专利名称：兜兰DEFICIENS(DEF)-like MADS-box基因序列的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学中的基因领域，具体涉及兜兰i^F/CTBW (DEF)-Iike MADS-box基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列。
背景技术：
在真双子叶植物中，花器官四轮的排列依次为最外轮为花萼，第二轮为花瓣，第三轮为雄蕊，第四轮为心皮(Theissen，2001)。随着各种不同的双子叶植物花发育的研究， 经典花发育的ABC模型用来解释这些发育机理(Sctiwarz-Sommer et al.，1990 ；Bowman et al. ,1991 ；Coen和MeyerOWitz，1991)，该模型包括的主要内容为四轮花器官的发育是A、B 和C三类功能基因不同组合表达的结果，A类基因单独控制萼片的发育，AB类基因联合控制花瓣的发育，BC类基因联合控制雄蕊的发育，C类基因单独控制心皮的发育；其中A和C类基因相互拮抗(Coen 和 Meyerowitz 1991 ；Theissen 和 Saedler 2001 ；Theissen，2001 )。随着ABC模型的发展，扩展到D类基因控制胚珠的发育(Colombo et al.，1995)，以及E类基因参与决定花瓣、雄蕊、心皮和胚珠的发育，即最终的AB⑶E模型(Pelaz et al. ,2000 ；Honma 和 Goto，2001 ;Theissen，2001)。在拟南芥中，APETALA1 (API)和 APETALA2 (AP2)属于 A 类基因，APETALA3 (AP3)和PISTILLATA (PI)属于B类基因，AGAM0US (AG)属于C类基因 (Mandel et al. ,1992 Jofuku et al. ,1994 ； Drews et al. ,1991 ；Weigel禾口Meyerowitz 1994 ；Rounsley et al.，1995)。APl，AP3, PI 和 AG 是在花发育中起重要作用的 MADS-box 基因，它们编码的MADS-box蛋白，都在N端包含1个保守的DNA结合域(MADS-box结构域) (Theifien禾口Saedler,1995 ；Purugganan et al. ,1995 ；Rounsley et al. , 1995 ；TheiBen et al.，2000)。在兰科(Orchidaceae)植物中，MADS-box基因的研究目前主要集中在蝴蝶兰属 {Phalaenopsis) (Chen et al. , 2007 ；Guo et al. , 2007 ；Song et al. ,2006 ；Tsai et al.，2004，2005)、石斛兰属 Ofez7iZroAiws) (Skipper et al.，2005，2006 ;Yu 和 Goh，2000a， 2000b)、文心兰属(itocii/i腫)(Thiruvengadam 和 Yang，2009)和玉凤花属 0 力) (Kim et al.，2007)等(Lu et al.，1993 ;Mondrag0n_Palomino 和 Theifien，2008)，然而兜 ^MiPaphiopedilim Pfitz.)植物的MADS-box基因的研究报道则鲜见。,J^APaphiopedilum spp.)，又叫拖鞋兰，属于兰科兜兰属植物，其花形奇特，花大色艳，具有很高的盆栽观赏价值和经济价值。目前，兜兰是重要的商业洋兰之一，在洋兰花卉市场中占有举足轻重的地位。因此，研究兜兰花发育的分子机理也具有十分重要的意义。而分离和克隆兜兰花发育控制相关的MADS-box基因，进一步鉴定MADS-box蛋白的功能，可为阐明兜兰花发育的分子机制提供理论依据。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种兜兰i^F/CTBW (DEF)-Iike MADS-box基因，该基因是一个与兜兰花发育相关的MADS-box基因。
