专利名称：利用rna干扰技术使杜氏藻累积高含量番茄红素的方法
技术领域：
本发明涉及生物合成番茄红素的方法，尤其是利用RNA干扰技术使杜氏藻 (Dunaliella)累积高含量的番茄红素的方法。
背景技术：
番茄红素(Lycopene)是一种脂溶性天然色素，其分子是由11个共轭双键和2个非共轭双键组成的直链型碳氢化合物，属类胡萝卜素类。主要存在于番茄、西瓜、红色葡萄柚等植物中。近十年来的研究表明，番茄红素极强的抗氧化活性，其清除单线态氧的能力是维生素E的100倍、是β -胡萝卜素的2. 2倍，清除羟自由基的效果比β -胡萝卜素强32 倍，为目前自然界中被发现的最强抗氧化剂之一。研究发现，番茄红素具有优越的生理功能，它不仅具有抗癌、抑癌的功效，而且对于预防心血管疾病、动脉硬化等各种成人病、增强人体免疫系统以及延缓衰老等也有良好的效果。2009年全世界番茄红素的总用量约2300 吨，据有关机构预测，番茄红素的需求量在未来数年仍将以约10%的速度增长。目前世界上番茄红素的生产方法有天然提取法、化学合成法和发酵法三种。俄罗斯和美国罗氏药业有化学合成的番茄红素产品，生产成本较低，但其结构为非全反式，生理功能差，而且人们对化学合成品毒副作用有相当的疑虑，因此化学合成番茄红素很少用于药物和食品添加剂。目前市场上的番茄红素大多是从番茄中提取的天然产物，但由于番茄中番茄红素的含量仅为0. 002%左右，提取难度大、成本高、纯度低，而且大量种植番茄用于番茄红素提取需要消耗很多的土地资源。利用微生物发酵法制备番茄红素的研究方面也有一些报道，美国专利US3097146、 US3369974及中国专利200510090996. 0提出了利用三孢布拉氏霉菌发酵制备番茄红素的方法，但这些方法均需要添加氨基吡啶等化学药剂干扰霉菌的生物合成路径来实现番茄红素的积累，化学添加剂在产品中的残留对人体的健康会产生不利影响。中国专利 20071012^95发明了一种利用细菌(龟裂链霉菌)发酵累积番茄红素的方法，但由于受到其合成前体供应量的限制，依照此方法生产番茄红素产率仅在0. 4% 0. 7%细胞干重范围，仍没有实质性的突破与提高。通过基因工程和代谢工程的方法来提高番茄中番茄红素的含量方面也有一些有益的尝试。如以色列Lycored Natural Product hdustries公司率先选育出番茄红素含量为普通番茄4 5倍的杂交番茄。英国将细菌八氢番茄红素脱氢酶基因crtl导入番茄细胞中，培育出了番茄红素含量为普通番茄3. 5倍的转基因番茄新品种。这些研究虽然在一定程度上提高了原料中番茄红素的含量，但总体水平仍很低。杜氏藻(Dimaliella)，为绿藻门多鞭藻科的一属，是盐生的、无细胞壁的单细胞绿藻，能高效率地生物合成β-胡萝卜素，其中的盐生杜氏藻(Dimaliella salina)细胞中累积β-胡萝卜素的量最高可达干重的14%，是β-胡萝卜素含量最高的生物体，远远高于其它生物。此外杜氏藻可以在露天开放环境下利用阳光和二氧化碳快速生长，其中盐生杜氏藻的增殖速度达约IOg/(m2 天)，因此杜氏藻是生产天然β -胡萝卜素的很好资源，全球有不少公司利用杜氏藻来生产胡萝卜素，用作药物或健康食品的成分。番茄红素和胡萝卜素都是类胡萝卜素物质，它们有相近的化学结构，让杜氏藻像生物合成胡萝卜素那样直接合成、累积番茄红素的想法非常有吸引力的，因为迄今为止世界上还没有发现过能够以如此高的效率来合成、累积番茄红素的生物。
发明内容
本发明的目的是建立一种使杜氏藻(Dimaliella)能够累积高含量的番茄红素的方法。植物生物合成β -胡萝卜素途径的相关研究表明，番茄红素是生物合成β -胡萝卜素的前体，番茄红素在番茄红素-β-环化酶(Lycopene β-cyclase, LycB)的催化作用
