专利名称：微生物同步发酵正十三烷生产十一烷1，11二羧酸方法
技术领域：
本发明涉及微生物同步发酵正烷烃生产长链α，ω-二元酸的方法，尤其是发酵正十三烷(nC13)高产十一烷1，11-二羧酸(DC13)的方法。
C10以上的长链二元酸是化工上合成高级香料，高级尼龙工程塑料，高档服装用尼龙热熔胶，高温电介质，高级涂料，润滑油添加剂和耐寒性增塑剂等的重要原料。尤其是十三碳二元酸(DC13)和十五碳二元酸(DC15)，它们分别是合成日用香料麝香T和名贵香料麝香酮的重要原料。
C10以上的长链二元酸，在自然界中不单独存在，只有少数几种二元酸可从植物油中裂介制取，例如癸二酸(DC10)可从蓖麻籽油裂介制取；DC13可从菜籽油中抽提出甘油芥酸酯再用臭氧氧化方法生产；DC15可从蒜头果油中的脑神经酸裂介制取。但它们都受农田和气候的限制，远不能满足需要。化工上至今也还没有经济可行的合成路线和方法。微生物学家应用生物工程技术，利用微生物发酵石油中的正构烷烃生产相应链长的二元酸，弥补了化工上的不足，开辟了长链二元酸的新来源。
七十年代以前，各国科学家对微生物发醇生产二元酸的研究，只处于理论研究阶段，所产生和积累的二元酸也都是十个碳以下的短链二元酸，七十年代以后，进入应用研究阶段，通过大量的菌种诱变筛选，培育出一批新突变菌株，能从十个碳以上的正烷烃产生和积累与基质链长相同的长链二元酸，并通过不断的培育和代谢调控研究，使每升发酵液中二元酸的积累从开始时的几克，十几克，几十克提高到目前的一百多克和二百克左右。
八十年代以来，二元酸的研究进入小规模工业生产阶段，并出现了几个有实际生产价值的专利文献。中国专利87105445.0，CN1046757A，CN1092108A和CN1130685A分别提出生产长链α，ω-二元酸的方法，特别是分别高产DC16，DC17，DC15和DC12的方法。在16升自动控制罐中，发酵5天，DC16为123g/L，发酵6天，DC17为133g/L，在2.5m3通用式发酵罐中，发酵6天，DC15为178g/L，在3m3发酵罐中，发醇5天，DC12为145g/L。
对DC13的研究，日本矿业株式会社率先工业放大，1984年建成年产200吨的DC13的工业发酵装置，并投入生产。中国专利CN1071951A提出一种微生物异步发酵生产长链α，ω-二元酸的方法，尤其是生产DC13的方法。其方法是分两步进行，根据实验例4，第一步是把培养好的600升菌种液接入装有正十三烷(nC13)125升和培养基1775升的3m3发酵罐内(即装液量为83％)，控制PH在4.5±0.1，繁殖培养菌体，24小时，菌体浓度达到8.7％(湿菌重)；第二步，补加20％(V/V)的nC13，调PH至7.8±0.1，转入发酵产酸阶段，发酵72小时，DC13达到98.2g/L，继续发酵72小时，产酸达到166.3g/L(从接种开始到发酵结束，共168小时)，转化率为84％。
本发明的目的是提出另一种利用微生物同步发酵正烷烃生产C11-C18长链α，ω-二元酸的方法，尤其是高产DC13的方法。
本发明所用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)P-12-242，是以一株氧化正烷烃生产混合二羧酸的热带假丝酵母(参见《微生物学报》20(1)88-93，1980)为出发菌株，通过亚硝酸和紫外线的多次反复诱变筛选培育出来的，能从C11-C18的各种单一正烷烃和混合正烷烃，尤其是正十三烷，高产出地生产相应链长的二羧酸。热带假丝酵母P-12-242(以下简称P-12-242)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.。
P-12-242的生理特性如下一、糖类的发酵葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。
二、同化葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松三糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤藓醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。
三、生长素的需要生物素++，维生素B1++，维生素B2+，维生素B6+，维生素B12+，叶酸+，烟酸+，泛酸+，肌醇+，对氨基苯甲酸+。
四、其它硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。
形态特征奶油白色，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。
培养特征在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长；在烷烃种子培养基中培养时，有一定数量的短假菌丝；而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭园细胞。本发明的种子培养基(1)、10个巴林糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；(2)、10个巴林的麦芽汁液体培养基；(3)、烷烃种子培养基包含KH2PO46-12g/L，玉米浆3-8g/L，酵母膏3-8g/L，蔗糖3-8g/L，尿素3-6g/L，重蜡40-70ml/L，自来水配制，自然PH。
培养种子的过程为取一接种环P-12-242酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(15×180试管，每支装6-7mL培养基，放成斜面)，于28-30℃培养40小时。取一支上述培养好的P-12-242菌种分部刮入装有25ml烷烃种子培养基的250mL三角瓶中，于28-30℃220转/分的旋转摇床上培养40-48小时，作为摇瓶发酵种子或者取两支上述培养好的P-12-242菌种全部刮入装有500mL培养基的5000ml三角瓶中，于180转/分旋转摇床上28-30℃培养44-48小时，作为一级种子罐的种子。
用本发明的P-12-242菌株生产长链二羧酸，特别是十三碳二羧酸的具体方法是把发酵的种子接入PH5.5-9.0，最好为6.5-7.5的含有15-45％(V/V)的C11-C18的正烷烃和85-55％(V/V)发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为碱金属磷酸盐6-14g/L，最好为7-10g/L，氯化钠0.5-2.0g/L、酵母膏1-6g/L，最好为3-5g/L，玉米浆0.5-2g/L，尿素0.5-2.5g/L最好为1.0-2.0g/L，硝酸盐5-15g/L，最好为6-12g/L，蔗糖10-30g/L，最好为10-20g/L，消泡刘400-1200ppm以及一些其他公知的营养源，在PH5.8-7.5之间将上述混合物在25-30℃，最好在27-31℃通气发酵48-170小时。28小时内，PH控制在6.8以下，以菌体生长为主，产酸为付，此时菌株生长光密度OD达到0.6左右，产酸达到20-30g/L，在28-60小时，PH控制在7.3以下，产酸为主，菌体生长为付，此时OD达至0.9左右，产酸达到75-85g/L，从60小时以后，每隔6-8小时用NaOH溶液调一次PH至7.5-8.0，菌体量不再增加，而产酸量继续迅速增加，然后将产生的二羧酸从发酵液中分离出来。在发酵开始时，混合液中正烷烃含量为10-20％(V/V)，以后在适当时间补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(V/V)为准。碱金属磷酸盐可从KH2PO4，NaH2PO4K2HPO4和Na2HPO4中选一种。硝酸盐可从钾或钠盐中选一种。
发酵结束后，加入适量的水，加碱至PH10-12，加热至85-90℃，进行破乳分层，上层为残油，回收再用，放出中间清液，下层菌体层再处理一次或压滤或离心，合并清液，加入适量活性炭，在85-90℃，脱色30分钟，除去活性炭后，脱色液加热至60-70℃，加HCI或H2SO4至PH4-5进行酸化结晶，冷却至30℃后，压滤，用空气吹干，60℃烘干，得白色十三碳二羧酸结晶。
用本发明的P-12-242菌株和发酵方法，可生产C11-C18的各种单一和混合二羧酸。其中在2.5吨罐上，从正十三烷发酵生产十三碳二羧酸，发酵6天，产酸量高达180-200g/L，后处理总收率达到80％，纯度达到96％以上。
实例一(1)、取一接种环P-12-242菌种，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，30℃培养两天。(2)、取上述菌种一支，接入装有25ml烷烃种子培养基的250ml三角瓶中于30℃在220转/分的旋转摇床上培养48小时。烷烃种子培养基中KH2PO48g/L，酵母膏5g/L，玉米浆3g/L，蔗糖5g/L，尿素3g/L，重蜡50ml/L，自来水配制，PH5.0。(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述种子液，在200转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用NaOH调一次PH至7.5-8.0。发酵培养基含KH2PO48g/L，酵母膏2g/L，玉米浆1g/L，氯化钠1.5g/L，尿素1g/L，正十三烷200ml/L，泡敌500ppm，KNO37g/L，自来水配制，PH7.5，在110℃下灭菌30分钟。发酵结束后用HCl调PH至3，用100ml乙醚提取，除去乙醚，得白色结晶，用标准NaOH溶液滴定，计算二羧酸含量。结果DC12产量为85.2g/L，经气相色谱分析，DC12纯度为97.46％。
实例2按照实例1的方法，只是正烷烃用nC15，结果DC15的产量为53.6g/L，纯度为96.81％。
实例3按照实例1的方法，只是正烷烃用nC17，结果DC17的产量为52.0g/L，纯度为97.2％。
实例4种子培养基和培养方法同实例1，发酵培养基为KH2PO48g/L，NaCl1g/L，酵母膏2g/L，玉米浆1g/L，KNO37g/L，蔗糖15g/L，泡敌600ppm，尿素1.8g/L，正十三烷200ml/L，自来水配制，PH7.5，发酵4天，DC13产量为86.06g/L，DC13纯度93.3％。
实例5种子培养基和培养方法同实例一，发酵培养基同实例4。把培养两天，经镜检无杂菌的400LP-12-242种液接入装有1500L发酵培养基，其中nC13300L经121℃灭菌40分钟的2500L发酵罐中，29℃，200转/分，罐压0.8Kg/cm2，通气量1∶0.8，28小时以前，PH控制在6.8以下，28-60小时，PH控制在7.3以下，60小时后每隔8-6小时，用NaOH溶液调一次PH至7.5，从第三天开始，每天补加正十三烷120L，共3次，发酵6天多(161小时)，发酵清液中十三碳二羧酸含量为205g/L。发酵结束后，加入300L自来水，加热至80℃，加碱调PH至11，冷却降温至50℃，放入分层罐中静置分层一天，放出上层残油，回收使用，下层菌层通过压滤，除去菌体，滤清液与中层清液合并，加入0.7％活性炭，90℃脱色15分钟，压滤除去活性炭，脱色滤清液打入酸化罐中，加水至DC13浓度为4％，加热至70℃，加入浓HCl酸化至PH3，冷却降温至30℃左右，板框压滤，空气吹干，固形物在60℃烘干，得白色DC13249Kg，转化率94.0％，纯度为96.7％。
权利要求
1.一种利用微生物同步发酵正烷烃生产C11-C18各种长链α，ω-二元酸的方法，其特征在于以正十三烷(nC13)为基质的培养基中，用热带假丝酵母(Candida tropicalis)P-12-242，即CGMCC NO.0297发酵，然后回收所形成的二元酸。
2.热带假丝酵母(Candida tropicalis)P-12-242即CGMCC NO.0297菌株。
全文摘要
本发明公开了一种利用微生物同步发酵正十三烷(nC
文档编号C12P7/40GK1162644SQ9710387
公开日1997年10月22日 申请日期1997年4月4日 优先权日1997年4月4日
发明者陈远童, 庞月川, 郝秀珍 申请人:中国科学院微生物研究所