本发明所解决的技术问题在于提供一种兜兰/^F-Wfc勸Λ -box基因编码的多肽。本发明所解决的技术问题在于提供一种获取兜兰/^F-Wfc勸Λ -box基因克隆的方法。为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种分离出的兜兰i^F-like MADS-box基因，具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。所述的兜兰i^F-like MADS-box基因编码框的位置位于73bp_747bp，在73bp处有起始密码子ATG，在745bp处有终止密码子TGA，在1010 bp处有polyA附加信号，该序列无内含子，具有675 bp完整的开放读码框，编码2M个氨基酸的多肽。通过生物信息学分析发现，兜兰i^F-like MADS-box基因在NCBI网站上用Blast 软件进行同源性比对，结果表明，该cDNA序列与爪唇兰^ahate)、芳香绶草 (.Spiranthes odorata )>ixBf ^^115 ^ iPhragmipedium longifolium)禾口香子兰(Kafli/^/a
)的全长i^F-like MADS-box基因的cDNA序列同源性分别高达85%，84%, 82%和 78%。ORF Finder分析表明，该基因cDNA全长1039bp，在73bp处有起始密码子ATG，在745bp 处有终止密码子TGA，在IOlObp处有polyA附加信号，具有675bp完整的开放读码框，编码 224个氨基酸。该cDNA序列编码的氨基酸序列在NCBI数据库进行Blast分析，结果表明该氨基酸序列具有典型的MADS结构域和K结构域(见图3)，与长叶美洲兜兰、芳香绶草、爪唇兰和香子兰的i^F-like MADS-box基因编码的蛋白序列的同源性分别为91%、拟％、80%和 78%。系统进化树分析表明，该兜兰MADS-box基因属于花器官发育B类基因的i^F亚家族 (见图4)。另一方面，本发明还提供了一种由兜兰i^F-like MADS-box基因编码的多肽，该多肽具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。另一方面，本发明还提供了一种兜兰i^F/CTBW (DEF)-Iike MADS-box基因在其花器官中表达模式的分析方法，包括如下步骤
分别提取兜兰花的子房、萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱，以及苞叶的总RNA，再将不同样品的总 RNA分别反转录为cDNA第一链；
根据核苷酸序列SEQ ID N0. 1，设计如下引物作为Real-time PCR的引物来扩增目的片段长为222bp的特异区段
DEF F2 (5，— 3’) AGCCCGATTTAGGGATACAA<SEQ ID NO. 10>， DEF R2 (5，— 3’) ATACTCTTGGCGTCGGTGGA<SEQ ID Ν0· 11>， 以兰花Tubu 1 in为内参基因，设计特异引物 Tubulin- & — 3' ) GGATTAGGCTCTCTGCTGTTGG<SEQ ID NO. 12>， Tubul— 3’) GTGTGGATAAGACGCTGTTGTATG<SEQ ID NO. 13>， 扩增长为130 bp目的片段；
根据Real-time PCR试验结果，根据兜兰i^F/CTBW (DEF)-Iike MADS-box基因在各花器官中的表达量进行表达模式的分析。另外，本发明还提供了一种获取兜兰i^F-like MADS-box基因克隆的方法。具体而言，本发明是以兰科兜兰属植物中的同色兜兰[A concolor (Lindl.) Pfitz.]为实验材料，通过以下技术措施实现1、总RNA的提取
取同色兜兰的花，使用如下的提取步骤
将样品于液氮中研成粉末，按适当样品的量迅速加入Solution D 500 μ 1，水饱和酚 500 “1，3 11醋酸钠(？!1 5.2)200 μ 1,4 M β-巯基乙醇50 μ 1，充分振荡混勻，室温放置 1 min;加入200 μ 1氯仿，剧烈振荡1 min ；4 °C，12 000 g离心10 min，小心吸取上清液至另一无RNase的离心管中；加入二氧化硅悬浮液100 μ 1，无水乙醇200 4 1，3 11醋酸钠(？!1 5.2)200 μ 1，用微量移液器缓慢混勻，室温，12 000 g离心1 min，弃上清；加入70%乙醇1 ml，用移液器吸打混勻，室温，12 000 g离心1 min，弃上清，重复2次；室温干燥8-10 min, 加入20-50 μ 1灭菌双蒸水，室温孵育5-10 min,室温，12 000 g离心5-10 min ；将RNA上清液吸取至另一无RNase的离心管中。测定RNA的浓度和电泳检测RNA的质量(见图1A)。 将RNA置于-80 °C冰箱保存备用。2. cDNA第一链的合成和LD-PCR法扩增全长双链cDNA
取同色兜兰花的总 RNA1. 0μ g，按照 SMART PCR cDNA Synthesis Kit (CLONTECH, U. S. Α.)的操作步骤，先进行反转录合成cDNA第一链，然后用LD-PCR法扩增全长双链cDNA。3.设计引物和合成引物
从GenBank数据库中下载近源物种(如长叶美洲兜兰、芳香绶草、爪唇兰、春兰等) DEF-Iike MADS-box基因编码的氨基酸序列，用CLUSTAL X (1.8)软件进行多序列比对，确定氨基酸序列保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为380bp。引物设计后由上海英俊生物技术公司合成。兼并引物序列为
DEF Fl (5’ — 3’) ATGGGGAGGGGGAAGATAGAG<SEQ ID NO. 3> ； DEF Rl (5，— 3’):CTCAAGACCGCGCAGTTCCTT<SEQ ID Ν0· 4>。4.兜兰i^F-1 ike MADS-box基因cDNA全长序列的克隆
以上述2合成的cDNA第一链为模板，用上述3设计的兼并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1. 0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，然后从凝胶中割胶纯化回收目的DNA条带 (见图2A)。再将纯化的PCR产物连接到pGEM-T easy载体中，转化DH5 α感受态细胞，挑取阳性克隆过夜培养。经菌液PCR电泳检测后，结果为阳性的菌液送至上海英俊生物技术公司进行双向测序。根据测序获得的cDNA中间片段，用ft~imer5. 0软件设计特异基因引物，再利用 cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3，端和5’端进行PCR扩增。在3’RACE中，以上述2合成的全长双链cDNA为第一次PCR反应的模板，再将第一次PCR产物作为第二次PCR反应的模板。由接头引物和3’ RACE基因特异引物分别进行两次PCR反应，然后从凝胶中割胶纯化回收目的DNA条带(见图2B)。3，RACE 接头引物(5，— 3，)AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(3(i) N^1N(N=A, C, G, 或 T ； Nh=A, G,或 C) <SEQ ID NO. 5> ；
3，RACE 基因特异引物(5，— 3，) :GAGGGAGATAAGCCAAAGGA<SEQ ID Ν0· 6>。在5’ RACE中，以上述2合成的全长双链cDNA为第一次PCR反应的模板，再将第一次PCR产物作为第二次PCR反应的模板。利用接头外侧引物和基因特异引物进行第一次 PCR扩增，然后用接头内侧引物和基因特异引物进行第二次PCR扩增，最后从凝胶中割胶纯化回收目的DNA条带(见图2C)。5，RACE 接头外侧引物(5，一 3，) CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<SEQ ID NO. 7> ；
5，RACE 接头内侧引物(5，一 3，):AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<SEQ ID NO. 8> ； 5，RACE 基因特异引物(5，— 3，) :TCCCTCCTCAGATTGTGGTT<SEQ ID NO. 9>。所得到的PCR产物用1. 0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR产物纯化后，连接到pGEM-T easy载体中，转化DH5 α感受态细胞，挑取阳性克隆过夜培养。经菌液PCR电泳检测后，结果为阳性的菌液送至上海英俊生物技术公司进行双向测序。测序所得的序列再与保守区序列设计兼并引物扩增得到的cDNA中间片段的序列利用CLUSTAL X (1. 8)软件进行拼接。5.兜兰i^F-like MADS-box基因序列的生物信息学分析