下，先将番茄红素分子的两个末端之一环化成Y-胡萝卜素，然后再将另一端环化后形成胡萝卜素，LycB是番茄红素转化为β-胡萝卜素的关键酶，如果没有LycB的参与，番茄红素就不能环化，生物合成胡萝卜素的过程就会终止于番茄红素合成阶段。番茄果实中番茄红素的累积研究证实，番茄红素的累积是上游八氢番茄红素合成酶基因(psy基因)和八氢番茄红素脱氢酶基因(pds基因)表达增强及下游IycB基因表达减弱的结果，其调控方式为相关基因的转录调控。杜氏藻生物合成β-胡萝卜素的过程中，两步环化反应同样都必需LycB参与才能完成，而LycB是IycvB基因表达的产物，因此，通过抑制杜氏藻的IycB基因的表达就可以实现番茄红素在杜氏藻体内不被转化为胡萝卜素而大量累积下来。抑制杜氏藻IycB基因表达的有效途径是将杜氏藻基因组中的IycB基因敲除 (knock-out)或者使IycB基因沉默，也就是RNA干扰(RNA interference, RNAi)。本发明人在中国发明申请201110084892. 4中公开了一种通过敲除杜氏藻IycB基因使其能够累积高含量的番茄红素的方法，该方法实施后取得了非常好的效果，所获得的敲除了 IycB基因的盐生杜氏藻可以累积高达3. 5%细胞干重的番茄红素，是番茄的1000倍以上。与基因敲除技术相比，RNA干扰技术的优点在于它不仅能够有效地抑制特异序列的目的基因的表达、操作简便、迅速，而且不会改变基因组的遗传组成。本发明将通过构建IycB基因的RNAi表达载体，将其转入杜氏藻中，并筛选得到能够有效干扰IycB基因的表达、累积高含量番茄红素的杜氏藻，使人类可以通过养殖杜氏藻的新途径大量、方便地获取天然番茄红素。本发明的具体过程是第一步，杜氏藻细胞RNA的提取与反转录得到杜氏藻cDNA库。本发明所说的杜氏藻(Dimaliella)可以是盐生杜氏藻(Dimaliella salina)或巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)或双杜氏藻(Dunaliella biocuiate)等，其中优选累积β-胡萝卜素能力更强的盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)或巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)，特别是盐生杜氏藻(Dunaliella salina)。第二步，RNAi表达载体的构建。1、以杜氏藻cDNA为模板扩增目标片段；杜氏藻的cDNA序列经测序得到或来源于GenBank。
杜氏藻cDNA的测序按照基因工程领域常用的测序方法进行，也可以将测序工作委托给专门提供测序服务的生物技术公司。根据杜氏藻cDNA序列设计特异性引物，克隆目标RNAi片段。本发明特别提出了特异性引物引物Y6-RNAi-F，序列为SEQ ID NO :2，引物Y6_RNAi_R，序列为SEQ ID NO :3。2、构建质粒并测序本操作中能采用的质粒有很多选择，这是本专业领域的研究人员所熟知的，下述操作中选择了质粒pMD 19-T，但本发明并不局限于它。按下列步骤构建pMD19-T_RNAi9质粒并测序(1)将目标RNAi片段接入起始质粒PMD19-T(2)转化感受态细胞(3)菌落PCR筛选阳性转化子
