专利名称：大体积水样中富集水体中病毒的方法
技术领域：
本发明属于环境监测技术领域，具体涉及一种大体积水样中过滤富集水体中病毒的方法。
背景技术：
饮用水的生物安全性问题是饮用水安全保障最核心的问题之一，但是目前的众多学者的研究基本集中于对细菌的相关研究，而对于饮用水中的病毒的研究相对较少。而病毒在水中存在相当普遍，水中病毒在数量上以肠道病毒为主，但危害较大，为水病毒工作者所关注的是传染性肝炎病毒。传染性肝炎病毒的经水传播，国内外已有多次实例和报道。例如1955-1956 —年间发生的印度新德里传染性肝炎大流行，一个月中有3000个病例，经调查是由饮用水源受到严重污染而氯消毒不充分所致；1986年以来我国新疆南部发生的非甲非乙型肝炎大流行，波及14个县市，发病12万余人，原因是饮用水污染引起的；1988年上海甲肝流行长达4个月也是间接由水污染引起。病毒并非肠道正常菌丛， 仅仅存在于感染个体，因此，通常以比大肠菌低得多的数量从粪便排出。因水中病毒浓度一般较低，约在103PFU/100L，特别是消毒后水，需经大量水样浓集后才能检出，因此寻找检验大量水样的简单、快速、敏感可靠的浓集方法是水中病毒检验方法研究的重要课题。水中病毒的浓集与细菌不同。细菌的浓集可完全依靠机械阻留于膜上，而病毒因颗粒直径很小，一般多基于吸附、相分离、强离心沉淀、电泳及免疫化学等作用，基本方法可分为二类(1)吸附洗脱法。包括膜吸附法、可沉淀的盐类、氧化铁、聚电解质吸附方法、 氢氧化铝和植物絮凝吸附法和玻璃粉吸附法、相分离法等。(2)以病毒物理学特征为基础的方法，如超速离心法、反渗透法、电渗析法和脱水透析法等。在上述方法中一般认为超速离心、电泳及电渗析法等不仅需要一定的设备条件，而且检水量有限，作为辅助手段用于病毒再浓集是可行的，但在大量水中病毒的浓集检验中未能广泛应用。聚合物两相分离法适用于定量检验或分离小量浑浊水中的病毒。尽管膜吸附法可用来检验体积大的水样， 但是也存在操作复杂、成本高、易堵塞等问题，很难应用在饮用水水源地以及水厂的病毒富集。吸附洗脱法师利用各种的吸附剂来吸附病毒，再用一定的洗脱剂将其洗脱下来， 被广泛应用于水环境中病毒的富集检测及去除环境污水中各类病原体。其中，膜吸附法因其具有较高的病毒回收率、所需装置简单、处理量大等，而得到较为广泛的应用，并成功应用在饮用水消毒、蛋白质溶液中去除病毒等。膜吸附法主要利用病毒在电化学反应下对滤材表面具有可逆性吸附力的原理进行浓集的方法。操作程序为在一定条件下使水中病毒吸附于滤材上达到浓集的目的，然后用少量洗脱剂将病毒洗脱回收。常用滤材为纤维素酷或玻璃纤维滤膜，因采用的有机树脂粘合剂的不同，滤材可分为表面带有阴电荷或阳电荷的两种。阴电荷滤材吸附病毒需将被检水调至ρΗ3.(Γ3.5，即达到病毒蛋白质等电点以下，并加少量多价阳离子，如Al3+和Mg2+等促进病毒表面电荷的改变，方可产生良好的吸附效果。而阳电荷滤材可在广泛的pH 范围有效的吸附病毒，不需要调节水样PH和加多价盐类。不仅操作简便，而且可取得与阴电荷滤材可比较的回收效果。膜吸附法过程中，水样中的悬浮物易阻塞滤芯，限制了检测的水样量并可能干扰洗脱过程；另外，水中的有机物可能会与病毒产生竞争性吸附，会干扰病毒的有效吸附和洗脱。吸附病毒的洗脱，通常是原位通过滤器过滤小量洗脱液达到洗脱的目的。常用洗脱液为微碱性的(PH9. 0)牛肉浸液、营养肉汤或较强碱性的(ρΗΙΟ. 5或11. 0)的甘氨酸溶液。一般牛肉浸液或营养肉汤洗脱效果较好，但用于大量水中病毒检出，需要再浓集时比较困难。而甘氨酸洗脱效率一般较低，特别是在较强的碱性条件下，病毒不够稳定。 为此，有人提出以降低使牛肉浸液产生絮凝再浓集初级洗脱液中病毒的方法。因此针对较大体积的水样，建立有效、快捷的水中病毒的浓缩、洗脱方法，对饮用水中的致病病毒进行快速有效的检测，了解饮用水水源地和水厂中病毒污染状况，对于保障饮用水安全、保证人类健康有着非常重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便、快速过滤富集水体中病毒的方法，以便能快速有效的检测饮用水中的致病病毒，了解饮用水水源地和水厂中病毒污染状况，保障饮用水安全。本发明提供的采样富集水体中病毒的方法，无需对水样进行调节PH值、预过滤等前处理，只需去除水样中残存的氯、氯胺等消毒剂，以提高后续检测的准确性；该方法可用于水样量大且水量变化大的自来水厂进水和出水中病毒的检测，水样量的变化较大，从进水水样的50L到出水水样的500L，均可适用；该方法对病毒采集装置均进行UV消毒，提高了病毒富集和检测的准确度。在采样、富集水体中病毒之前，先对采集装置进行消毒处理，病毒采集装置包括滤器、取样桶、硅橡胶管、离心管等，用UV (紫外线)灭菌M小时以上。本发明提供的采样富集水体中病毒的方法，具体步骤为
(1)采集水样，并对水样进行前处理，消除水样中残余的消毒剂
采集水样，水样量原水为5(T100 L，滤后水或水厂出水为25(T500 L ；对采来的水样进行前处理，即用亚硫酸钠去除氯、氯胺、臭氧等消毒剂，以去除消毒剂对病毒的影响，所投加的亚硫酸钠的量根据水中残余的消毒剂的量确定；当水体中大粒径的悬浮颗粒物过多时，需先采用消毒过的纱布进行过滤处理；
(2)过滤
通过蠕动泵，以4 7 L/min的速度抽取实际水样，利用过滤系统，以负压抽滤经步骤1 处理的水样，将水样中的病毒富集于过滤系统的滤芯上，其中滤芯为阳电荷的混合纤维酯微孔滤膜；
(3)洗脱病毒
将富集了水中病毒的滤芯从滤器中取出，放入PH为8. 5 10的20(T600 mL牛肉浸膏洗脱液中浸泡广5 min，然后取出，再放入pH为8.5 10的200 400 mL的牛肉浸膏洗脱液中浸泡2飞min，弃去滤芯，合并两次的洗脱液。其中牛肉浸膏洗脱液中，牛肉膏的浓度为 1. 0 3· 0% (M/V, mg/mL),甘氨酸的浓度为 0. 02 0. 06 M ；
(4)洗脱液浓缩
将上一步骤获得的洗脱液置于低温冷冻离心机中，在4°C、300(T5000 r/min离心1(Γ20 min，将细菌分离出去，收集上清液，加入生物絮凝剂PEG 8000溶液，再于4°C、6000 10000 r/min离心3(T60 min后，弃去上清液，保留离心管底部的沉淀物。其中生物絮凝剂PEG8000 溶液为 26% 36% 的 PEG、0. 6 1. Omol/L 的 NaCl ；
(5)重悬浓缩液
在上一步骤获得的沉淀物中加入广6 mL 0.广0.4 mol/L的PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液，pH 6. 8^7. 6)溶液，充分溶解离心管底部沉淀物，得到重悬的水中病毒的浓缩液。然后，采用现有的方法测定该样品的病毒效价，根据实际抽取的水样量计算实际水中的病毒效价。本发明的优点
