专利名称:两性蛋白质贴片的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域：
，尤其涉及一种具有转染功能的生物蛋白质药物贴片。
背景技术：
随着分子改造技术、分子修饰研究的发展，促进了脂质体转染技术的兴起，给基因工程、分子药理学以及细胞模型的建立拓宽了视野，带来了方便。基因枪及脂质体转染试剂相继于20世纪80年代中期开始相继被应用于分子生物学、分子药理学、细胞的分子生物学及基因工程的临床医学和临床检验学研究和应用领域。
基因工程是极其复杂的过程，包括对目的基因的取得、载体的选择、酶的筛选和合理运用、重组体构建、转化的鉴定以及目的基因在受体细胞中的表达等步骤，而且受诸多因素和条件的限制，其中外源DNA分子导入某一种宿主细胞的过程称转化(transfomation)或称转染(transfection)。
无论用于植物细菌细胞或是哺乳动物细胞，常用的转染方法不外下述几种。
最常用的方法是磷酸钙和DEAE-葡聚糖介导的转染，目前认为转染DNA是通过内吞作用进入细胞的，葡聚糖介导可能因聚合物的毒性对某些细胞转化带来困难。其次，原生质体融合是对于DNA内吞效率不高的细胞中更为有效，亦有用PEG1000-8000促进原生质体膜通透性的变化导致DNA进入细胞。第三种方法聚季铵盐法，被认为是可以把低分子量的DNA有效而稳定地导入难以转染的细胞系的一种方法。第四种和第五种是细胞核直接进行显微注射法和利用基因枪进行电穿孔法。第六种即利用人工膜泡作为运送载体作为转染DNA的工具1993年6月被推向市场的多阳离子转染试剂便是以脂类为原料通过脂质体包囊，DNA通过脂质体与被转染细胞的细胞膜的融合实现转染内容的全过程。
但是，无论采用那种方法将DNA导入细胞，瞬时或是稳定转染，其转染效率在很大程度上取决于所用细胞的类型，经验证明，不同的培养细胞系摄取和表达外源DNA的能力有时可相差几个数量级。
1993年6月被推向市场的多阳离子转染试剂(Lipofectamine)只以广谱、高效、使用简便为优势进行宣传，但该转染试剂不是一种蛋白质转染试剂。
1997年3月31日，发明人提出了两性蛋白质转染药物试剂(简称APTR，即为具有转染药物功能的两性蛋白质)的制备方法(申请号97103808.2，公开号CN 1162642A)，但该申请没有公开所述的蛋白质的结构信息，也没有公开该蛋白质转染试剂具有转染效果的证据，因公开不充分而被驳回。
同时，作为人类食物的小麦麦粉，尤其是产于中国的优质纯系小麦品种，她不仅长年来为人类生命活动提供能量来源。就其组成成分中的醇溶蛋白也是20世纪末期人们所关注的内容。因为她的功能远远超出仅能作为各种食品的原料；目前正在渗透到生物和医学各学科的研究和应用领域。成为主要的不可缺少的原材料之一。
早在80年代中期，北京大学生命科学学院就有人对于小麦醇溶蛋白进行了开创性的研究。通过十年来的系统研究发现，在CN1072449A的专利报告中确认了将小麦醇溶蛋白与脂类融为一体的搭桥物质为蔗糖脂肪酸酯。由于系列蔗糖脂的参与使得小麦醇溶蛋白能够与大豆磷脂融合并能够形成尺寸大小不同的囊泡，其规格为＜0.7μm-＞7.0μm。并在CN 1091679A发现了相关的理化特性。从而完成了小麦醇溶蛋白分子微胶囊的制备方法。作为一种可食用的无毒无害的分子微胶囊，可广泛用于各种药物的包裹所包裹的分子量范围为＜0.4KD-＞1×106KD，从而为以蛋白质为原料并可定向释放的分子微胶囊的制备和应用提供了科学依据。又由于她所包裹的试剂能够特异性地与人类血液中的胆固醇、甘油三酯分别进行结合，所以，以靶向探针技术为特征的检测高血脂血清的试剂盒CN 1114421A相继问世。
APTR也适合包裹任何酶的底物用于制备检测各种酶的探针。由于对该微胶囊的诸多特性的发现，更是由于其蛋白质的本质的发现，故在在其所形成的囊泡的表面易于偶联结合各种抗体分子、受体的配基，用于探测抗原存在的部位、受体存在的部位，……，则另一种类型的靶向探针研制成功。