(4)质粒PCR筛选阳性转化子(5)酶切检测(6)序列测定本发明特别提出了一种目标RNAi片段，其序列为SEQ ID NO :1。3、RNAi中间载体的构建本操作中能采用的质粒有很多选择，这是本专业领域的研究人员所熟知的，下述操作中选择了质粒pHANNIBAL、pBS-KS (+)，但并不局限于它们。酶切上述步骤2得到的pMD19-T_RNAi9质粒，得到pi正向片段，进一步接入内含子pHANNIBAL载体得到RNAi-pl质粒，再酶切得到p2反向片段，p2反向片段再连接入RNAi-p 1质粒得到RNAi-p 1-ρ2质粒，在该中间载体上，干扰片段正向和反向插入到 pHANNIBAL载体内含子两侧，并置于启动子CaMV35S启动子和终止子OCS终止子之间，构建了完整的干扰表达盒。酶切RNAi-pl_p2质粒，回收4. 2kb的片段，插入到pBS_KS⑴载体的NotI酶切位点，得到PBS-RNAi质粒。4、构建RNAi表达载体在RNAi表达载体中包含用于筛选的筛选标记基因，所述的筛选标记基因是氯霉素抗性基因、阿特拉津抗性基因、荧光蛋白基因等，本发明优选阿特拉津抗性基因。本操作中能采用的质粒有很多选择，这是本专业领域的研究人员所熟知的。下述操作中选择了质粒PCAMBIA1301，但并不局限于它。酶切pCAMBIA1301质粒将潮霉素抗性基因(hpt)替换为1. 4kb的阿特拉津氯水解酶基因(atzA)，得到1301-atzA载体。用&icI/BamHI分别双酶切pBS-RNAi和1301_atzA表达载体，分别回收4. 2kb和 12kb的片段，连接得到1301-pBS-RNAi表达载体，图1是1301-pBS-RNAi表达载体图谱，该载体具有卡那霉素抗性以及阿特拉津(atzA)正筛选标记。第三步，RNAi表达载体的转化。将RNAi表达载体转化进杜氏藻细胞方法可以是电击法、农杆菌侵染转化法、聚乙二醇(PEG)法、基因枪法、玻璃珠搅拌法等，这些方法是基因工程领域所常用的，这些方法在转化效率方面有所不同，本发明优选简便高效电击法。
用电击法将RNAi表达载体转化进杜氏藻细胞在冰浴中以3kV/cm 8kV/cm电击杜氏藻细胞悬浮液。在本发明中电击法可以达到0. 05% 0. 2%的转化效率。携带抗性标记的的转化株可以用抗性平板筛选，携带荧光蛋白标记的转化株用流式细胞鉴别分离仪器筛选。图2是电转化后利用阿特拉津抗性平板筛选转化藻。第四步，PCR鉴定阳性转化子。挑取单藻落扩大到ImL培养，提取微藻基因组，进行PCR鉴定。首先用引物对atzA-5/8鉴定正筛选标记atzA基因，得到0. 8kb的特异性条带，说明正筛选标记atzA基因已经插入到杜氏藻基因组中。然后用引物对Y6-RNAi-F/R进一步做基因组PCR，鉴定干扰片段，得到大小约为0. 6kb，说明干扰片段已经插入到杜氏藻基因组中。之所以可选用Y6-RNAi-F/R这对引物做筛选，原因是实验获得的干扰片段来源于杜氏藻的cDNA序列，不包含内含子序列。非转化藻基因组中不能得到0.61Λ的条带，或者可能得到大于0. 6kb的条带。图3是引物对atzA-5/8的PCR鉴定图谱，结果显示2、4、5藻株基因组存在抗性标记atzA基因；图4是引物对Y6-RNAi-F/R的PCR鉴定图谱，结果显示筛选得到的1、2、3、5、6、8藻株基因组存在干扰片段，证明RNAi表达载体得到成功转化。将已PCR确认RNAi阳性的杜氏藻进行放大养殖，用高压液相色谱(HPLC)检测藻体中番茄红素的含量，结果显示，所得到的杜氏藻能够累积高含量的番茄红素。本发明的优点在于通过杜氏藻IycB基因的RNAi表达载体的构建、转化以及转化株的筛选，得到IycB 基因被干扰的杜氏藻，该杜氏藻的IycB基因的表达被抑制，其生物合成β-胡萝卜素的过程被阻止于番茄红素阶段，进而在其生物体内大量累积番茄红素，该累积过程是藻体自然的生物代谢过程，无需额外添加任何化学抑制剂。