专利名称:冬虫夏草无性阶段连续发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种冬虫夏草(Cordyceps sinensis(BerK.)Sacc.)无性阶段的发酵工艺，特别是以中国被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu etZeng.)为发酵菌种的液体连续发酵工艺。
背景技术：
冬虫夏草是一种名贵的菌类中药材，是麦角菌科虫草属的一个种，寄生于蝙蝠蛾科幼虫体上完成的有性阶段。由于冬虫夏草是嗜低温菌，寄生于只生长在3500-5000公尺高原草甸的虫草蝙蝠蛾幼虫，故难以人工培养。自二十世纪八十年代以来，对冬虫夏草的研究逐渐增多，1984年陈庆涛先生认为中国拟青霉(Paeciomyces sinensis Chen，Xiao et Shi.)是冬虫夏草的无性阶段(陈庆涛等1984，中国拟青霉新种与虫草的关系。真菌学报324-28)，沈南英认为冬虫夏草头孢霉(Cephalospores DongchongxiacaeSp.nev)是冬虫夏草的无性阶段(沈南英人工培养冬虫夏草，申请号85101971)。
通过无性阶段的人工发酵，也得到了成分与野生冬虫夏草类似的物质。
本发明人在公开号为1031393的专利文件中公开了冬虫夏草无性阶段真菌中国被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.)，其保藏号为CCTCC No.M87101，还公开了其培养方法，并在文献中公开了该菌株的菌学特征(刘锡琎等，冬虫夏草无性阶段的分离和鉴定真菌学报，1988，8(1)，35-40)。
使用中国被毛孢为发酵菌种的液体发酵工艺采用发酵完成一罐，清理后再上一罐的间歇性发酵工艺，如公告号为CN 1036531C的“冬虫夏草深层发酵工艺”专利公开了冬虫夏草无性阶段中国被毛孢(Hirsutella SinensisLiu，Guo，Yu et Zeng.)的液体深层发酵工艺。因中国被毛孢发酵时间长，若当发酵完成出罐后再进行清罐、空消、配置培养料、实消、冷却以后再接种，非生产的清理时间占用过长，影响生产效率。同时由于生产周期时间长，工艺环节多，导致发酵过程中容易发生污染，对发酵设备要求就严，因此生产成本高，也影响发酵产物的质量。
中国被毛孢是嗜低温菌，生长缓慢，生长条件也较苛刻，应用液体深层发酵工艺生产中国被毛孢菌体生产周期长、对发酵设备要求严，成本居高不下；由于菌种本身的特殊性，寻找适宜的发酵条件也一直是个难题。
发明内容
本发明人经过长期摸索研究，成功的应用中国被毛孢(HirsutellaSinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.)为发酵菌种进行连续发酵生产的适宜工艺条件，可以克服现有间歇性发酵工艺因中国被毛孢生长缓慢导致的发酵时间长，发酵得率不高，以及倒罐率和发酵成本高，发酵菌体质量不好的缺陷。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为提供冬虫夏草无性阶段中国被毛孢的连续发酵生产工艺，其特征在于包括a、以中国被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.)保藏号为CCTCC No.M87101的菌株为发酵菌种；b、发酵罐发酵；c、步骤b的发酵完成后取出部份发酵液，再用补液方式加入等量的培养料，继续发酵。
上述工艺还包括d、重复步骤c。
上述工艺中，步骤b的发酵时间为120-168小时。
上述工艺中，所述步骤c的发酵时间为96-120小时，发酵温度为18±2℃，通气量体积比为1∶0.8-1.5。
更具体地，上述工艺的所述步骤c中培养料占发酵罐总容量体积百分比为65-80％，优选为70％；发酵完成后取出的发酵液占总发酵液体积的75-85％，优选为80％。
本发明连续发酵工艺是采取完成第一罐发酵后，应用罐内外的压差取出部份发酵液，以体积比计算，取出的发酵液为发酵液总体积的75-85％，采取补料的形式补入等量的培养料再进行发酵。这种出罐、留存部份发酵液、补料、再发酵的循环可根据需要重复若干次。
本发明的连续发酵工艺流程为(见图1)