由于包裹和靶向的研制使得成为微胶囊的小麦醇溶蛋白(也是中国春麦麦粉蛋白，因其具有醇溶性，所以也称之为小麦醇溶蛋白)具有双功能特征，她不仅可用于探测，而以碳原子结构为骨架的载药并有靶向作用的纳米颗粒游戈于动物甚至人的血管中靶向肿瘤细胞、杀伤肿瘤细胞，进行完善体内治疗的途径。也将是纳米技术在生物和医学领域的一个开拓。作为从分子组成上含有极其丰富的疏水氨基酸残基的两性蛋白质—小麦醇溶蛋白，当制成囊泡后，能够将所包裹的药物转染给受体细胞提供一个重要的前提，尤其是其囊壁的特殊结构对于药液的包裹和释放以及维持其囊泡的固有形态特征提供了保证。她能导入各种药物进入受体细胞，见CN 1162642A。为生物制药、转基因动物以及药物的动物模型的建立等提供了有应用价值的内容。
如果将APTR转染试剂制成膜片或敷片，则对于贴壁细胞，至少对Hela细胞的转染和利用载药的敷片进行皮肤病实体瘤治疗等药用贴片治疗将是一个有用的途径。
此外，具有抗原特性的小麦醇溶蛋白她是某种皮肤病受体的配基。由她所产生的抗体可以检测小麦中蛋白质含量高低予以确定其质量。她也是某种自身免疫病的定值物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有转染功能的两性蛋白质贴片。
本发明的目的还在于提供一种同时具有转染功能和靶向性功能的两性蛋白质贴片。
本发明的两性蛋白质贴片，包括两性蛋白质转染药物试剂和基片，两性蛋白质转染药物试剂固相于基片上，两性蛋白质中疏水性氨基酸占所属蛋白质分子组成的40％以上。
所述基片为硬片，网片，软片或可食用的基片。所述软片为多孔膜片。多孔膜片为0.1-3.0mμ孔径的多孔膜片。
所述两性蛋白质为中国纯系品种春麦麦粉蛋白，包括A、B、C、D、E、F六个可呈囊泡的组分，各组分的分子量及组成该组合蛋白的比例关系为A66KD，1.0-2.0；B＜66KD，0.1-1.0；C14.4KD-＞14.4KD，1.0-2.0；D20.1KD-＜20.1KD，1.0-2.0；E＜14.4KD，2.0-3.0；F35KD-55KD，3.5-5.0；其中组分F中疏水性氨基酸所占该组分蛋白质分子组成的40％以上。
本发明的两性蛋白质通过搭桥物质与靶向性物质连接，从而使贴片具有靶向性。
所述搭桥物质为戊二醛，所述靶向性物质为受体或抗体。
本发明的两性蛋白质具有脂类的特性它溶于某些有机溶剂，如乙醇、二氧六环等。该两性蛋白质，其分子组成中疏水性氨基酸残基占该蛋白质全部氨基酸残基的40％以上，从全分子的氨基酸组成中疏水性和亲水性氨基酸的百分比充分显示了该蛋白质的两性性质，故称以该蛋白质为原料所制成的转染试剂为两性蛋白质转染药物试剂(Amphiphilic Protein transfecting Reagent，简称APTR)。
本发明的蛋白质的两性(Amphiphilic)的概念与大量生物化学教科书中，所用的两性Isoelectric Zwitterion是有区别的。后者系指处在等电时，某氨基酸呈两性离子状态存在。(见Mary K.Campbell著Biochemistry第76页“titration curves of the amino acids”，Saunders College Publishing 1995年出版)而本发明所用的两性蛋白中的两性采用的是Amphiphilic，关于她的由来是从一篇由作者Neumann，R的“Preparatian and characterazation of long chain amino acid and peptidevesicle membranes”文章(1987，Elsevier Science PublishersB.V.出版，第338-349页)中所报导的由于长链C18脂肪酸通过羰二亚胺与某氨基酸偶联后，改变了原来某氨基酸的性质使其增加原氨基酸不存在的疏水性所致，作者将此称具有疏水和亲水双重性质的新型氨基酸(氨基酸脂肪酸脂)称为Amphiphilic Amino Acid。该文实验中充分显示了该蛋白质具有与氨基酸脂肪酸脂相类似的Amphiphilic(两性)性质。