由本发明得到的IycB基因表达受RNA干扰的杜氏藻，在3. Omol/L盐浓度、氮缺乏、强光胁迫下养殖就可以大量累积番茄红素，HPLC 检测结果显示，其番茄红素的含量增加到起始杜氏藻的14 16倍。本发明成果将为人类大量、廉价地获取番茄红素提供全新的解决方案。本发明所提出的特异性引物Y6-RNAi_F和Y6_RNAi_R用于克隆杜氏藻IycB基因 RNA干扰的目标片段，由此得到的RNAi目标片段有很好的干扰效果，引物Y6-RNAi-F的序列为 SEQ ID NO :2，引物 Y6-RNAi-R 的序列为 SEQ ID NO :3。克隆得到的盐生杜氏藻RNAi目标片段序列为SEQ ID NO :1，该盐生杜氏藻是商业化生产β-胡萝卜素的最常用的杜氏藻品种，在强光、高盐等胁迫环境下能够累积胡萝
卜素的量最高可达到生物体干重的10% 14%，因此，该RNAi目标片段应用于使盐生杜氏藻IycB基因沉默，具有很好的应用价值。
图1是1301-pBS-RNAi表达载体图谱。图2是电转化后利用阿特拉津抗性平板筛选转化藻。图3是引物对atzA-5/8的PCR鉴定图谱，M为NTKV_3marker，1为阴性对照，2-5 为不同单藻落，6为阳性对照。图4是引物对Y6-RNAi-F/R的PCR鉴定图谱，M为NTKV_3marker，1-8为不同单藻落，9为阴性对照，10为阳性对照。
图5是盐生杜氏藻Y6中类胡萝卜素成分的HPLC分析，峰I为β -胡萝卜素，峰II
为番茄红素。图6是经RNA干扰获得的1-Α4藻中类胡萝卜素成分的HPLC分析，峰I为β -胡萝卜素，峰II为番茄红素。
具体实施例方式下述实施例中所涉及的方法如无特殊说明均为该技术领域的常规方法，所用的酶制剂如无特别说明均为TaKaRa公司的产品，所涉及的引物的DNA序列在序列中表相应列
出ο实施例一、盐生杜氏藻RNAi表达载体的构建1、盐生杜氏藻RNA提取与反转录盐生杜氏藻Υ6为中国商业化生产生产β-胡萝卜素的常用的杜氏藻品种。采用TRIzoI试剂提取盐藻细胞的总RNA，反转录得到cDNA库。反转录采用TaKaRa 公司的 M-MLV 型 cDNA Synthesis Kit。2、表达载体1301-pBS-RNAi的构建(1)以盐生杜氏藻cDNA为模板扩增目标片段根据GenBank报道的cDNA序列(登录号EU327876)设计特异性引物Y6_RNAi_F、 Y6-RNA1-R,从盐生杜氏藻cDNA中克隆目标片段RNAi9。(2)构建 pMD19-T-RNAi9 质粒并测序A.将RNAi9目的片段接入pMD19_T载体酶连体系如下a) RNAi9 目的片段4. 8 μ Lb) pMD19-T 载体0. 4 μ Lc)T4 连接酶0.2yLd) IOXligation buffer 0. 6 μ L总体系6yL上述体系16 °C连接过夜B.转化感受态细胞C.菌落PCR筛选阳性转化子D.质粒PCR筛选阳性转化子E. Xbal/Clal、EcoRI/XhoI 酶切检测F.序列测定对经PCR鉴定和酶切鉴定均正确的菌株测序。C3)pKS_RNAi中间载体的构建用碱裂解法提取pMD 19-T-RNAi9质粒及pHANNIBAL质粒载体，1 %琼脂糖凝胶电泳检测其浓度。首先用^(bal/Call双酶切以上两种质粒，将胶回收得到的Pl正向片段与 pHANNIBAL载体连接，转化，经PCR、酶切鉴定筛选得到阳性转化子RNAi-pl质粒，再用BioI/ EcoRI双酶切pMD19-T-RNAi9和RNAi-pl，回收0. 6kb的p2反向片段连接到RNAi-pl中，得到RNAi-pl-p2质粒。