将拼接的测序结果在NCBI网站上用Blast软件进行同源性比对，结果表明，该 cDNA序列与爪唇兰(Gongora galea ia )、芳香绶草(Spiran thes odora ia )、长叶美洲兜 ^XPhragmipedium longifolium)禾口香子兰(Kafli/^/a planifolia)白勺全长 DEF-like MADS-box基因的cDNA序列同源性分别高达85%，84%, 82%和78%。ORF Finder分析表明， 该基因cDNA全长1039bp，在73bp处有起始密码子ATG，在745bp处有终止密码子TGA，在 IOlObp处有polyA附加信号，具有675bp完整的开放读码框，编码2M个氨基酸。该cDNA 序列编码的氨基酸序列在NCBI数据库进行Blast分析，结果表明该氨基酸序列具有典型的 MADS结构域和K结构域(见图3)，与长叶美洲兜兰、芳香绶草、爪唇兰和香子兰的i^F-like MADS-box基因编码的蛋白序列的同源性分别为91%、拟％、80%和78%。系统进化树分析表明，该兜兰MADS-box基因属于花器官发育B类基因的i^F亚家族(见图4 )。6.兜兰i^F-1 ike MADS-box基因在其花器官中的表达模式分析
分别提取兜兰花的子房、萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱，以及苞叶的总RNA (见图1B)，再将不同样品的总RNA分别反转录为cDNA第一链，根据前述的核苷酸序列SEQ ID N0. 1， 设计半定量 RT-PCR 弓丨物..DEF F2 (5，一 3，) AGCCCGATTTAGGGATACAA, DEF R2 (5，一 3，) ATACTCTTGGCGTCGGTGGA,目的片段长为 222bp。以兰花 Tubulin 为内参基因， 引物序列为 Tubulin-Y 饬’ —3，) GGATTAGGCTCTCTGCTGTTGG, Tubul— 3，)
GTGTGGATAAGACGCTGTTGTATG,目的片段长约为 130bp。半定量 RT-PCR 结果表明，Tl/to/i/ 在同色兜兰花的各个器官中表达量变化不大，但i^F基因在花瓣(PE)和唇瓣(L)中的表达量最高，在萼片(SE)中的表达量次之，在蕊柱(CO)中的表达量又较苞叶(B)中的高，在子房 (0)中的表达量最低，几乎检测不到(见图5)。从上述结果分析表明，本发明的兜兰i^F-1 ike MADS-box基因是一个新的与兜兰花发育相关的基因，该基因既参与兜兰的营养生长，又参与兜兰的生殖生长。因此，本发明提供的兜兰i^F基因，不仅有利于揭示兜兰花器官发育的分子机制，还可为基因工程改良植物的生命进程，尤其是植物的花发育提供了一定的依据。下面结合附图和具体实施方式
进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。
图1总RNA电泳图。图1A，泳道F，同色兜兰花的总RNA ；图1B，泳道0、B、SE、PE、 L和CO分别为同色兜兰的子房、苞叶、萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱的总RNA。图 2 兜兰 i^F-like MADS-box 基因 cDNA 全长的克隆。M，为 DL2000 DNA Marker ； 图2A，泳道1，兼并引物扩增的PCR结果；图2B，泳道2，3，Race PCR产物结果；图2C，泳道 3，5，Race PCR产物结果。图3兜兰i^F-like MADS-box基因编码的蛋白通过NCBI保守结构域数据库注释结果。图4兜兰i^F-like MADS-box基因的氨基酸序列与其它物种B类主要MADS-box 基因的氨基酸序列的系统进化树分析。图5兜兰i^F-like MADS-box基因在其不同器官中的表达分析。M，为DL2000 DNA Marker ；0、B、SE、ΡΕ、L和CO分别代表同色兜兰的子房、苞叶、萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。实施例1 总RNA的提取
以同色兜兰的花为实验材料，使用以下步骤提取总RNA
①将研钵和研棒用液氮预冷，迅速将样品放入研钵中研成粉末后转入液氮预冷的无 RNase的1. 5 ml的离心管中，按10 ml/g样品的量迅速加入Solution D 500 μ 1，水饱和酚500 μ1，3Μ醋酸钠(ρΗ 5.2) 200 μ 1,4 M β-巯基乙醇50 μ ，充分振荡混勻，室温放置1 min。②加入200 μ 1氯仿，剧烈振荡1 min。③4 "C, 12 000 g离心10 min，小心吸取上清液至另一无RNase的1.5 ml的离心管中。④加入6 g/ml 二氧化硅100 μ 1，无水乙醇200 μ 1,3 M醋酸钠(ρΗ 5.2)200
μ 1，用微量移液器缓慢混勻。室温，12 000 g离心1 min，弃上清。⑤加入70%乙醇1 ml，用移液器吸打混勻，室温，12 000 g离心1 min，弃上清。重