本发明所选用的天然蛋白质在其35KD的组成成分中由于其含有40％以上的疏水氨基酸残基，从而使其产生了能溶于有机溶剂的类似脂类的特性，故该蛋白质区别于一般蛋白质。
本发明的两性蛋白经纯化后35KD多肽的氨基酸组成分析如下表氨基酸 含量 保留时间 面积/μmol·L-1/s /％Asp 46.562 15.187 2.08218Thr 40.984 17.584 1.77373Ser 85.287 18.665 3.86891Glu 683.262 22.062 31.99991Pro 409.090 23.927 4.15887Gly 56.899 29.871 4.61604Ala 64.156 31.813 2.67178Val 94.278 40.178 4.73916Met 25.428 48.207 1.66927ILe 78.298 50.645 3.41396Leu 115.269 51.872 7.42157Try 42.821 57.240 2.76081Phe 79.289 59.177 4.51850Lys 21.761 71.211 1.31544His 40.844 76.420 3.88002Arg 58.595 86.498 3.37720本发明的两性蛋白质能够产生具有脂质体囊泡形态特征的空心球体，可以包裹物质。见图1。
本发明的两性蛋白包括A、B、C、D、E、F六个组分，见图2；每部分都有呈囊泡的特性，并能包裹物质。
通过LH-20柱层析纯化、疏水相互作用层析纯化和SDS-PAGE等常规纯化手段和分子量鉴定，取其中35KD电泳条带进行了其氨基酸组成和N-末端分析，发现在35KD条带中含有占蛋白质分子的40％为疏水性氨基酸，N-末端为苯丙氨基酸。见图3。
本发明的两性蛋白质具有转染功能如图4，通过电镜观察见到了肽泡与红血球的亲和现象，这样就为药物靶向转染提供了可能性；如图5，APTR与兔红血球的广谱亲和作用，显示载药APTR固相于贴片后，该贴片将药导入Hela细胞。
图1a)不载药的APTR电镜照片(RV)(7000×1.8)；
b)不载药的APTR电镜照片(DV)(7000×1.8)；c)APTR由DV转化成RV时将药液吸收的囊泡电镜照片(7000×1.8)；d)不载药的APTR光镜照片(10×40)；e)载氨基黑蓝色药物的APTR光镜照片(10×40)；图2原料蛋白质电泳图谱a)经纯化后的本发明两性蛋白的电泳图1---电泳胶条1(标准蛋白)；2---电泳胶条2(加样量少的纯化样品)；3---电泳胶条3(加样量多的纯化样品)b)电泳胶条3积分扫描图；c)电泳胶条3的积分扫描面积百分比图3本发明35KD蛋白的N-末端分析照片及氨基酸组成分析扫描图；a)本发明35KD蛋白的N-末端分析照片；b)本发明35KD蛋白的氨基酸组成分析扫描图图4a)APTR囊泡与羊抗兔抗体偶联后对兔红血球抗原的识别作用示意照片之一；b)APTR囊泡与羊抗兔抗体偶联后对兔红血球抗原的识别作用示意照片之二；c)羊抗兔抗体与载药APTR偶联制出的载药靶向抗体对特异性抗原兔红血球的识别照片；d)鱼红血球的阴性对照照片；图5a)APTR与兔红血球的广谱亲和作用照片；b)制备好的载药APTR照片；c)载药APTR贴片将药导入Hela细胞后的照片；图6导入兔抗人IgG-FITC的SP2/0细胞a)明场照片；b)Lipofection转染的荧光照片，TLD2分钟；c)相应于A的蛋白微球转染后的荧光照片，TLD2分钟；图7包裹超强绿色荧光蛋白(EGFP)的APTR转染的PK-15细胞照片a)5微升APTR加量的PK-15细胞转染照片之一；
b)10微升APTR加量的PK-15细胞转染照片之一；c)5微升APTR加量的PK-15细胞转染照片之二；d)10微升APTR加量的PK-15细胞转染照片之二。
实施方案1、原料中国春麦粉，购自中国农业科学院品资所，和由农林科学院作物研究所、北京种子公司赠，经SephadexLH.20柱疏水相互作用层析等常规技术纯化，发现所得春麦有11条蛋白质电泳条带，其分子量范围分布于66KD～＜14KD，在该组分中有的条带能够形成囊泡的特征。选择其中可呈囊泡的六个组分，重新制成组合蛋白。该组合蛋白的六个组分A、B、C、D、E、F分子量及组成该组合蛋白的比例关系为A66KD，1.0-2.0；B＜66KD，0.1-1.0；C14.4KD-＞14.4KD，1.0-2.0；D20.1KD-＜20.1KD，1.0-2.0；E＜14.4KD，2.0-3.0；F35KD-55KD，3.5-5.0；其中组分F中疏水性氨基酸残基所占该组分蛋白质分子组成的40％以上。纯化所得两性蛋白质其浓度4mg/ml-15mg/ml。
2、靶向性转染药物试剂与所包裹药液体积比为1-0.1∶0.1-10。
3、液体保存需有一个适宜的乙醇浓度即35％-50％。
4、靶向性转染试剂所使用的戊二醛浓度为0.6％-2.5％。
5、靶向性转染试剂所使用的戊二醛与麦粉提取液的体积比为2-3∶1。
6、控制细胞转染条件包括转染过程中培养细胞的温度、CO2浓度、转染药物的pH、药液的浓度及溶解程度，药液的细胞毒性，培养时间等因素的合理调整。
7、靶向性转染试剂的保存温度为1-4℃。
8、载药两性蛋白质转染试剂对细胞转染时要求细胞培养液的pH范围为5-8。
因此，该试剂可在一个较宽分pH范围(pH＝5-8)内显示对各类细胞转染效果。
实施例1广谱性载药APTR的制备方法及其在小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的使用效果。本实施例要求在超净工作台中进行下述无菌操作。
①两性蛋白质醇溶液的制备称取中国纯系品种春麦粉10-50g，于50-90％乙醇溶液50-500ml抽提4-10小时，继续通过LD20柱层析技术进行常规纯化，取分子量为35KD-55KD部分进行下述实验。
②吸取上述两性蛋白质醇溶液0.1-1.0ml，放入旋转瓶中，水泵抽掉保护液，于旋转瓶中形成一极薄层膜称为固态两性蛋白质载体。
③用0.1-1ml兔抗人荧光抗体加入上述固态两性蛋白质载体中，旋转旋转瓶，使载体由脱水状态即刻吸液膨胀复原成载兔抗人荧光抗体的球形体。称为载荧光抗体的两性蛋白质转染试剂。
④吸取对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，0.1-10ml于DMEM(动物细胞培养基一种。DMEM为市售培养基的商品名)pH7.2-7.4培养液中，加入上述③的载荧光抗体的两性蛋白质转染试剂0.1-10ml中，混匀后放入37℃5％二氧化碳恒温培养箱中转染3-5小时，再于荧光显微镜下可观察到具有荧光实体的转注有荧光抗体的小鼠骨髓瘤细胞(见图6)。
实施例2两性蛋白质转染药物试剂用于超强绿色荧光蛋白PEGFP-N3质粒的包裹和对PK15细胞的转染。
下述实验应于无菌条件下，按细胞学实验的一般要求进行操作1.PK15细胞的培养培养基为市售D-MEM 12800-082高糖培养基，其中含10％胎牛血清，2.5U/ml青霉素，2.5mg/ml链霉素。在37℃温度下，于二氧化碳培养箱中培养。
当细胞密度达到50-80％时，停止培养，并于当日进行基因转染实验。
2.两性蛋白质转染药物试剂对PEGFP-N3质粒(4.7kb)进行包裹。
1)其中APTR质粒为(25-100μg)(0.25-2.5μg)2)将1)中所述适量的APTR与质粒溶解于无双抗、无血清的D-MEM培养基中培养基取量为0.5-2.0ml。
3.瞬时转染将2转移到培养细胞中，在二氧化碳培养箱里37℃培养2-24小时。
4.去掉游离的APTR和质粒通过新鲜的含有10％的胎牛血清和双抗的D-MEM高糖培养基漂洗转染细胞的手段完成。
5.瞬时表达用新鲜D-MEM高糖培养基，于二氧化碳培养箱在37℃温度下连续培养24-48小时进行瞬时表达。