在该中间载体上，干扰片段正向和反向插入到pHANNIBAL载体内含子两侧，并置于CaMV35S启动子和OCS终止子之间，构建了完整的干扰表达盒。冻融法回收酶切得到的基因片段a.酶切产物用0. 7%的琼脂糖凝胶电泳分离b.在紫外灯下切下目的条带，置于大小合适的封口膜上，_20°C放置30minc.挤胶，吸取DNA溶液收集于1. 5mL离心管中d.加等体积的酚/氯仿/异戊醇，混勻，12000r/min离心IOmine.上清转入新的离心管中，加2. 5倍体积的预冷乙醇、0.4倍体积的醋酸钠，-20°C 静置5h以上f. 14000r/min离心lOmin，沉淀用预冷的75%乙醇洗涤，离心，干燥，DNA沉淀溶于适量TE中，取0. 5 μ L电泳确定其浓度(4)构建 pBS-RNAi 载体NotI酶切RNAi-pl_p2质粒，回收4. 2kb的片段，插入到pBS_KS (+)载体的NotI酶切位点，得到pBS-RNAi质粒。(5)构建 1301-pBS-RNAi 表达载体以pCAMBIA1301质粒为骨架构建表达载体，首先用BioI限制性内切酶将潮霉素抗性基因(hpt)替换为1.41Λ的阿特拉津氯水解酶基因(atzA)，得到1301_atzA载体。用&icI/BamHI分别双酶切pBS-RNAi和1301-atzA表达载体，分别回收4. 2kb和 12kb的片段，连接得到1301-pBS-RNAi表达载体，其图谱见图2。该载体具有卡那霉素抗性以及阿特拉津(atzA)正筛选标记。利用PCR、酶切验证载体的正确性。3、电击转化法、筛选电击缓冲液0. 28mol/L NaCl、5mmol/L KCl、25mmol/L CaCl2,20mmol/L H印es、 0. 2mol/L 甘露醇、0. 2mol/L 山梨醇、O. 05% Tween_20、0· 4mol/L 甘油。电击转化步骤a.培养盐生杜氏藻至对数生长期(1.0\10、611/!1^)，41，400017/1^11离心5111士11，
收集细胞。b.冰上操作，ImL电击缓冲液悬浮细胞，洗涤2次。c.重悬至细胞密度为l.OX 107cell/mL，取90 100 μ L重悬藻液，加终浓度为 IOng/ μ L的载体，混勻，冰浴IOmin0d. 6kV/cm电击，冰浴lOmin，加入ImL新鲜培养基，暗培养12he.光暗=14 10液体培养Mh，最后铺板于含0. 2 μ g/mL阿特拉津抗性的固体平板上培养至长出单藻落。4、PCR 鉴定挑取单藻落扩大到ImL培养，然后用简易CTAB法提取藻基因组，PCR筛选引物分别为atzA-5，序列 SEQ ID NO 4atzA-8，序列 SEQ ID NO 5MD-RNAi-F，序列 SEQ ID NO 6MD-RNAi-R，序列 SEQ ID NO 7
图4、5分别显示1301-pBS-RNAi表达载体后得到的转化藻株的PCR检测结果，筛选得到的藻株基因组存在atzA基因和RNAi片段，证明1301-pBS-RNAi表达载体得到成功转化。5、转化藻类胡萝卜素的提取及HPLC分析经上述电转化、筛选、PCR鉴定操作步骤后，得到到IycB基因表达被干扰的盐生杜氏藻1-A4，在3mol/L氯化钠、氮缺乏、高光诱导条件下养殖该藻，同时以盐生杜氏藻Y6为对照。按以下方式分离藻体、提取番茄红素，利用HPLC定量检测番茄红素的含量，以确认其是否能够累积高含量的番茄红素。微藻类胡萝卜素提取方法a.取藻液15mL，4000r/min离心5min，倾去上清液。b.加2mL丙酮重悬藻泥，-20°C黑暗静置2h，充分萃取。c.在 4°C下，6000r/min，离心 lOmin。d.取上清，0.45 μ m膜过滤，取20 μ L上样。