专利名称：两阶段溶氧量控制发酵生产环磷酸腺苷的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种两阶段溶氧量控制发酵生产环磷酸腺苷的方法。
背景技术：
环憐酸腺苷(cyclicadenosine monophosphate,简称 cAMP),是一种核苷酸的衍生物，对于糖与脂肪的代谢，核酸和蛋白质的合成等发挥着重要的调节作用。在临床上，环磷酸腺苷在特定条件下对癌细胞有抑制作用，且血浆及体组织中cAMP代谢水平测定对肿瘤患者的早期诊断、肿瘤监视及患者预后有一定参考价值；cAMP可激活脂肪分解酶，促进脂肪分解及脂类代谢，防止动脉粥样硬化(牛淑玲，刘静波.1996.环核苷酸的应用效应.吉林畜牧兽医，5 42 43)。在畜牧业上，cAMP有着广阔的应用前景，其作用机理为 cAMP作为激素的第二信使，激活蛋白激酶，使代谢酶活性增强，从而加强体内蛋白的合成，增快动物的生长速度；诱导激素(如生长激素等)或酶的合成，促进机体的合成代谢(汪善锋，陈安国.2003.环腺苷酸的生理功能及在动物生产中的应用.10 :3 5)。目前，环磷酸腺苷国内需求以每年20%的速度增长，而全球市场也以15%的速度递增，年用量达上百吨，具有良好的市场前景。cAMP的生产方法有化学合成法、酶法和发酵法三种。国内外产业化生产全部采用化学合成法，以AMP为原料，采用高效分离柱进行中间体分离，溶剂损耗量大，收率低，成本偏高，产量小，以及严重的环境污染制约着它的大规模生产。酶法只在国外有报道，是利用液化短杆菌提取的腺苷酸环化酶，在丙酮酸存在下，可以高效地催化ATP生成cAMP,收率几乎达到了 100% (Kurashina Y, Takai T,Hori C, Okamoto H. 1974.Adenylate cyclase from Brevibacterium liquefaciens.Reversibility and thermodynamic studies. J Biol Chem. 249 :4824 4827)。但是该方法的生产规模有限(仅仅达到克规模)，离真正的产业化还有较大的距离。相比之下，微生物发酵法生产cAMP，条件温和，副产物少，环境污染小，是一种以生物技术为特征的绿色工业，在低碳经济的背景下，具有很重要的现实意义。因此，很有必要开发新的发酵生产环磷酸腺苷的方法。
发明内容
因此，本发明的目的是，基于本发明人早期筛选出的高产环磷酸腺苷的菌株，提供一种两阶段溶氧量控制发酵生产环磷酸腺苷的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。本发明提供一种发酵生产环磷酸腺苷的方法，所述方法采用两阶段溶氧量控制的方式分批发酵生产环磷酸腺苷，发酵菌株为保藏编号为CGMCC No. 3584的节杆菌。所述节杆菌(Arthrobacter sp.) A302,菌落呈圆形，湿润，表面光滑，直径为约I. 5 2mm，革兰氏阳性，菌株为专性好氧，不生孢，不抗酸，化能异养，最适PH值为7.0。
优选地，所述两阶段溶氧控制的操作如下在菌体生长期阶段控制溶氧量为20 30%，菌体量达到稳定之后，控制溶氧量为5 10%，直至发酵结束。优选地，其中所述菌体生长期阶段为O 18h，所述菌体量达到稳定的时间约为18h。优选地，所述方法中pH控制为6. 5 7. 5。优选地，所述pH的控制通过流加碱性物质来实现。优选地，所述碱性物质选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水和碳酸钠中的一种或几种。优选地，所述初始发酵培养基中含有碳源、氮源、无机盐和环磷酸前体物质。优选地，所述碳源选自糖蜜、葡萄糖、蔗糖、果糖中的一种或几种；更优选地，所述碳源的初始浓度为O. 01 100g/L，优选为30 50g/L。 优选地，所述氮源选自酵母粉、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、尿素、硫酸铵中的一种或几种；更优选地，所述氮源的初始浓度为O. 01 100g/L，优选为10 30g/L。优选地，所述无机盐选自钾盐、钠盐、镁盐、碳酸盐、硫酸盐中的一种或几种；更优选地，所述无机盐的初始浓度为O. 01 100g/L，优选为I 10g/L。优选地，所述环磷酸前体物质选自腺苷、腺苷单磷酸、腺苷三磷酸、腺嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、肌苷酸中的一种或几种；更优选地，所述磷酸前体物质的初始浓度为0.01 100g/L，优选为 I 10g/L。优选地，所述分批发酵生产环磷酸腺苷的条件如下接种量5 10% (v/v)，pH为