6.Olympus荧光显微镜下观察转染和表达情况并进行拍照。选用波长为激发波长495nm滤光片。如果细胞出现绿色荧光表示为瞬时转染和瞬时表达成功。如图7。
实施例3
靶向物质为羊抗兔抗体，羊抗兔抗体抗体探针的制备及其对兔红血球的识别，由下述步骤完成。
①称取APTR粉末1-10mg；②将1加入到0.1-10ml Evan’s兰稀释液中；③室温下慢速旋涡30分钟，此时APTR由DV向RV转化，并包裹Evan’s兰；显微镜下为100-1000nm的兰光颗粒；④按比例0.01-10-10-0.01将步骤③的产物滴加2.5％的戊二醛磷缓冲液。室温下避光静置1-3小时，完成抗体探针的制备。如图4实施例4将上述转染药物试剂固相化于载玻片或培养贴壁细胞的盖片上或其他透明的硬质塑片上，再对贴壁细胞或悬浮细胞的培养，可达到通过液体转染药物进入细胞的目的。整个操作过程需要在无菌条件下进行，显示蓝色药物贴片对Hela细胞的广谱性转染。
1.将具有蓝颜色的药物包裹于APTR囊泡内。
APTR蓝色药物＝(0.15-1.5mg)∶(0.1-0.5ml)用重量与体积比的目的在于通过APTR由DV转化成RV时，使固化的APTR由脱水粉末状转化为吸水囊泡状即通过DV转化成RV时，实现蓝色药物的包裹。
2.将APTR包裹后的蓝色药物通过常规的低温脱水技术，抽干水分，则含有药物的蓝色APTR囊泡便固化于玻片载体上，即制成固相化的转染药物贴片。
3.将此贴片放入D-MEM培养基内并转入Hela细胞进行培养，于37℃温度下在二氧化碳培养箱中培养12小时左右，则完成Hela细胞贴壁和转染。
4.普通光镜进行观察。取贴片直接进行观察蓝色药物进入Hela细胞的情况。预示着该药物转染试剂剂型的改变为药物进入细胞提供了新的导入途径，见图5。
权利要求
1.一种两性蛋白质贴片，包括两性蛋白质和基片，其特征在于两性蛋白质固相于基片上，两性蛋白质中疏水性氨基酸残基占所属蛋白质分子组成的40％以上。
2.如权利要求
1所述的两性蛋白质贴片，其特征在于所述基片为硬片，网片，可食用的基片或软片。
3.如权利要求
2所述的两性蛋白质贴片，其特征在于所述软片为多孔膜片。
4.如权利要求
2所述的两性蛋白质贴片，其特征在于所述多孔膜片为0.1-3.0μm孔径的多孔膜片。
5.如权利要求
1所述的两性蛋白质贴片，其特征在于所述两性蛋白质为中国纯系品种春麦麦粉蛋白，包括A、B、C、D、E、F六个可呈囊泡的组分，各组分的分子量及组成该组合蛋白的比例关系为A66KD，1.0-2.0；B＜66KD，0.1-1.0；C14.4KD-＞14.4KD，1.0-2.0；D20.1KD-＜20.1KD，1.0-2.0；E＜14.4KD，2.0-3.0；F35KD-55KD，3.5-5.0；其中组分F中疏水性氨基酸残基所占该组分蛋白质分子组成的40％以上。
6.如权利要求
1或5所述的两性蛋白质贴片，其特征在于所述两性蛋白质通过搭桥物质与靶向性物质连接。
7.如权利要求
6所述的两性蛋白质贴片，其特征在于所述搭桥物质为戊二醛，所述靶向性物质为受体或抗体。
专利摘要
本发明涉及一种两性蛋白质贴片，包括两性蛋白质和基片，两性蛋白质固相于基片上，两性蛋白质中疏水性氨基酸残基占所属蛋白质分子组成的40％以上。其中两性蛋白质为中国纯系品种春麦麦粉蛋白，基片为硬片，网片，可食用的基片或如多孔膜片的软片。本发明所选用的两性蛋白质组成成分中由于其含有40％以上的疏水氨基酸，从而使其产生了能溶于有机溶剂的类似脂类的特性，具有疏水和亲水双重性质。本发明的两性蛋白质可形成囊泡，包裹物质，并可同时具有转染功能和靶向性功能。可广泛应用于生物、医学、药学各领域。
文档编号C12N15/87GKCN1482248SQ03100825
公开日2004年3月17日 申请日期2003年1月23日
发明者王素云 申请人:北京大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan