专利名称：一种新型三角形银－硫化银纳米复合颗粒的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种贵金属纳米复合颗粒的制备方法及其在制备寡核苷酸探针中的应用，尤其涉及一种三角形银-硫化银纳米复合颗粒的制备方法及其在制备寡核苷酸探针中的应用。
背景技术：
贵金属纳米颗粒(如金和银纳米颗粒)，在催化、光学和生物传感中具有潜在的广泛应用前景。对金属纳颗粒的研究，尤其是对其形貌可控制备及相应性质和应用的研究，一直是材料科学以及相关领域的前沿热点。因三角形银纳米颗粒具有独特的表面质子共振(SPR)性质-其具有三个明显的SPR峰，即面外四极、面内四极和面内双极共振峰，且这种性质与它的尺寸和形状密切相关。因此，对于三角银纳米颗粒的研究吸引了越来越多的人们的注意力。其中一个重要的应用是三角形银纳米颗粒与生物分子的直接功能化得到相应的生物纳米探针。然而，三角形银纳米颗粒具有很高的表面能量，特别是在尖角和边缘处，此处的Ag原子极容易被氧化。这种氧化作用会导致其结构中尖角的塌陷或是结构的整体溶解，SPR峰移动甚至消失。这使得三角形银纳米颗粒几乎不可能直接应用于生物领域。为了实现其进一步的应用，需要提高不同环境中三角形银纳米颗粒的稳定性。尽管硫醇和二氧化硅的钝化层可以用于三角形银纳米颗粒的保护及提高他们的稳定性，但这些方法具有以下缺点I)过程复杂繁琐；2)钝化的基团会影响生物分子的稳定性和检测分子的SPR灵敏度。因此，需要找到一种既能保持三角形银纳米颗粒稳定性，又不影响其化学与生物识别灵敏度的方法。
发明内容
为了解决上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种以三角形银纳米颗粒为原料制备三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒及其寡核苷酸探针的制备方法。本发明的特点是简单和快速，并且具有很好的重现性。并进一步通过三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒表面的Ag2S与巯基修饰的寡核苷酸(HS-DNA)偶联制备出相应的寡核苷酸探针。为了达到上述目的本发明采用如下技术方案本发明提供一种新型三角形银-硫化银纳米复合颗粒，其中包含三角形银纳米颗粒，其特征在于其是由三角形银纳米颗粒与硫化物直接反应制备而来，在三角形银纳米颗粒的表面覆盖有硫化银形成的保护层。所述的硫化银可直接与巯基修饰的寡核苷酸相偶联制备相应的寡核苷酸探针。其制备方法包括以下步骤(I)制备聚乙烯吡咯烷酮(PVP)保护的三角形银纳米颗粒；(2)避光条件下在步骤⑴的溶液中快速加入硫化物的水溶液，恒温保持20-35 °C，搅拌 5-30 分钟。、
其中步骤(I)可以采用现有的方法，例如Adv Mater, 2005,17 (4) :412-415公开的方法制备得到。其中步骤(2)中加入硫化物的水溶液，使得三角形银纳米颗粒与硫化物的摩尔比为 50 : 1-5 : I。其中步骤(2)中所用的硫化物为硫化钠或硫化钾。此外，本发明还提供了该新型三角形银-硫化银纳米复合颗粒在制备寡核苷酸探针中的应用方法，包括以下步骤(I)三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒用磷酸缓冲液洗涤；(2)室温下，将三角形Ag-Ag2Sm米复合颗粒与巯基修饰的寡核苷酸(HS-DNA)和硼酸缓冲液混合，离心除去上清液；(3)沉淀用磷酸缓冲液洗涤，得到三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒寡核苷酸探针；(4)得到的三角形Ag-Ag2Sm米复合颗粒寡核苷酸探针重分散到磷酸缓冲液中，于4°C储存。其中，步骤(I)所用磷酸缓冲液的pH值为7. 5-8. 5，含有浓度为O. 1-0. 2mol/L的NaCl ;优选pH值为8.0，含有浓度为O. 15mol/L的NaCl。其中，步骤(3)和⑷中所用磷酸缓冲液的pH值为6. 5-7. 5，含有浓度为O. 1-0. 2mol/L 的 NaCl ;优选 pH 值为 7. 0，含有浓度为 O. 15mol/L 的 NaCl。其中，步骤(2)中所用硼酸缓冲液的pH值为8. 5-9. 5，浓度为45-55mmol/L ;优选pH值为9. 2，浓度为50mmol/L。本发明的优点在于(I)提供了一种简单快速的合成新型的三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒的制备方法;(2)通过三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒表面的Ag2S与HS-DNA偶联制备出相应的寡核苷酸探针。利用本发明所制备的三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒制备寡核苷酸探针的过程省去了纳米材料本身再修饰的过程，具有突出的简单方便的优点。本发明合成的新型三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒可用于DNA分子的检测，其作为新型纳米生物探针在生物传感领域具有广泛的应用前景。
图I为本发明的三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒寡核苷酸探针制备示意图。图2为本发明一实施例制备的三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒的透射电子显微镜的图片( Μ)。图3为本发明一实施例制备的三角形Ag-Ag2S纳米颗粒寡核苷酸探针与靶标DNA的解链温度示意图。图4为本发明又一实施例制备的三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒的透射电子显微镜的图片(TEM)。图5为本发明又一实施例制备的三角形Ag-Ag2S纳米颗粒寡核苷酸探针与靶标DNA的解链温度示意图。、
图6为本发明另一实施例制备的三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒的透射电子显微镜的图片(TEM)。图7为本发明另一实施例制备的三角形Ag_Ag2S纳米颗粒寡核苷酸探针与靶标DNA的解链温度示意图。
具体实施例方式实施例I :三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒制备(I)参照文献(Adv Mater, 2005，17 (4) =412-415.)的方法制备PVP保护的三角银纳米颗粒使用PVP和柠檬酸根作为稳定剂和模版剂，避光搅拌条件下用NaBH4还原AgNO3制备出PVP保护的三角银纳米颗粒。(2)避光条件下在步骤(I)制备的三角银纳米颗粒溶液中快速加入lyLlmmol/L硫化钠水溶液，三角银纳米颗粒和硫化钠的摩尔比例约是10 I。恒温25°C搅拌30分钟，得到三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒。其形貌见附图2。利用三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒制备寡核苷酸探针及其杂交性能测试实例模型寡核苷酸分子如下探针a : 5' -TCT-CAA-CTC-GTA-TTTT-SH-3'探针 b : 5' -SH-TTTT-CGC-ATT-CAG-GAT-3'靶标DNA : 5' -TAC-GAG-TTG-AGA-ATC-CTG-AAT-GCG-3'(I)由图I制备的三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒用磷酸缓冲液(PBS) (pH 8. O7NaClO. 15mol/L)洗漆。(2)室温条件下，将步骤(I)的三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒与探针a和硼酸缓冲液(50mmol/L,pH 9.2)混合，离心除去上清液，沉淀用磷酸缓冲液(pH 7. O7NaCl O. 15mol/L)清洗。将得到的巯基寡核苷酸修饰的三角形Ag-Ag2Sm米颗粒(纳米探针a)重分散到磷酸缓冲液中并于4°C储存。(3)纳米探针b通过同样的方法与探针b反应制备，重分散于磷酸缓冲液中并于4°C储存。(4)将纳米探针a和b与靶标DNA混合，加热到70°C以上10分钟，自然冷却，使用分光光度计对其解链温度进行检测。见附图3。实施例2 三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒制备制备方法和实例I基本相同；不同点在于步骤(2)中避光条件下在步骤I)制备的三角银纳米颗粒溶液中快速加入3 μ L 2mmol/L的硫化钠水溶液，三角银纳米颗粒和硫化钠的摩尔比例约是20 I。恒温30°C搅拌15分钟，反应后得到三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒。其形貌见附图4。利用三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒制备寡核苷酸探针及其杂交性能测试实例
模型寡核苷酸分子如下探针a : 5' -CAA-TCT-CTC-GTA-TTTT-SH-3'探针b : 5' -SH-TTTT-AGT-CAG-ATT-GAT-3'、
靶标DNA : 5' -TAC-GAG-AGA-TTG-ATC-AAT-CTG-ACT-3'(I)由图4制备的三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒用磷酸缓冲液(PBS) (pH 8. O7NaClO. 15mol/L)洗漆。(2)室温条件下，将步骤(I)的三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒与探针a和硼酸缓冲液(50mmol/L,pH 9.2)混合，离心除去上清液，沉淀用磷酸缓冲液(pH 7. O7NaCl O. 15mol/L)清洗。将得到的巯基寡核苷酸修饰的三角形Ag-Ag2Sm米颗粒(纳米探针a)重分散到磷酸缓冲液中并于4°C储存。(3)纳米探针b通过同样的方法与探针b反应制备，重分散于磷酸缓冲液中并于4°C储存。(4)将纳米探针a和b与靶标DNA混合，加热到60°C以上10分钟，自然冷却，使用分光光度计对其解链温度进行检测。见附图5。实施例3 三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒制备制备方法和实例I基本相同；不同点在于步骤(2)中避光条件下在步骤I)制备的三角银纳米颗粒溶液中快速加入2 μ L 3mmol/L的硫化钾水溶液,三角银纳米颗粒和硫化钾的摩尔比例约是30 I。恒温20°C搅拌25分钟，反应后得到三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒。其形貌见附图6。利用三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒制备寡核苷酸探针及其杂交性能测试实例模型寡核苷酸分子如下探针a : 5' -CAC-TCT-CTC-GTA-TTTT-SH-3'探针b : 5' -SH-TTTT-AGT-CAG-ATT-GAG-3'靶标DNA : 5' -TAC-GAG-AGA-GTG-CTC-AAT-CTG-ACT-3'(I)由图6制备的三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒用磷酸缓冲液(PBS) (pH 8. O7NaClO. 15mol/L)洗漆。(2)室温条件下，将步骤(I)的三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒与探针a和硼酸缓冲液(50mmol/L,pH 9.2)混合，离心除去上清液，沉淀用磷酸缓冲液(pH 7. O7NaCl O. 15mol/L)清洗。将得到的巯基寡核苷酸修饰的三角形Ag-Ag2Sm米颗粒(纳米探针a)重分散到磷酸缓冲液中并于4°C储存。(3)纳米探针b通过同样方法与探针b反应制备，重分散于磷酸缓冲液中并于4°C储存。(4)将纳米探针a和b与靶标DNA混合，加热到80°C以上5分钟，自然冷却，使用分光光度计对其解链温度进行检测。见附图7。本发明实施例1-3制备得到的三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒寡核苷酸探针相比于已报道的以三角银为前躯体制备的寡核苷酸探针有着制备简便，容易重复的特点，而且从附图3、5、7的解链温度曲线上可以明显看出来通过监测吸光度的突变就可以得到很准确的解链温度数值，这说明该探针在未来寡核苷酸检测方面将是一种很理想的材料。权利要求
1.ー种三角形银-硫化银纳米复合颗粒，其中包含三角形银纳米颗粒，其特征在于在三角形银纳米颗粒的表面覆盖有硫化银形成的保护层，所述硫化银由三角形银纳米颗粒与硫化物直接反应制备而来。
2.如权利要求I所述的三角形银-硫化银纳米复合颗粒，其特征在于所述的硫化银可直接与巯基修饰的寡核苷酸相偶联制备相应的寡核苷酸探针。
3.一种制备如权利要求I或2所述的三角形银-硫化银纳米复合颗粒的方法，，其特征在于主要包括以下步骤 (1)制备聚こ烯吡咯烷酮(PVP)保护的三角形银纳米颗粒； (2)避光条件下在步骤(I)的溶液中快速加入硫化物的水溶液，恒温保持20-35°C，搅拌5-30分钟。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在干步骤(I)所述的三角形银纳米颗粒由现有方法(Adv Mater, 2005,17 (4) :412-415.)所制备。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在干所述步骤(2)中加入的硫化物的水溶液，使得三角形银纳米颗粒与硫化物的摩尔比为50 1-5 I。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在干所述步骤(2)中所用的硫化物为硫化钠或硫化钾。
7.权利要求1-6任一项所述的三角形银-硫化银纳米复合颗粒的应用，是将其制备相应的寡核苷酸探针，包括以下步骤 (1)三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒用磷酸缓冲液洗漆； (2)室温下，将三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒与巯基修饰的寡核苷酸和硼酸缓冲液混合，离心除去上清液； (3)沉淀用磷酸缓冲液洗涤，得到三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒寡核苷酸探针； (4)得到的三角形Ag-Ag2S纳米复合颗粒寡核苷酸探针重分散到磷酸缓冲液中，于4°C储存。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤⑴所用磷酸缓冲液的pH值为7.5-8. 5，含有浓度为O. 1-0. 2mol/L的NaCl ;优选pH值为8. O,含有浓度为O. 15mol/L的NaCl。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤(3)和(4)中所用磷酸缓冲液的pH值为6. 5-7. 5，含有浓度为O. 1-0. 2mol/L的NaCl ;优选pH值为7. 0，含有浓度为O. 15mol/L 的 NaCl。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所用硼酸缓冲液的pH值为.8.5-9. 5，浓度为 45-55mmol/L ;优选 pH 值为 9. 2，浓度为 50mmol/L。
全文摘要
本发明提供一种新型三角形银-硫化银纳米复合颗粒的制备方法及其在寡核苷酸探针合成中的应用，其由三角形银纳米颗粒与硫化物直接反应制备而来，在三角形银纳米颗粒的表面覆盖有硫化银形成的保护层。本发明还提供了所述纳米复合颗粒的制备方法，其特点是过程简单快速，且合成的纳米复合颗粒既能够保持三角形银纳米颗粒的稳定性，而又不影响其化学与生物识别的灵敏度，而且无需对纳米颗粒进行表面修饰，即可直接通过该三角形银-硫化银纳米复合颗粒表面的硫化银与巯基修饰的寡核苷酸探针相偶联制备出相应的生物纳米探针，其过程简单快速，在生物传感领域具有广泛的应用前景。
文档编号C12N15/11GK102672167SQ201110063379
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月16日 优先权日2011年3月16日
发明者刘兵, 韩景漫, 马占芳 申请人:首都师范大学