1位氨基酸发生Y1F的突变，在3L罐发酵时，突变体的 胰蛋白酶的胞外分泌表达提高了（如图4)。突变后的ExmtlY1F蛋白表达量为44.55mg/ L，相对于突变前（14. 03mg/L)提高了2. 18倍。
[0051] 表lExmtlY1F突变体反应动力学参数
[0052]
【权利要求】
1. 一种酶活提高的胰蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。
2. 根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是在如序列SEQ ID NO. 2所 示的氨基酸的基础上，将第123位的精氨酸突变成了异亮氨酸，同时将第1位的酪氨酸突变 成了苯丙氨酸。
3. 根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的核苷酸序列是SEQ ID NO. 3所示的序列。
4. 根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述编码SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列 的核苷酸序列是SEQ ID NO. 4所示的序列。
5. -种含有权利要求1所述突变体的重组表达载体。
6. -种表达权利要求1所述胰蛋白酶突变体的基因工程菌。
7. -种权利要求5所述基因工程菌的制备方法，是在SEQ ID NO. 4所示序列的基础上， 将第123位的精氨酸突变成了异亮氨酸，同时将第1位的酪氨酸突变成了苯丙氨酸，得到重 组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到酵母宿主菌中即得到 酵母基因工程菌。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体是：（1)以SEQ ID NO. 4 所示核酸序列为模板，序列如SEQ ID NO. 5所示的Flprimer、序列如SEQ ID NO. 6所示的 Rlprimer为引物，进行PCR，即得到编码的第123位氨基酸由精氨酸突变成了异亮氨酸的 R123I突变体基因序列；（2)以上一步得到的突变体基因序列为模板，序列如SEQ ID NO. 7 所示的F2primer、序列如SEQ ID NO. 8所示的R2primer为引物，进行PCR，即得到序列如SEQ ID N0.3所示的重组基因；（3)将上一步得到的重组基因序列，连接到pPIC9K表达载体中， 得到重组质粒PPIC9K-重组基因，重组质粒电转化Pichia pastoris GS115,获得重组酵母 工程菌株FemiGS115。
9. 根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体是以下任意一种： pGAP ZA、pA0815、pGAP aA、pPIC9K、pPIC ZB。
10. 根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述酵母宿主菌是以下任意 一种：pichia pastoris GS115、pichia pastoris KM71、pichia pastoris X-33、pichia pastoris SMD1168。
【文档编号】C12N1/19GK104328102SQ201410612164
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】康振, 陈坚, 张云丰, 堵国成 申请人:江南大学