复2次。⑥室温干燥8-10 min,加入20-50 μ 1灭菌双蒸水，室温孵育5_10 min。室温，12
000g 离心 5-10 min。⑦小心将上清吸取至另一无RNase的1. 5 ml离心管中。⑧测0D260确定RNA的浓度，1. 2 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。⑨将溶解的RNA置于-80 ！冰箱保存备用。实施例2 cDNA第一链的合成和LD-PCR法扩增全长双链cDNA
cDNA 第一链的合成按照 SMART PCR cDNA Synthesis Kit (CL0NTECH, U. S. Α.)的操作步骤，取同色兜兰花的总RNA l.Oyg，与反转录引物3，SMART⑶S Primer II A (12 μ Μ) 1 μ 1混合均勻，PCR仪上72°C，3min，接着42°C，2min，快速取出，放于室温，然后加入 5 X First Strand Buffer 2μ 1, DTT (100 mM) 0. 25 μ 1, dNTP Mix (10 mM of each dNTP)
1μ 1, SMART II A Oligonucleotide (12 μ M) 1 μ 1, Rnase inhibitor 0. 25μ 1, PowerScript Reverse Transcriptase(IOOU) 1 μ 1，10 μ 1。β@禾呈j^》42。C 60min, 72°C 7 min，最后-20°C保存备用。LD-PCR法扩增全长双链cDNA:将PCR仪预热到95 °C，取2 μ 1稀释后的 ss cDNA 作为反应模板，Deionized H2O 82 μ 1, IOXAdvantage 2 PCR Buffer 10 μ 1, 50XdNTPdOmM of each dNTP) 2. 0μ 1, 5，PCR Primer II A(12 μ Μ) 2. 0μ 1, 50 X Advantage 2 Polymerase Mix 2. 0 μ 1，反应体系为 100 μ 1。PCR 扩增程序为 95 "C Imin ；95 "C 15 s，65 "C 30 s，68 °C，6 min, 19 cycles。PCR 扩增完后，保存于-20 °C备用。实施例3 设计引物和合成引物
从GenBank数据库中下载近源物种(如长叶美洲兜兰、芳香绶草、爪唇兰、春兰等) DEF-Iike MADS-box基因编码的氨基酸序列，用CLUSTAL X (1. 8)软件进行多序列比对， 确定氨基酸序列保守区，根据保守区序列MGRGKIE设计兼并引物i^F F 1 (5’一3’) ATGGGGAGGGGGAAGATAGAG,根据保守区序列 KELRGLE 设计兼并引物 i^F Rl (5，一 3，) CTCAAGACCGCGCAGTTCCTT ；PCR扩增片段大小约为380bp。引物设计后由上海英俊生物技术公司合成。实施例4 兜兰i^F-1 ike MADS-box基因cDNA全长序列的克隆
取上述合成的第一链cDNA 1.0μ 1为模板，用上述设计的兼并引物进行PCR扩增，反应体系为10XLA Buffer (Mg2+ plus) 2. 5 μ l,dNTP Mix (2. 5mM of each dNTP) 4. 0 μ 1,LA taq (5υ/μ 1) 0. 2 μ 1, Deionized H2O 15. 3 μ 1，10 μ M 引物i^F Fl 和i^F Rl 各 1· 0 μ 1， 反应体系为 25 μ 1。PCR 反应程序为94°C 4 min ；94°C 30 s，59°C 30 s，72°C，l min, 32 cycles ;72°C, 7 min。所扩增的PCR产物用1. 0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，然后从凝胶中割胶纯化回收目的大小的DNA条带。再将纯化的PCR产物连接到pGEM-T easy载体中， 转化DH5ci感受态细胞，挑取阳性克隆过夜培养。经菌液PCR电泳检测后，结果为阳性的菌液送至上海英俊生物技术公司进行双向测序。根据测序获得的cDNA中间片段，用ft~imer5. 0软件设计特异基因引物，再利用 RACE技术对目的基因的3’端和5’端进行PCR扩增。在3’RACE中，以上述合成的全长双链cDNA稀释后作为第一次PCR反应的模板，再将第一次PCR产物稀释后作为第二次PCR反应的模板。由接头引物和3’ RACE基因特异引物分别进行两次 PCR 反应。3，RACE 接头引物(5，一 3，)AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(3。) N^1N(N=A, C, G,或 T; NfA，G,或 C) ；3，RACE 基因特异引物(5，一 3，) GAGGGAGATAAGCCAAAGGA。反应体系为10XLA Buffer (Mg2+ plus) 2. 5 μ 1，dNTP Mix (2. 5mM of each dNTP) 4. 0 μ 1，LA taq (5U/ μ 1) 0. 2 μ 1, Deionized H2O 15. 3 μ 1，10 μ M 3’ RACE接头引物和3’ RACE基因特异引物各1.0 μ 1，反应体系为25 μ 1。PCR反应程序为 940C 4 min ；94°C 30 s，56°C 30 s，72°C，l min, 33 cycles ；72°C,7 min。在5’RACE中，以上述合成的全长双链cDNA稀释后作为第一次PCR反应的模板，再将第一次PCR产物稀释后作为第二次PCR反应的模板。利用接头外侧引物和基因特异引物进行第一次PCR扩增，然后用接头内侧引物和基因特异引物进行第二次PCR扩增。5’ RACE 接头外侧引物(5’一 3’)
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT ;5’ RACE 接头内 ^ 引物(5，一 3，):AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT ；5，RACE 基因特异引物(5，一 3，) TCCCTCCTCAGATTGTGGTT。反应体系为10XLA Buffer (Mg2+ plus) 2. 5 μ 1, dNTP Mix (2. 5mM of each dNTP) 4. 0 μ 1，LAtaq (5U/ μ 1) 0. 2 μ 1, Deionized H2O 15. 3 μ 1，10 μ M 5’ RACE接头外侧引物(5’ RACE接头内侧引物，第二次PCR)和5’ RACE基因特异引物各 1. 0μ 1,反应体系为 25μ 1。PCR 反应程序为94°C 4 min ;94°C 30 s，58°C 30 s，72°C，l min,33 cycles ；72°C,7 min。所得到的PCR产物用1. 0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR产物纯化后，连接到pGEM-T easy载体中，转化DH5 α感受态细胞，挑取阳性克隆过夜培养。经菌液PCR电泳检测后，结果为阳性的菌液送至上海英俊生物技术公司进行双向测序。测序所得的序列再与保守区序列设计兼并引物扩增得到的cDNA中间片段的序列利用CLUSTAL X (1. 8)软件进行拼接。实施例5 兜兰i^F-like MADS-box基因序列的生物信息学分析
将拼接的测序结果在NCBI用Blast软件进行同源性比对，结果表明，该基因的cDNA序列与爪唇兰(G ^ahaia)、芳香绶草仏oi/oraia)、长叶美洲兜兰0°. longifoliun^M^ 子兰(K plani folia )的全长i^F-like MADS-box基因的cDNA序列同源性分别高达85%， 84%, 82%和78%。ORF Finder分析表明，该基因cDNA全长1039bp，在73bp处有起始密码子 ATG,在745bp处有终止密码子TGA，在IOlObp处有polyA附加信号，具有675bp完整的开放读码框，编码2M个氨基酸。该基因cDNA序列编码的氨基酸序列在NCBI数据库进行Blast 分析，结果表明该氨基酸序列具有典型的MADS结构域和K结构域，与长叶美洲兜兰仏 Iongifolium)、芳香绶草(5 odorata )、爪唇兰(β. galeata )和香子兰(K planifolia )的 DEF-Iike MADS-box基因编码的蛋白序列的同源性分别为91%、拟％、80%和78%。系统进化树分析表明，该兜兰MADS-box基因属于花器官发育B类基因的i^F亚家族。实施例6 兜兰i^F-1 ike MADS-box基因在其不同器官中的表达模式分析分别提取同色兜兰花的子房、萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱，以及苞叶的总RNA，再将不同样
品的总 RNA (1 μ g)分别反转录为 cDNA 第一链(PrimeScript Reverse Transcriptase kit, Takara)。根据前述的核苷酸序列SEQ ID NO. 1，设计半定量RT-PCR引物F2 (5，— 3，) AGCCCGATTTAGGGATACAA, DEF R2 (5，— 3，) ATACTCTTGGCGTCGGTGGA,目的片段长为222bp。以兰花T^Wi/ 为内参基因，引物序列为Tubulin-Y (5，一 3，) GGATTAGGCTCTCTGCTGTTGG, Tubulin-R (5，— 3，) GTGTGGATAAGACGCTGTTGTATG，目的片段长约为130bp。以第一链cDNA稀释后作为半定量RT-PCR的反应模板。反应体系为 25 μ 1，包含 IOXBuffer (Mg2+ plus) 2. 5μ 1, dNTP Mix (10 mM of each dNTP) 1. 0μ 1, r taq (5U/μ 1) 0. 2μ 1, Deionized H2O 17. 3 μ 1，10 μ M 正反向基因特异引物各 1. 0 μ 1， 稀释的 cDNA 第一链 2. 0μ 1。PCR 反应程序为94°C 4 min ；94°C 30 s，58°C 30 s，72°C，45 s,30 cycles ；72°C,7 min。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
权利要求
1.一种分离出的兜兰i^F/CTBW (DEF)-\i\Q MADS-box基因，其特征在于，具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的兜兰i^F/CTBW(DEF)-Iike MADS-box基因，其特征在于，编码框的位置位于73bp-747bp，在73bp处有起始密码子ATG，在745bp处有终止密码子TGA，在 1010 bp处有polyA附加信号，该序列无内含子，具有675 bp完整的开放读码框，编码224 个氨基酸的多肽。
3.一种如权利要求1或2所述兜兰i^F/CTBW (DEF)-Iike MADS-box基因编码的多肽，其特征在于，具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
4.一种兜兰i^F/CTBW (DEF)-Iike MADS-box基因在其花器官中表达模式的分析方法，其特征在于包括如下步骤分别提取兜兰花的子房、萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱，以及苞叶的总RNA，再将不同样品的总 RNA分别反转录为cDNA第一链；根据核苷酸序列SEQ ID N0. 1，设计如下引物作为Real-time PCR的引物来扩增目的片段长为222bp的特异区段DEF F2 (5，— 3’) AGCCCGATTTAGGGATACAA<SEQ ID NO. 10>， DEF R2 (5，— 3’) ATACTCTTGGCGTCGGTGGA<SEQ ID Ν0· 11>， 以兰花Tubu 1 in为内参基因，设计特异引物 Tubulin- & — 3' ) GGATTAGGCTCTCTGCTGTTGG<SEQ ID NO. 12>， Tubul— 3’) GTGTGGATAAGACGCTGTTGTATG<SEQ ID NO. 13>， 扩增长为130 bp目的片段；根据Real-time PCR试验结果，根据兜兰i^F/CTBW (DEF)-Iike MADS-box基因在各花器官中的表达量进行表达模式的分析。
全文摘要
本发明提供一种兜兰DEFICIENS(DEF)-likeMADS-box基因序列及由该基因序列编码的多肽。另外，本发明还公开了获取兜兰DEF-likeMADS-box基因克隆的方法，该方法是以近源物种DEF-likeMADS-box基因的氨基酸保守区设计兼并引物，从兜兰花中提取总RNA，用LD-PCR法扩增，结合RACE技术克隆得到兜兰的DEF-likeMADS-box基因的全长cDNA序列。本发明的兜兰DEF-likeMADS-box基因是一个新的与兜兰花发育相关的基因，该基因既参与兜兰的营养生长，又参与兜兰的生殖生长。因此，本发明提供的兜兰DEF基因，不仅有利于揭示兜兰花器官发育的分子机制，还可为基因工程改良植物的生命进程，尤其是植物的花发育提供了一定的依据。
文档编号C12Q1/68GK102260681SQ20111015897
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者吕复兵, 操君喜, 朱根发, 李冬梅 申请人:广东省农业科学院花卉研究所