6.5 7. 5，发酵温度25 40°C，优选28 32°C，培养时间50 60h，通过搅拌转速和通气量按照以下要求控制溶氧量在菌体生长期，例如O 18h，控制溶氧量为20 30%，在菌体量达到稳定之后，例如18h 60h，控制溶氧量为5 10%。在本发明提供的一个优选实施方案中，所述方法包括以下步骤1)斜面培养将冷藏的发酵菌株接种到斜面上，30°C培养箱培养48h活化；2)种子培养从活化的斜面挑取一环菌体接入种子培养基，30°C，200r/min，培养18h ；3)分批发酵培养5 10% (v/v)，pH为6. 5 7. 5，发酵温度25 40°C，培养时间50 60h，初始通气量I. O I. 5vvm,初始搅拌转速300 400r/min，通过搅拌转速和通气量按照以下要求控制溶氧量在O 18h，控制溶氧量为20 30%，在18h至发酵结束，控制溶氧量为5 10%。由于cAMP的生物合成是一个好氧反应，氧气充足而合适的供应是产物提高的前提，通过以往的发酵溶氧曲线可知，恒定转速下的溶氧曲线会出现前期几乎为零的溶氧饥饿状态，而在后期又会超过50%，并没有被菌体充分利用的情况。溶氧过低，会对菌体的生长不利，从而影响cAMP的产量，溶氧过高，则会使菌体大量迅速合成，底物大量被消耗，导致流向产物的碳源相对不足，也使终产率下降。综上所述，本发明人摸索出发酵菌体不同阶段的溶氧需求，由此提供一种两阶段溶氧控制策略，第一阶段菌体生长阶段(O 18h)控制溶氧量为20 30%，避免了发酵前期溶氧过低对菌体的生长不利，同时可以减少副产物乳酸、乙酸等有机酸的形成；18h后，当菌体量达到稳定时，调整溶氧量为5 10%，继续培养30 40h，直至发酵结束，此时避免发酵后期无需过高溶氧而产生的搅拌功率和空气供应的浪费。所述溶氧量的控制以离线检测发酵液中乳酸浓度作为参考信号，使整个发酵过程乳酸浓度控制在20mmol/L以下，过高则适当增加溶氧。此外，发酵液的PH设定点为6. 5，当pH降到设定点以下时，加入碱性物质流加液，例如6 10mol/L的氢氧化钠，氢氧化钾，氨水或碳酸钠，直至pH回到设定点。与现有技术相比，本发明提供的两阶段溶氧控制策略发酵生产环磷酸腺苷的方法的优益之处在于，根据菌体不同阶段的溶氧需求特点，提供一种两阶段溶氧控制策略，工艺简单易行，可以大大提高底物的利用效率，与不控制溶氧相比，发酵产物环磷酸腺苷的产量提高56.2%。并且减少发酵过程中有机酸的产生。而且本发明参考发酵过程中乳酸的浓度信号适时变化溶氧，操作更加合理有据，发酵过程中无需增加额外设备，还可以节约发酵后期的搅拌和供气的电能，适合于工业化生产。此外，与传统的化学法合成相比，还具有反应条件温和，环境污染小，副产物少等优点。生物材料的保藏节杆菌(Arthrobacter sp. )A302已经于2010年I月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院，中科院微生物研究所(邮编=100101)，保藏编号为CGMCC No. 3584。关于节杆菌A302的详细信息，还可参见本申请人于2010年6月4日提交的中国发明专利申请201010191515. 6。
具体实施例方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。以下各实施例中所使用的菌株扩培方法如下I)斜面培养基(g/L)配方葡萄糖10、蛋白胨10、酵母膏5、牛肉膏10、氯化钠3、琼脂20。将冷藏的发酵菌株接种到斜面上，30°C培养箱培养48h活化。
0030]2)种子培养基(g/L)配方葡萄糖10、蛋白胨10、酵母膏5、牛肉膏10、氯化钠3、生物素O. 001、酸水解酪蛋白5。从活化的斜面挑取一环菌体接入种子培养基，300C，200r/min,培养18h扩培。以下各实施例中发酵产物cAMP含量所采用的分析方法如下发酵液中的产物cAMP采用Agilent 1100高效液相色谱仪测定(HPLC)。色谱柱江苏淮阴汉邦科技有限公司Lichrospher C18 (4. 6x250mm, 5 μ m),柱温30°C,检测器为紫外检测器(254nm)，流动相为V (甲醇)V (pH6. 6的磷酸三乙胺溶液)=30 : 70 ;流速O. 8mL/min ;进样量20μ L。精确称取环磷腺苷的标准品，用重蒸三重水配制成质量浓度约50mg/L的标准品溶液；将经预处理的样品用去离子水稀释至适当浓度，并用O. 45 μ m微孔膜进行过滤后，作为样品溶液待检测，发酵样品根据峰面积计算cAMP产量。实施例I发酵培养基(g/L):葡萄糖50、磷酸氢二钾10、磷酸二氢钾10、硫酸镁I、蛋白胨4、生物素O. 003、次黄嘌呤6 ;于121°C高压蒸汽灭菌15min。在发酵罐(BioFlo110 7. 5L NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC)中加入培养基，装液量3L，灭菌后，以10%接种量接种，温度30°C，通气量I. 5vvm，转速300r/min，标定溶氧百分点。溶氧参数和叶轮转速关联，并配以适当的通风量，在发酵第一阶段(约O 18h)控制溶氧量为30 %，第二阶段(约18 60h)控制溶氧量为10 %。通过流加质量浓度为20 %的氨水控制pH 7.0。发酵60h结束后，HPLC检测，cAMP含量为9. 87g/L，生产强度为O. 165g/ (L · h)。
实施例2发酵培养基(g/L):糖蜜50、磷酸氢二钾10、磷酸二氢钾10、硫酸镁10、蛋白胨4、生物素O. 003、腺苷6，于121°C高压蒸汽灭菌15min。在发酵罐(BioFlo1107. 5L NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC)中加入培养基，装液量3. 5L，灭菌后，以8 %接种量接种，温度32°C，通气量I. 2vvm，转速350r/min，标定溶氧百分点。溶氧参数和叶轮转速关联，并配以适当的通风量，在发酵第一阶段(约O 18h)控制溶氧量为30%，第二阶段(约18 60h)控制溶氧量为8%。通过流加质量浓度为20%的氢氧化钠控制PH7. 2。发酵54h结束后，HPLC检测，cAMP含量为9. 64g/L，生产强度为O. 179g/(L · h)。实施例3发酵培养基(g/L):蔗糖50、磷酸氢二钾10、磷酸二氢钾10、硫酸镁10、蛋白胨4、生物素O. 003、腺苷三磷酸6，于121 °C高压蒸汽灭菌15min。在发酵罐(BioFlo110 7. 5L NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC)中加入培养基，装液量4L，灭菌后，然后以5 %接种量接种，温度28 V，通气量I. Ovvm,转速400r/min，标定溶氧百分点。溶氧参数和叶轮转速关联，并配以适当的通风量，在发酵第一阶段(约O 18h)控制溶氧量为25%，第二阶段(约18 60h)控制溶氧量为5%。通过流加质量浓度为20%的氢氧化钾控制PH 7.5。发酵60h结束后，HPLC检测，cAMP含量为9. 04g/L,生产强度为O. 151g/(L · h)。实施例4发酵培养基(g/L):糖蜜50、磷酸氢二钾10、磷酸二氢钾10、硫酸镁10、蛋白胨4、生物素O. 003、腺嘌呤6，于121°C高压蒸汽灭菌15min。在发酵罐(BioFlo1107. 5L NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC)中加入培养基，装液量
3.5L，灭菌后，然后以8 %接种量接种，温度30°C，通气量I. 2vvm，转速350r/min，标定溶氧百分点。溶氧参数和叶轮转速关联，并配以适当的通风量，在发酵第一阶段(约O 18h)控制溶氧量为30 %，第二阶段(约18 60h)控制溶氧量为5 %，通过流加质量浓度为20 %的氨水控制pH 7. 2。发酵54h结束后，HPLC检测，cAMP含量为8. 89g/L，生产强度为O. 165g/ (L · h)。实施例5发酵培养基(g/L):葡萄糖50、磷酸氢二钾10、磷酸二氢钾10、硫酸镁10、蛋白胨
4、生物素O.003、肌苷6，于121°C高压蒸汽灭菌15min。在发酵罐(BioFlo1107. 5L NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC)中加入培养基，装液量3L,灭菌后，然后以10%接种量接种，温度32°C，通气量I. 5vvm,转速300r/min，标定溶氧百分点，然后溶氧参数和叶轮转速关联，并配以适当的通风量，在发酵第一阶段(约O 18h)控制溶氧量为25 %，第二阶段(约18 60h)控制溶氧量为8 %。通过流加质量浓度为20 %的氢氧化钠控制pH 7.0。
发酵60h结束后，HPLC检测，cAMP含量为9. 43g/L，生产强度为O. 157g/(L · h)。对比例I未采取两阶段溶氧控制进行分批培养，其他条件均与实施例I的方法相同。最终检测发酵产物cAMP的含量为6. 32g/L，生产强度为O. 105g/ (L · h)。对比例2 在发酵第一阶段(约O 18h)控制溶氧量为5%，第二阶段(约18 60h)控制溶氧量为40%，其他条件均与实施例I的方法相同。最终检测发酵产物cAMP的含量为7. 52g/L，生产强度为O. 125g/ (L · h)。
权利要求
1.一种发酵生产环磷酸腺苷的方法，所述方法采用两阶段溶氧量控制的方式分批发酵生产环磷酸腺苷，发酵菌株为保藏编号为CGMCC No. 3584的节杆菌。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述两阶段溶氧量控制的操作如下在菌体生长期阶段控制溶氧量为20 30%，在菌体量达到稳定之后控制溶氧量为5 10%。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法中pH控制为6.5 7. 5 ;优选地，所述PH的控制通过流加碱性物质来实现；更优选地，所述碱性物质选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水和碳酸钠中的一种或几种。
4.根据权利要求I至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述初始发酵培养基中含有碳源、氮源、无机盐和环磷酸前体物质。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述碳源选自糖蜜、葡萄糖、蔗糖、果糖中的一种或几种；优选地，所述碳源的初始浓度为O. 01 100g/L，优选为30 50g/L。
6.根据权利要求I至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述氮源选自酵母粉、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、尿素、硫酸铵中的一种或几种；优选地，所述氮源的初始浓度为0.01 .100g/L，优选为 10 30g/L。
7.根据权利要求I至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述无机盐选自钾盐、钠盐、镁盐、碳酸盐、硫酸盐中的一种或几种；优选地，所述无机盐的初始浓度为O. 01 100g/L，优选为I 10g/L。
8.根据权利要求I至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述环磷酸前体物质选自腺苷、腺苷单磷酸、腺苷三磷酸、腺嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、肌苷酸中的一种或几种，优选地，所述磷酸前体物质的初始浓度为0. 01 100g/L，优选为I 10g/L。
9.根据权利要求I至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述分批发酵生产环磷酸腺苷的条件如下接种量5 10%卜八)，？!1为6.5 7.5，发酵温度25 401，培养时间.50 60h，通过搅拌转速和通气量按照以下要求控制溶氧量在菌体生长期，例如O 18h，控制溶氧量为20 30 %，在菌体量达到稳定之后，例如18 60h，控制溶氧量为5 10 %。
10.根据权利要求I至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤 1)斜面培养将冷藏的发酵菌株接种到斜面上，30°c培养箱培养48h活化； 2)种子培养从活化的斜面挑取一环菌体接入种子培养基，30°C，200r/min，培养18h； 3)分批发酵培养5 10%(v/v), pH为6. 5 7. 5，发酵温度25 40°C，培养时间.50 60h，初始通气量I. O I. 5vvm,初始搅拌转速300 400r/min，通过搅拌转速和通气量按照以下要求控制溶氧量在O 18h，控制溶氧量为20 30%，在18 60h，控制溶氧量为5 10%。
全文摘要
本发明提供一种两阶段溶氧量控制发酵生产环磷酸腺苷的方法。本发明提供的方法采用两阶段溶氧量控制的方式分批发酵生产环磷酸腺苷，发酵菌株为保藏编号为CGMCC No.3584的节杆菌，在菌体生长期阶段控制溶氧量为20～30％，在菌体量达到稳定之后控制溶氧量为5～10％。本发明提供的方法可以显著提高环磷酸腺苷的产量，发酵过程中无需增加额外设备，还可以节约发酵后期的搅拌和供气的电能，适合于工业化生产。
文档编号C12P19/32GK102899372SQ20111021088
公开日2013年1月30日 申请日期2011年7月26日 优先权日2011年7月26日
发明者应汉杰, 陈晓春, 李磊, 柏建新, 陈勇, 谢婧婧, 吴菁岚 申请人:南京工业大学