本发明利用高容量的滤芯对水体中的病毒进行过滤、洗脱、浓缩来实现大水样量 (50^500 L)的水体中病毒的富集；本方法不需要对水样进行预处理、不需要调节pH值，水中少量的悬浮物也不会对病毒的富集产生影响；本方法对病毒采集装置进行了 UV消毒，提高了后续病毒富集和检测的准确度。众多优点能使后续病毒检测的灵敏度大大提高，从而实现了对水体中病毒的有效监测。相对于传统的病毒富集方法，该方法操作简单、步骤简洁、设备要求不高且省时，便于在水厂和水源地等基层推广应用。
图1是本发明病毒富集一体化方法的实施例结构示意图。图2是图1实施例的病毒富集方法的工作流程框图。图中标号1-取样桶，2-搅拌器，3-大流量蠕动泵，4-过滤器，5-滤器中的滤芯， 6-盛放洗脱液的容器，7-离心机，8-样品瓶。
具体实施例方式下面通过实施例进一步描述本发明。在采样、富集水体中病毒之前，先对采集装置进行消毒处理，病毒采集装置包括滤器、取样桶、硅橡胶管、离心管等，用UV (紫外线)灭菌M小时以上；
本发明提供的富集水体中病毒的方法，具体步骤为
1、采集水样，并对水样进行前处理，消除水样中残余的消毒剂
采集水样，水样量原水为5(T100 L，滤后水或水厂出水为25(T500 L ；对采来的水样
进行前处理，用亚硫酸钠去除氯、氯胺、臭氧等消毒剂，以去除消毒剂对病毒的影响；
2、过滤
通过大功率的蠕动泵，以圹7 L/min的速度抽取实际水样(原水5(T100 L，滤后水和水厂出水25(T500 L)，利用过滤系统，以负压抽滤经步骤1前处理的水，将水中的病毒富集于过滤系统的滤芯上，其中滤芯为阳电荷的混合纤维酯微孔滤膜；3、洗脱病毒
将富集了水中病毒的滤芯从滤器中取出，放入pH为9. 5的400 mL牛肉浸膏洗脱液中浸泡2 min，然后取出再放入350 mL的牛肉浸膏洗脱液中浸泡4 min，弃去滤芯，合并两次的洗脱液。其中牛肉浸膏洗脱液中，牛肉膏的浓度为1.5% (M/V，mg/mL)，甘氨酸的浓度为 0. 05 M ；
4、洗脱液浓缩
将上一步骤获得的洗脱液置于低温冷冻离心机中，在4°C、4000 r/min离心15 min，将细菌分离出去，收集上清液，加入生物絮凝剂PEG 8000溶液，再于4°C、7000 r/min离心40 min后，弃去上清液，保留离心管底部的沉淀物。其中生物絮凝剂PEG8000溶液为32%的 PEG、0. 8mol/L 的 NaCl ；
5、重悬浓缩液
在上一步骤获得的沉淀物中加入5 mL 0.2 mol/L的PBS (Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液，pH 7. 2)溶液，充分溶解离心管底部沉淀物，得到重悬的水中病毒的浓缩液。 然后，采用现有的方法测定该样品的病毒效价，根据实际抽取的水样量计算实际水中的病毒效价。 以本发明的方法富集了中国南方某市A和B两个自来水厂的原水及各处理单元出水的样本进行检测，从而调查病毒在各工艺段出水中存在状况，确定本方法的可行性和实用性。其中，A水厂为一座国内自行设计、建造的大型水厂，水源取自甲河上游，其每日处理量为160万吨，处理流程为传统的给水处理工艺，其处理工艺简单，即为传统的混凝沉淀、 砂滤及消毒。其消毒工艺为氯胺消毒，保证出水余氯为1.5 2.0 mg/L。B水厂水源取自乙河，其每日处理量为4万吨。由于原水中微污染程度较重，B水厂处理流程与传统工艺不同，增加了生物预处理、生物活性炭等处理单元，其消毒工艺为氯胺消毒，保证出水余氯为1.5 2.0 mg/L。以MS2噬菌体(F-特异性噬菌体)为肠道病毒的指示物，以ΦΧ174噬菌体(体细胞噬菌体)反映整体上受病毒污染的程度。富集病毒后进行检测，结果见表1和2。表1 A水厂原水及各工艺段病毒检出情况
权利要求
1.一种富集水体中病毒的方法，其特征在于具体步骤为(1)采集水样，并对水样进行前处理，消除水样中残余的消毒剂；(2)过滤通过蠕动泵，以4 7 L/min的速度抽取实际水样，利用过滤系统，以负压抽滤经步骤1 处理的水样，将水样中的病毒富集于过滤系统的滤芯上，其中滤芯为阳电荷的混合纤维酯微孔滤膜；(3)洗脱病毒将富集了水中病毒的滤芯从滤器中取出，放入PH为8. 5^10的20(T600 mL牛肉浸膏洗脱液中浸泡广5 min，然后取出，再放入pH为8.5 10的200 400 mL的牛肉浸膏洗脱液中浸泡2飞min，弃去滤芯，合并两次的洗脱液；其中牛肉浸膏洗脱液中，牛肉膏的浓度为 1. 0 3· 0% (mg/mL),甘氨酸的浓度为0. 02 0. 06 M ；(4)洗脱液浓缩将上一步骤获得的洗脱液置于低温冷冻离心机中，在4°C、300(T5000 r/min离心10 20 min，将细菌分离出去，收集上清液，加入生物絮凝剂PEG 8000溶液，再于4°C、6000 10000 r/min离心3(T60 min后，弃去上清液，保留离心管底部的沉淀物；其中生物絮凝剂PEG8000 溶液为 26% 36% 的 PEG、0. 6 1. Omol/L 的 NaCl ；(5)重悬浓缩液在上一步骤获得的沉淀物中加入广6 mL 0.广0.4 mol/L的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的PH 6. 8^7. 6，充分溶解离心管底部沉淀物，得到重悬的水中病毒的浓缩液；然后，测定该样品的病毒效价，根据实际抽取的水样量计算实际水中的病毒效价。
2.根据权利要求1所述的富集水体中病毒的方法，其特征在于预先对病毒采集装置用紫外线灭菌M小时以上。
3.根据权利要求1或2所述的富集水体中病毒的方法，其特征在于步骤(1)中采集水样的量原水为5(T100 L，滤后水或水厂出水为25(T500 L ；对采来的水样用亚硫酸钠去除氯、氯胺、臭氧消毒剂。
4.根据权利要求1或2所述的富集水体中病毒的方法，其特征在于当水体中大粒径的悬浮颗粒物过多时，先采用消毒过的纱布进行过滤处理。
5.根据权利要求1或2所述的富集水体中病毒的方法，其特征是步骤(2)中所采用的过滤系统选用美国NanoCeram公司的过滤系统。
全文摘要
本发明属于环境监测技术领域，具体涉及一种大体积水样中富集水体中病毒的方法。本发明方法，包括如下步骤病毒采集装置灭菌；消除水样中的残余消毒剂；利用经消毒过的过滤系统以负压抽滤水样；将富集了水中病毒的滤芯放入pH为9.5的牛肉浸膏洗脱液中浸润；将洗脱液先用离心机离心，将细菌分离出去，收集上清液，加入PEG8000溶液，再用离心机离心，弃去上清液，保留离心管底部的沉淀物；沉淀物中加入PBS，得到重悬的病毒浓缩液。本方法操作简单、步骤简洁、对设备要求不高，且适用于现场将大体积的水样浓缩成小样本浓缩液后用于实验室检测。
文档编号C12Q1/70GK102260751SQ201110204518
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月21日 优先权日2011年7月21日
发明者代瑞华, 刘燕, 刘翔, 张云, 张强, 查晓松, 蔡璇 申请人:复旦大学