HPLC 条件色谱柱Comatex C18(5ym, Φ 4. 6 X 250mm)柱温30°C、流速lmL/min检测波长502nm流动相A 乙腈和水(9:1，体积比)流动相B:乙酸乙酯进样量20yL梯度0 16min B:0 60%16 30minB 60%30 35minB :60% 100%标样β -胡萝卜素标准品用三氯甲烷溶解，番茄红素标准品用二氯甲烷溶解HPLC分析杜氏藻提取样品的β-胡萝卜素和番茄红素的含量，附图6、图7是HPLC 分析的图谱。HPLC分析结果显示1-Α4的番茄红素含量占总类胡萝卜素的42. 7士3. 5%，远高于 Υ6的2. 9%，是Υ6的14. 74倍；按干重计算，1_Α4的番茄红素含量为2. 7 士 0. 6%，超过番茄的750倍以上。
9
权利要求
1.一种使杜氏藻(Dimaliella)累积高含量番茄红素的方法，其特征是通过RNA干扰技术使杜氏藻的番茄红素-β-环化酶(LycB)基因的表达被抑制。
2.根据权利要求1所述的干扰杜氏藻的番茄红素环化酶基因的表达的方法，其特征是包括以下步骤第一步，提取杜氏藻RNA，反转录得到杜氏藻cDNA库。第二步，克隆目标RNA干扰片段，构建RNA干扰表达载体的构建。第三步，RNAi表达载体的转化。第四步，PCR鉴定阳性转化子。
3.根据权利要求2所述的杜氏藻的RNA干扰表达载体，其特征在于含有氯霉素抗性基因或阿特拉津抗性基因。
4.根据权利要求2或3所述的杜氏藻的RNA干扰表达载体，其特征在于干扰片段分别正向和反向插入到载体内含子的两侧，并置于CaMV35S启动子和OCS终止子之间。
5.根据权利要求2所述目标RNA干扰片段的克隆，其特征在于所采用的引物的序列为 SEQID NO 2 禾口 SEQ ID NO :3。
6.根据权利要求1-3任一项所述的杜氏藻是以下杜氏藻的任何一种盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)、双杜氏藻(Dunaliella biocuiate)。
7.根根据权利要求1-3任一项所述的杜氏藻是盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)或巴 1 (Dunaliella bardawil)。
8.根据权利要求1-3任一项所述的杜氏藻是盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)。
9.根据权利要求1-3任一项所述的RNA干扰，其特征在于目标RNA干扰目标片段序列为 SEQ ID NO :1ο
10.根据权利要求4所述的RNA干扰，其特征在于目标RNA干扰目标片段序列为SEQ IDNO 1。
全文摘要
本发明涉及生物合成番茄红素的方法，特别是利用RNA干扰技术使杜氏藻(Dunaliella)能够累积高含量番茄红素的方法。根据杜氏藻cDNA序列设计特异性引物，克隆目标RNA干扰片段，然后构建RNA干扰表达载体，并转化进杜氏藻细胞，经筛选和PCR鉴定获取了RNA干扰的杜氏藻，该杜氏藻的番茄红素-β-环化酶基因的表达被抑制，细胞生物合成β-胡萝卜素的过程被阻止于番茄红素阶段，在3.0mol/L盐浓度、氮缺乏及强光胁迫条件下能够在生物体内大量累积番茄红素，其番茄红素的含量增加到起始杜氏藻的14～16倍。本发明的方法是大量、廉价地获取天然番茄红素的新途径。
文档编号C12P23/00GK102251007SQ20111014181
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者刘鑫, 李伯平, 陈喜文, 陈德富 申请人:南开大学