菌种培养菌种斜面培养→菌种液体振荡培养→菌种液体扩大振荡培养→种子罐扩大发酵培养→发酵罐生产→出罐部分发酵液；连续发酵上述发酵罐发酵完成后出罐部分发酵液→补等量的培料→发酵→出罐部分发酵液→补等量培养料→再发酵，根据需要重复若干次。
本发明的有益效果是采用本发明的连续发酵工艺可以使中国被毛孢发酵得率较间歇发酵工艺至少能够提高15％；菌体质量明显提高；由于倒罐率降低，发酵成本明显降低。
附图1冬虫夏草连续发酵工艺具体实施方式
冬虫夏草连续发酵工艺具体说明1、斜面培养培养基为麸皮30g、蛋白胨10g、奶粉10g、蚕蛹粉3g、维生素10mg、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.0g、琼脂20克、H2O 1000ml，pH6.5。
将中国被毛孢菌株接种于斜面培养基上，在15-18℃的条件下培养15-40天。
2、液体培养液体培养基麸皮30g、奶粉10g、蚕蛹粉汁3g、牛肉汁10g、维生素10mg、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.0g、水1000ml。培养液pH6.5。
培养基分装于三角瓶中，体积为三角瓶的1/3左右，灭菌后放置于摇床中，在18±2℃的温度下，100-150次/分钟摇床上振动培养120-160小时，再扩大培养。
3、液体扩大培养条件同上述的液体培养。
4、种子罐培养液体培养基麸皮30Kg、奶粉10Kg、蚕蛹粉汁3Kg、酵母10Kg、维生素10g、硫酸镁0.5Kg、磷酸二氢钾1Kg、水1000Kg，培养料PH为6.5-7.0。
接种量与培养料的重量百分比为1-5％，温度18±2℃，通气量的体积比为1∶0.8-1.5的条件下，连续发酵96小时。此时菌丝体生长旺盛，经镜检无杂菌污染，可转入发酵罐生产。
5、发酵罐生产培养基液体培养基麸皮30Kg、奶粉10Kg、蚕蛹粉汁3Kg、酵母10Kg、维生素10g、硫酸镁0.5Kg、磷酸二氢钾1Kg、水1000Kg，pH值为6.5。
接种量与培养料的重量百分比为5-10％，温度18±2℃，通气量1∶0.8-1.5(V/V)的条件下，连续发酵96-168小时。
在发酵开始的第24小时后，每隔16小时取发酵液样，测定PH值，还原糖，氨态氮，当PH下降至4.5-5.0，还原糖下降到1％(重量百分比)浓度以下，氨态氮0.1％(重量百分比)以下，镜检发酵菌已产生大量分生孢子梗及分生孢子时，就可以出罐。
6、连续发酵发酵的温度为18±2℃，通气量为1∶1(V/V)。
每次发酵96小时，取出75-85％的发酵液，再补入等量培养料进行再发酵，根据需要循环若干次。
在真菌发酵的生产中，接入种子后其无性孢子及其菌丝体迅速繁殖，在发酵罐内容易迅速形成优势菌群，杂菌很难进入，但因中国被毛孢菌生长缓慢故难以在最短期间形成优势，容易造成污染。根据试验，接入的种子量和培养料量的比例越小，培养时间越长，种子量和培养料比例越大，则发酵的时间越短，而且杂菌也就越难进入，越不容易污染。根据这一试验结果，发酵完成后留存15-25％左右的发酵液，取出75-85％发酵液，用补液的方式补入等量的培养料，再继续进行发酵。采用本发明的连续发酵工艺可以使中国被毛孢菌始终占有优势，进行纯菌发酵，因而发酵产物质量高，并且中国被毛孢液体发酵的一般得率为1.5-2.0，而本发明工艺的得率为1.7-2.5％，因而与原有液体发酵工艺相比得率至少能够提高15％；同时，由于本发明连续发酵工艺全过程均在管道内进行，减少了杂菌污染的机会，倒罐率得以降低，菌体质量明显提高；此外，本发明连续发酵工艺去掉了清罐、空消，加料、实消、冷却、等工序，上述工序一般需要8小时，因此大大降低了发酵成本；并且进入连续发酵后，发酵周期时间为96小时，缩短了发酵时间。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例虫夏草连续发酵工艺1、斜面培养培养基麸皮30g、蛋白胨10g、奶粉10g、蚕蛹粉3g、维生素10mg、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.0g、琼脂20g、H2O 1000ml，pH6.5。
将中国被毛孢菌株接种于斜面培养基上，在15-18℃的条件下培养30天。
2、液体培养液体培养基麸皮30g、奶粉10g、蚕蛹粉汁3g、牛肉汁10g、维生素10mg、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.0g、水1000ml。培养液pH6.5。
培养基分装于三角瓶，体积为三角瓶的1/3左右，灭菌后放置于摇床中，在18±2℃的温度下，130次/分钟摇床上振动培养144小时，再扩大培养。
3、液体扩大培养培养基及培养条件同上述的液体培养。
4、种子罐培养液体培养基麸皮30Kg、奶粉10Kg、蚕蛹粉汁3Kg、酵母10Kg、维生素10g、硫酸镁0.5Kg、磷酸二氢钾1Kg、水1000Kg，培养料PH为6.5-7.0，接种量与培养料的重量百分比为1-5％，温度18±2℃，通气量1∶1(V/V)，连续发酵96小时。此时菌丝体生长旺盛，经镜检无杂菌污染，可转入发酵罐生产。
5、发酵罐生产培养基液体培养基麸皮30Kg、奶粉10Kg、蚕蛹粉汁3Kg、酵母10Kg、维生素10g、硫酸镁0.5Kg、磷酸二氢钾1Kg、水1000Kg，pH值为6.5。
接种量的重量百分比为10％，温度18±2℃，通气量1∶1(V/V)的条件下，连续发酵120小时。
在发酵开始的第24小时后，每隔16小时取发酵液样，测定PH值，还原糖，氨态氮，当PH下降至4.5-5.0，还原糖1％(重量百分比)以下，氨态氮0.1％(重量百分比)以下，镜检发酵菌已产生大量分生孢子梗及分生孢子时，就可以出罐。
6、连续发酵发酵完成后取出80％发酵液，用补液的方式补入等量的培养料，再继续进行发酵。发酵完成后取出大部份发酵液，用补液的方式加入培养料到罐容量的70％，再继续进行发酵。发酵的温度为18±2℃、发酵时间为96小时、通气量体积比为1∶1本实施例进入连续发酵程序后每次发酵的周期为96小时，而且由于连续发酵全过程均在管道内进行，减少了杂菌污染的机会，因而菌体质量好；同时，本实施例的发酵得率为2.2-2.5％，与原有中国被毛孢的液体发酵得率相比至少可以提高15％，并且实现了发酵成本降低。
权利要求
1.一种虫草的连续发酵生产工艺，其特征在于包括a、以中国被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.)保藏号为CCTCC No.M87101的菌株为发酵菌种；b、发酵罐发酵；c、步骤b的发酵完成后取出部份发酵液，再用补液方式加入等量的培养料，继续发酵。
2.根据权利要求
1所述的连续发酵生产工艺，其特征在于d、重复步骤c。
3.根据权利要求
1所述的连续发酵生产工艺，其特征在于所述步骤b的发酵时间为96-168小时。
4.根据权利要求
1所述的连续发酵生产工艺，其特征在于所述步骤c的发酵时间为96小时。
5.根据权利要求
1所述的连续发酵生产工艺，其特征在于所述步骤c的发酵温度为18±2℃。
6.根据权利要求
1所述的连续发酵生产工艺，其特征在于所述步骤c的通气量体积比为1∶0.8-1.5。
7.根据权利要求
1所述的连续发酵生产工艺，其特征在于所述步骤c中培养料占发酵罐总容量的体积百分比为65-80％。
8.根据权利要求
7所述的连续发酵生产工艺，其特征在于培养料占发酵罐总容量的体积百分比为70％。
9.根据权利要求
1所述的连续发酵生产工艺，其特征在于所述步骤c中发酵完成后取出的发酵液占总发酵液体积的75-85％。
10.根据权利要求
9所述的连续发酵生产工艺，其特征在于发酵完成后取出的发酵液占总发酵液体积的80％。
专利摘要
本发明提供了一种虫草的连续发酵生产工艺。其特征在于以中国被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.)保藏号为CCTCC No.M87101的菌株为发酵菌种，在发酵罐中发酵；发酵完成后取出部份发酵液，再用补液方式加入等量的培养料，继续发酵。该去料、补料再发酵循环可根据需要重复若干次。采用本发明的连续发酵工艺可以使中国被毛孢发酵得率较间歇发酵工艺至少能够提高15％，由于倒罐率降低，所以菌体质量明显提高，发酵成本明显降低。
文档编号C12N1/14GKCN1513977SQ03135623
公开日2004年7月21日 申请日期2003年8月19日
发明者俞永信 申请人:成都思摩纳米技术有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan