一种¹³C、¹⁵N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法

专利名称：一种¹³C、¹⁵N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法
技术领域：
本发明属于稳定同位素标记化合物的生产制备领域，涉及微生物发酵工艺和生物下游分离领域，尤其是涉及一种13C^N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法。
背景技术：
传统的生产稳定同位素标记的L-氨基酸的方法可采用标记蛋白质分解分离制备法、有机合成法、酶法及微生物发酵法等。标记蛋白质分解分离制备法常用于制备标记的复合氨基酸，要分离得到标记的单一氨基酸很困难，现今由于受到原料限制已很少使用。采用有机合成法比较简单，但制备L-氨基酸需要光学拆分使13C^N稳定同位素的原料利用率大为降低，成本上升。而酶法制备标记的L-氨基酸需得到标记的底物和可用的酶源，视具体的氨基酸而定。微生物发酵法则在合适的氨基酸产生菌的存在下辅以良好的生产工艺便可得到标记的氨基酸，有一定的优越性。L-赖氨酸的生产历程从蛋白质水解法、化学合成法、酶法到当今的发酵法。对13C、 1N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备而言，采用微生物直接发酵的生产工艺更简单成熟。近年来，L-赖氨酸的生产多采用发酵法，关于发酵法生产L-赖氨酸的研究报道很多，但是在关于用生物合成法研究13C，1N稳定同位素标记的L-赖氨酸盐酸盐的生产领域中还不见有专利和文献报道。采用直接发酵法制备，目标氨基酸大量富集，分离相对简单，但由于种子、 发酵配方中存在有机碳、氮源，会稀释稳定同位素的丰度，如不加以工艺优化控制，常使产品的同位素丰度大为下降，以致达不到产品的质量要求。故需对工艺(主要为发酵工艺) 进行优化以控制产品的丰度下降，提高稳定同位素的利用率。

发明内容
本发明的目的就是为了 g服上述现有技术存在的缺陷而提供一种提高了生产效率、降低了成本的13C^N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种13CN双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)发酵菌种的选取选取适用于13Cn双标记L-赖氨酸盐酸盐发酵生产的菌种包括短杆菌属及棒杆菌属的变异株，包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicium)、黄色短杆菌 (Brevibacterium flavum)或 1 " 棒杆菌(Corynebacterium crenatum)；(2)发酵培养基配方发酵培养基中不添加或添加极少量的玉米浆等作为有机氮源，有机氮源的浓度为 Owt % 2. Owt %，以13C-葡萄糖为碳源，葡萄糖总的浓度为8wt% 15wt%，以含15N的硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或尿素中的一种或几种为初始氮源，初始氮源的添加量为氮元素含量占总量的0. 3wt% 1. 5wt%，发酵过程中可流加含15N的尿素或氨水补充氮源，不添加或添加极少量的玉米浆、豆饼水解液、酪蛋白水解液、菌体水解液中的一种或多种作为有机氮源，该有机氮源的浓度为 2. 0wt%，随菌种不同添加不同量的磷酸盐包括K2HPO4或 KH2PO4,添加量为0. 5g/L 4g/L ；镁盐，包括MgSO4,添加量为0. 2g/L 0. 8g/L ；亚铁盐，包括FeSO4 · 7H20,添加量为0. 01g/L 0. 06g/L及锰盐，包括MnSO4 · 4H20,添加量为0. Olg/ L 0. 06g/L ；另外添加高丝氨酸，添加量为0. 05g/L 0. 30g/L ；生物素，添加量为100 μ g/ L 1000 μ g/L ；维生素B1，添加量为100 μ g/L 1000 μ g/L等;⑶发酵工艺采用摇瓶发酵或发酵罐发酵得到发酵液，所述的摇瓶发酵的工艺将菌体接种于活化培养基的斜面或平板上，在观 35°C的培养箱中培养16 M小时，再将长好的菌体接一环于经灭菌的发酵培养基中，500mL三角瓶的装液量为20 30mL，于摇床上进行连续发酵培养；所述的发酵罐发酵的工艺将菌体接种于活化培养基的斜面或平板上，在观 35°C的培养箱中培养16 M小时，再将长好的菌体接种于经灭菌的种子培养基中，在 28 35°C摇床培养16 M小时，摇床转速180 220转/分钟，得到的种子培养液按体积比3% 10%的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，进行发酵培养；⑷分离提取发酵培养结束后，将含有13Cn双标记L-赖氨酸的发酵液采用离子交换法提取分离，得到13C^N双标记L-赖氨酸的单斑洗脱液，经真空浓缩赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，再于50°C 60°C真空烘干，最终得到13CN双标记L-赖氨酸盐酸盐
女口
广 PFt ο所述步骤(3)中的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、种子培养基和发酵培养基。所述的斜面保藏培养基的组成成分为蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、NaC15. Og/L、 琼脂20g/L。所述的斜面活化培养基的组成成分为葡萄糖5. Og/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏IOg/ L、NaCl 5. 0g/L、琼脂 20g/L。所述步骤(3)中的种子培养基的组成成分为葡萄糖25g/L、硫酸铵5g/L、K2HPO4 1. 0g/L、MgSO4 0. 25g/L、玉米菜 5 20g/L。所述步骤(3)中摇瓶发酵的控制条件为发酵培养温度^ 35°C，摇床转速 180 240转/分钟，连续发酵72 96小时。所述步骤(3)中发酵罐发酵的控制条件为发酵温度观 351，初始pH6.2 6. 8，通气量0. 5 1. 5VVM，罐压0. 02 0. 05Mpa，溶解氧1 90%，发酵过程中通过添加尿素溶液或氨水控制发酵液的pH值为6. 4 7. 0，以消泡剂消泡，发酵时间60 72小时。与现有技术相比，本发明采用的发酵工艺是适合13Cn双标记L-赖氨酸的制备的。在该工艺条件下13C^N双标记L-赖氨酸的产酸率比采用全合成培养基的相应提高 40% 60%，效果明显，通过控制碳源葡萄糖、无机氮源硫酸铵等及有机氮源玉米浆等的添加量，添加高丝氨酸、生物素、维生素B1等物质，改善了发酵配方。既使同位素丰度得到了控制，减少了丰度下降的风险，又保证了产酸率，使同位素原料得到有效利用，降低了生产成本，使产品更有市场竞争力。本发明可利用不同丰度规格的原料来制备不同丰度的产品， 满足各种丰度需求。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。实施例中13CN的丰度采用同位素专用质谱仪测定，产品的纯度采用HPLC法或凯氏定氮法。实施例1以黄色短杆菌(Brevikicterium flavum)ATCC14067为出发菌株，使用的培养基包
括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、丰度摇瓶发酵培养基。斜面保藏培养基、斜面活化培养基同常规普通发酵的，配方如下斜面保藏培养基(g/L)为蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5. 0，琼脂20，pH7. 0 7. 2。斜面活化培养基(g/L)为葡萄糖5.0，蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5.0，琼脂20， pH7. 0 7. 2。以上培养基均用浓度为2mol/L的NaOH调节pH，121°C灭菌20分钟。低丰度发酵培养基配方(g/L)如下13C-葡萄糖 150，15N-硫酸铵 40，MgSO4 0. 35，KH2PO4 1. 0，生物素 300 μ g/L,维生素 B^OO μ g/L,高丝氨酸 0. 25，玉米菜 4. 5mL/L, MnSO4 · 4Η20 0· 01，FeSO4 · 7H20 0· 01，CaCO3 25。以上发酵培养基用浓度为2mol/L的KOH调节pH至7. 0 7. 2，115°C灭菌15分钟，CaCO3分消。装液量为20mL/500mL三角瓶，共配制5瓶，计0. IL0将菌体接种于活化培养基斜面上，在32°C的培养箱中培养18小时，再将长好的菌体接一环于装有经灭菌的发酵培养基的三角瓶中。摇床发酵控制条件为发酵培养温度 320C，摇床转速220转/分钟，连续发酵72小时，产酸达30. 2g/L。发酵培养结束后，将含有13C、15N双标记L-赖氨酸的发酵液用浓度为2mol/L的HCl调节pH至3 4，在离心机上 4000转/分钟离心20分钟，所得上清液上732铵型树脂柱，经水洗及0. lmol/L的氨水洗脱后，分离得到13Cn双标记L-赖氨酸的单斑洗脱液，经真空浓缩赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，于50°C 60°C真空烘干，最终得到13CN双标记L-赖氨酸盐酸盐产品2. 33g，产品的丰度经同位素质谱仪检测为=13C 9.98%，15附0.07%，下降幅度较小， 可以进行高丰度产品的制备。产品的纯度经凯氏定氮检测大于98.5%。实施例2以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicium) AS 1. 563为出发菌株，使用的
培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、丰度摇瓶发酵培养基。斜面保藏培养基、斜面活化培养基同常规普通发酵的，配方如下斜面保藏培养基(g/L)为蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5. 0，琼脂20，pH7. 0 7. 2。斜面活化培养基(g/L)为葡萄糖5.0，蛋白胨10，牛肉膏10, NaCl 5.0，琼脂20， pH7. 0 7. 2。以上培养基均用浓度为2mol/L的NaOH调节pH，121°C灭菌20分钟。高丰度发酵培养基配方(g/L)如下13C-葡萄糖 145，15N-硫酸铵 45，MgSO4 0. 25，K2HPO4 1. 0，生物素 400 μ g/L,维生素 Β^ΟΟ μ g/L,高丝氨酸 0. 15g,玉米浆 7. 5mL/L, MnSO4 · 4H20 0. 02，FeSO4 · 7H20 0. 02，CaCO325。以上发酵培养基用浓度为2mol/L的KOH调节pH至7. 0 7. 2，115°C灭菌15分钟，CaCO3分消。装液量为25mL/500mL三角瓶，共配制4瓶，计0. IL0将菌体接种于活化培养基斜面上，在30°C的培养箱中培养22小时，再将长好的菌体接一环于装有经灭菌的发酵培养基的三角瓶中。摇床发酵控制条件为发酵培养温度 300C，摇床转速200转/分钟，连续发酵96小时，产酸达31. 6g/L。发酵培养结束后，将含有13C、15N双标记L-赖氨酸的发酵液用浓度为2mol/L的HCl调节pH至3 4，在离心机上 4000转/分钟离心20分钟，所得上清液上732铵型树脂柱，经水洗及0. lmol/L的氨水洗脱后，分离得到13Cn双标记L-赖氨酸的单斑洗脱液，经真空浓缩赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，于50°C 60°C真空烘干，最终得到13CN双标记L-赖氨酸盐酸盐产品2. 58g，产品的丰度经同位素质谱仪检测为1 98. 61%,15N98. 07%。产品的纯度经 HPLC检测大于98. 5%。实施例3以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicium) ATCC13869为出发菌株，使用的
培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、丰度摇瓶发酵培养基。斜面保藏培养基、斜面活化培养基同常规普通发酵的，配方如下斜面保藏培养基(g/L)为蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5. 0，琼脂20，pH7. 0 7. 2。斜面活化培养基(g/L)为葡萄糖5. 0，蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 5. 0，琼脂20， pH7. 0 7. 2。以上培养基均用浓度为2mol/L的NaOH调节pH，121°C灭菌20分钟。高丰度发酵培养基配方(g/L)如下13C-葡萄糖 130，15N-硫酸铵 35，MgSO4 0. 25，K2HPO4 1. 0，生物素 600 μ g/L,维生素 BJOO μ g/L,高丝氨酸 0. 20g，豆饼水解液 4. OmL/L，MnSO4. 4H20 0. 02，FeSO4 · 7H20 0. 02， CaCO3 25ο以上发酵培养基用浓度为2mol/L的KOH调节pH至7. 0 7. 2，115°C灭菌15分钟，CaCO3分消。装液量为25mL/500mL三角瓶，共配制20瓶，计0. 5L。将菌体接种于活化培养基斜面上，在31°C的培养箱中培养20小时，再将长好的菌体接一环于装有经灭菌的发酵培养基的三角瓶中。摇床发酵控制条件为发酵培养温度 31°C，摇床转速200转/分钟，连续发酵84小时，产酸达33. 4g/L。发酵培养结束后，将含有13C、15N双标记L-赖氨酸的发酵液用浓度为2mol/L的HCl调节pH至3 4，在离心机上 4000转/分钟离心20分钟，所得上清液上732铵型树脂柱，经水洗及0. lmol/L的氨水洗脱后，分离得到13Cn双标记L-赖氨酸的单斑洗脱液，经真空浓缩赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，于50°C 60°C真空烘干，最终得到13CN双标记L-赖氨酸盐酸盐产品14. 23g，产品的丰度经同位素质谱仪检测为1 98. 23%, 15N 98. 16%。产品的纯度经HPLC检测大于98. 5%0实施例4一种13CN双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，该方法包括以下步骤(1)发酵菌种的选取选取适用于13CN双标记L-赖氨酸盐酸盐发酵生产的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicium) ATCC 13869 作为菌禾中；(2)发酵工艺采用摇瓶发酵得到发酵液，摇瓶发酵采用以下工艺将菌体接种于斜面活化培养基上，在的培养箱中培养M小时，再将长好的菌体接一环于装有经灭菌的发酵培养基中，500mL三角瓶的装液量为20mL，控制摇床转速为180转/分钟，连续发酵96小时，进行发酵培养；(3)分离提取发酵培养结束后，将含有13CN双标记L-赖氨酸的发酵液采用离子交换法提取分离，得到13C^N双标记L-赖氨酸的单斑洗脱液，经真空浓缩赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，再于50°C真空烘干，最终得到13CN双标记L-赖氨酸盐酸盐产品。发酵工艺中的发酵培养基以13C-葡萄糖为碳源，配方中13C-葡萄糖总的浓度为 8wt%，以15N-硫酸铵作为初始氮源，初始氮源的添加量为氮元素含量占总量的0. 3wt%，发酵过程中流加15N-尿素补充氮源，然后向其中加入K2HPO4，添加量为0. 5g/L ；MgSO4,添加量为0. 2g/L ；FeSO4 · 7H20，添加量为0. 02g/L ；MnSO4 · 4H20添加量为0. 02g/L。另外添加高丝氨酸，添加量为0. 05g/L;生物素，添加量为100yg/L;维生素B1，添加量为100yg/L。实施例5一种13CN双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，该方法包括以下步骤(1)发酵菌种的选取选取适用于13C、15N双标记L-赖氨酸盐酸盐发酵生产的黄色短杆菌 (Brevibacterium flavum) ATCC14067 作为菌种；(2)发酵工艺采用摇瓶发酵得到发酵液，摇瓶发酵采用以下工艺将菌体接种于斜面活化培养基上，在35°C的培养箱中培养16小时，再将长好的菌体接一环于装有经灭菌的发酵培养基中，500mL三角瓶的装液量为30mL，控制摇床转速240转/分钟，连续发酵72小时进行发酵
培养；(3)分离提取发酵培养结束后，将含有13CN双标记L-赖氨酸的发酵液采用离子交换法提取分离，得到13C^N双标记L-赖氨酸的单斑洗脱液，经真空浓缩赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，再于60°C真空烘干，最终得到13CN双标记L-赖氨酸盐酸盐产品。发酵工艺中斜面活化培养基的组成成分为葡萄糖5. Og/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏 10g/L、NaCl 5. 0g/L、琼脂20g/L ；发酵培养基以玉米浆为有机氮源，添加量为2. Owt%,以 13C-葡萄糖为碳源，配方中13C-葡萄糖总的浓度为15wt%，以15N-氯化铵为初始氮源，初始氮源的添加量为氮元素含量占总量的1.5wt%，发酵过程中流加15N-氨水补充氮源，再向其中添加KH2PO4,添加量为4g/L ；MgSO4，添加量为0. 8g/L ；FeSO4 · 7H20，添加量为0. 06g/L ； MnSO4 · 4H20添加量为0. 06g/L。另外添加高丝氨酸，添加量为0. 30g/L ；生物素，添加量为 1000 μ g/L ；维生素B1，添加量为1000 μ g/L。实施例6一种13CN双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，该方法包括以下步骤(1)发酵菌种的选取
选取适用于双标记L-赖氨酸盐酸盐发酵生产的北京棒杆菌 (Corynebacterium pekinense) As 1. 299 作为菌禾中；(2)发酵工艺采用发酵罐发酵得到发酵液，发酵罐发酵采用工艺将菌体接种于斜面活化培养基斜面上，在的培养箱中培养M小时，再将长好的菌体接种于装有经灭菌的种子培养基的摇瓶中，在摇床培养M小时，摇床转速180转/分钟，得到的种子培养液按体积比5%的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，初始pH6. 8，通气量 0. 5VVM，罐压0. 02Mpa,溶解氧1 %，发酵过程中通过添加15N-尿素溶液控制发酵液的pH值为7. 0，以消泡剂消泡，发酵时间60小时；(3)分离提取发酵培养结束后，将含有13CN双标记L-赖氨酸的发酵液采用离子交换法提取分离，得到13C^N双标记L-赖氨酸的单斑洗脱液，经真空浓缩赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，再于50°C真空烘干，最终得到13CN双标记L-赖氨酸盐酸盐产品。发酵工艺中斜面活化培养基的组成成分为葡萄糖5. Og/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏 10g/L、NaCl 5. Og/L、琼脂20g/L ；种子培养基的组成成分为葡萄糖25g/L、硫酸铵5g/L、 K2HPO4 1. Og/L、MgSO4 0.25g/L、玉米浆5g/L;发酵培养基的组成成分为13C-葡萄糖120g/ L, 15N-尿素 13g/L，MgSO4 0. 50g/L，Κ2ΗΡ042· 0g/L,生物素 500 μ g/L，维生素 Β^ΟΟ μ g/L，高丝氨酸 0. 30g/L，玉米浆 7. 5mL/L，MnSO4 · 4H20 0. 06g/L, FeSO4 · 7H20 0. 06g/L。发酵过程中流加15N-尿素补充氮源，也调节pH值。实施例7一种13CN双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，该方法包括以下步骤(1)发酵菌种的选取选取适用于13C、15N双标记L-赖氨酸盐酸盐发酵生产的黄色短杆菌 (Brevibacterium flavum)ATCC 14067 作为菌种;(2)发酵工艺采用发酵罐发酵得到发酵液，发酵罐发酵采用以下工艺将菌体接种于平板上， 在35°C的培养箱中培养16小时，再将长好的菌体接种于装有经灭菌的种子培养基的摇瓶中，在35°C摇床培养16小时，摇床转速220转/分钟，得到的种子培养液按体积比10%的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，初始PH6. 3，通气量1. 5VVM，罐压 0. 05Mpa,溶解氧90%，发酵过程中通过添加15N-氨水控制发酵液的pH值为6. 5，以消泡剂消泡，发酵时间60小时；(3)分离提取发酵培养结束后，将含有13CN双标记L-赖氨酸的发酵液采用离子交换法提取分离，得到13C^N双标记L-赖氨酸的单斑洗脱液，经真空浓缩赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，再于60°C真空烘干，最终得到13CN双标记L-赖氨酸盐酸盐产品。发酵工艺中种子培养基的组成成分为葡萄糖25g/L、硫酸铵5g/L、K2HPO4L Og/ L、MgSO4 0.25g/L、玉米浆20g/L;发酵培养基的组成成分为13C_葡萄糖100g/L,N_尿素 16g/L，MgSO4 0. 50g/L，K2HPO4 2. 0g/L,生物素 500 μ g/L,维生素 Β^ΟΟ μ g/L,高丝氨酸 0. 20g/L,玉米菜 5. 0mL/L, MnSO4 · 4H20 0. 06g/L, FeSO4 · 7H20 0. 06g/L。
权利要求
1. 一种13CN双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(ι)发酵菌种的选取选取适用于13Cn双标记L-赖氨酸盐酸盐发酵生产的菌种包括短杆菌属及棒杆菌属的变异株，包括黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicium)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)或纯齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)等；(2)发酵培养基配方发酵培养基中不添加或添加极少量的玉米浆等作为有机氮源，有机氮源的浓度为 Owt % 2. Owt %，以13C-葡萄糖为碳源，葡萄糖总的浓度为8wt% 15wt%，以含15N的硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或尿素中的一种或几种为初始氮源，初始氮源的添加量为氮元素含量占总量的0. 3wt% 1. 5wt%，发酵过程中可流加含15N的尿素或氨水补充氮源，不添加或添加极少量的玉米浆、豆饼水解液、酪蛋白水解液、菌体水解液中的一种或多种作为有机氮源，该有机氮源的浓度为 2. Owt%，随菌种不同添加不同量的磷酸盐包括K2HPO4或 KH2PO4,添加量为0. 5g/L 4g/L ；镁盐，包括MgSO4,添加量为0. 2g/L 0. 8g/L ；亚铁盐，包括FeSO4 · 7H20,添加量为0. 01g/L 0. 06g/L及锰盐，包括MnSO4 · 4H20,添加量为0. Olg/ L 0. 06g/L ；另外添加高丝氨酸，添加量为0. 05g/L 0. 30g/L ；生物素，添加量为100 μ g/ L 1000 μ g/L ；维生素B1，添加量为100 μ g/L 1000 μ g/L等;(3)发酵工艺采用摇瓶发酵或发酵罐发酵得到发酵液，所述的摇瓶发酵的工艺将菌体接种于活化培养基的斜面或平板上，在观 35°C的培养箱中培养16 M小时，再将长好的菌体接一环于经灭菌的发酵培养基中，500mL三角瓶的装液量为20 30mL，于摇床上进行连续发酵培养；所述的发酵罐发酵的工艺将菌体接种于活化培养基的斜面或平板上，在观 35°C 的培养箱中培养16 M小时，再将长好的菌体接种于经灭菌的种子培养基中，在观 35°C摇床培养16 M小时，摇床转速180 220转/分钟，得到的种子培养液按体积比 3% 10%的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，进行发酵培养；(4)分离提取发酵培养结束后，将含有13CN双标记L-赖氨酸的发酵液采用离子交换法提取分离， 得到13CN双标记L-赖氨酸的单斑洗脱液，经真空浓缩赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，再于50°C 60°C真空烘干，最终得到13C^N双标记L-赖氨酸盐酸盐产品。
2.根据权利要求ι所述的一种13CN双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、种子培养基和发酵培养基。
3.根据权利要求2所述的一种13CN双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，所述的斜面保藏培养基的组成成分为蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、NaCl 5. Og/L、琼脂 20g/L。
4.根据权利要求2所述的一种13CN双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，所述的斜面活化培养基的组成成分为葡萄糖5. Og/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、NaCl 5. Og/L、琼脂 20g/L。
5.根据权利要求1所述的一种13CN双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的种子培养基的组成成分为葡萄糖25g/L、硫酸铵5g/L、K2HP04 l.Og/ L、MgSO4 0. 25g/L、玉米浆 5 20g/L。
6.根据权利要求1所述的一种13CN双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，所述步骤C3)中摇瓶发酵的控制条件为发酵培养温度^ 35°C，摇床转速180 MO 转/分钟，连续发酵72 96小时。
7.根据权利要求1所述的一种13CN双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中发酵罐发酵的控制条件为发酵温度观 351，初始？!16.2 6.8，通气量0. 5 1. 5VVM,罐压0. 02 0. 05Mpa,溶解氧1 90 %，发酵过程中通过添加氨水或尿素溶液控制发酵液的PH值为6. 4 7. 0，以消泡剂消泡，发酵时间60 72小时。
全文摘要
本发明涉及一种13C、15N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，该方法包括以下步骤(1)发酵菌种的选取；(2)发酵培养配方；(3)发酵工艺；(4)分离提取。本发明采用的发酵工艺适合13C、15N双标记L-赖氨酸盐酸盐的制备，在该工艺条件下的产酸率比采用全合成培养基的相应提高40％～60％，效果明显，通过控制碳源葡萄糖、无机氮源硫酸铵等及有机氮源玉米浆等的添加量，添加高丝氨酸、生物素、维生素B1等物质，改善了发酵配方。既使同位素丰度得到了控制，减少了丰度下降的风险，又保证了产酸率，使同位素原料得到有效利用，降低了生产成本，可利用不同丰度规格的原料来制备不同丰度的产品，满足各种丰度需求。
文档编号C12R1/13GK102174603SQ20111005799
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月10日 优先权日2011年3月10日
发明者侯静华, 刘占锋, 孙建春, 李良君, 杜晓宁 申请人:上海化工研究院