专利名称：Dreb基因转化红掌的遗传转化方法
技术领域：
本发明属于分子育种领域，涉及DREB基因转化红掌的遗传转化方法。
背景技术：
红掌为天南星科花烛属多年生草本植物，原产哥伦比亚南部，是世界名贵花卉。红掌具有艳丽的佛艳苞，花期长、周年开花、叶片蜡质，是观叶观花俱佳的室内观赏植物。红掌夜间生长适温在18-20°C，白天为25°C左右。在夏季，如夜间室温度超过25°C或白天室内温度超过30°C时，而在冬季，如夜间室温度低于12°C或白天室温度低于18°C时，则会出现叶片失去光泽、发黄，佛艳苞花期变短，易枯萎，还会引起叶腐病，严重影响其生长和观赏价值。为此，在夏季期必须采取人为降温措施，而在冬季则必须人为进行加温，使得室内温度适宜红掌的生长，然而降温和加温都显著地增加了红掌生产成本。因此，筛选、培育耐高温和低温的红掌新品种有着巨大的实用价值和经济意义。近年来，随着植物基因工程的发展，分子育种克服了常规育种的种种限制，为利用新的基因资源改良红掌品种提供了新的手段和途径。农杆菌介导法以其操作简单，费用低， 效率高，插入DNA片段大，稳定性好，转基因拷贝数低等优点，已成为转基因策略中的首选方法。DREB转录因子作为一类在植物抵抗非生物胁迫中起关键作用的转录因子家族，以其能够激活多个功能基因的表达，从而提高植物综合抗性的优点成为研究的热点，在植物抗逆分子育种中具有巨大的潜在利用价值。近年来，通过导入DREB基因来改良作物的抗逆性，已经在油菜、烟草、番茄、小麦和菊花等作物中获得成功，但利用DREB基因转化红掌的研究还未见报道。主要原因是红掌的遗传转化极易受到各种因素影响，例如愈伤组织的预培养时间、农杆菌的侵染时间、愈伤组织与农杆菌的共培养时间及抑菌培养时间等等，这些因素直接影响着红掌的转化成功率。因此，系统深入研究其遗传转化条件，建立专门针对红掌的遗传转化体系，可为红掌分子育种工作提供理论基础和实验依据，有效推进红掌分子育种进程。
发明内容
本发明的目的是提供DREB基因转化红掌的遗传转化方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现DRB基因转化红掌的遗传转化方法，包括如下步骤1)无菌愈伤组织的获得取红掌组培苗，切取带有一对叶的红掌茎尖，在继代培养基1/2MS+6-BA 1. Omg/ L+IBAO. lmg/L上诱导愈伤组织，40天后挑选大小一致的愈伤组织，将愈伤组织表层去掉后切割成片状，接种于MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L诱导培养基；2)农杆菌悬浮液制备中将插入目的基因DREB的重组质粒pCAMBIA1301-DREBa采用液氮冷冻法转化农杆菌LBA4404感受态细胞，取经酶切验证含有所述重组质粒pCAMBIAl301-DREBa的农杆菌 LBA4404-DREBa菌液制备农杆菌LBA4404_DREBa悬浮液，用于下一步的遗传转化；3)遗传转 化选取步骤1)中在MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L诱导培养基中诱导45天大小一致的愈伤组织，切除分化的芽点，在相同的诱导培养基中预培养7天，温度为26士2°C， 光照时间为16h/d;然后将愈伤组织在步骤2)制备的农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液中侵染lOmin，用滤纸吸干愈伤组织表面菌液后将其转入垫有滤纸的诱导培养基中在温度为 26士2°C、黑暗条件下共培养 3 天；之后转入 MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+Cef 400mg/ L+AS lOOymg/L培养基中抑菌培养5天，温度为26 士 2°C，光照时间为16h/d;再转入 MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+Cef 400mg/L+Hyg 20mg/L 筛选培养基中进行抗性筛选 6 个月，温度26士2°C，光照时间为16h/d，具有潮霉素抗性的愈伤组织将长出不定芽点；4)抗性愈伤组织筛选切取步骤3)中经抗性筛选得到的带有不定芽点的愈伤组织块转入不加抗生素的再生培养基MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 1. 0mg/L上，在温度为26士2°C，光照时间为16h/d 的条件下培养，待不定芽长至2. 0-3. Ocm时，切下不定芽转入生根筛选培养基1/2MS+IBA 0. lmg/L+Hyg 7mg/L中培养，获得具有潮霉素抗性的生根苗，将生根苗转入1/2MS+IBA 0. lmg/L培养基中正常生根；5)转基因植株的获得待步骤4)得到的具有潮霉素抗性的植株长出8-10片叶时，取其嫩叶，采用CTAB 法提取基因组DNA，，设计并合成SEQ ID No. 3所示的正向引物Hyg-F和SEQ ID No. 4所示的反向引物Hyg-R，以抗性植株的DNA为模板，进行PCR扩增，PCR鉴定结果能够扩增出950bp 条带的抗性植物为转入目的基因DREBa成功的转基因红掌植株。其中，所述的重组质粒pCAMBIAl301-DREBa通过如下方法构建①DRraa基因克隆以菊花品种‘钟山红枫，RNA为模板，以SEQ ID No. 1所示的正向引物DREBa-F禾口 SEQ IDNo. 2所示的反向引物DREBa-R进行RT-PCR扩增合成DREBa基因的cDNA开放阅读框 0RF，用琼脂糖凝胶电泳回收纯化长度为872bp的RT-PCR目的产物片段，与T-载体连接后转化大肠杆菌DH5ci感受态，进行LB+50mg/L氨苄青霉素平板培养，培养条件为37°C，16h， 挑取白色克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37°C，16h，提取含有DREBa基因片段的T-载体质粒，测序验证，DREBa基因的cDNA开放阅读框ORF序列如SEQ ID No. 5所示。②pCAMBIAl301-DREBa植物表达载体构建ffiBamH I和Kpn I双酶切连接了 DREBa基因的T-载体，电泳回收目的片段，与用 BamH I和Kpn I双酶切过的植物表达载体pCAMBIA 1301连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态， 挑取阳性克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37°C，16h，提取质粒，经BamHI和 KpnI双酶切鉴定得到pCAMBIAl301-DREBa重组质粒。所述的农杆菌LBA4404_DREBa悬浮液的通过如下方法制备将农杆菌 LBA4404-DREBa菌液于YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平固体培养基划板培养，培养条件为28°C，48h，挑取单克隆接种于30ml YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平液体培养基震荡培养，培养温度为28°C，震荡速度200r/min，至农杆菌LBA4404_DREBa长至对数生长期即OD6qq为0. 5时，将LBA4404-DRE Ba菌液倒入无菌离心管中，4000rpm离心lOmin，收集菌体沉淀，用等量30ml MS液体培养基重悬，备用。步骤1)中切割为片状的愈伤组织的大小优选为0. 3 0. ScmXO. 3 0. 8cmX0. 1 0. 3cm。有益效果1.本发明针对根癌农杆菌介导的红掌转基因存在的基因型依赖性强、转化频率低、转化后外植体再生困难、重复性差、转化细胞不易成苗等问题，专门对DREB基因转化红掌的遗传转化条件进行了系统深入研究，提供了一套适用于红掌的DREB基因遗传转化体系，为红掌分子育种奠定基础。2.遗传转化体系建立，对影响遗传转化的条件如预培养时间、农杆菌侵染时间、共培养时间、抑菌培养时间进行了考察，获得了最佳遗传转化组合预培养时间分别为0、3、 5、7天，试验结果表明7天的愈伤成活率最高；农杆菌侵染时间分别为5、10、15、20分钟， 试验结果表明10分钟时浸染效果最佳；红掌愈伤组织与农杆菌共培养时间分别为1、2、3、 5天，试验结果表明3天时成活率最高；抑菌培养时间分别为1、3、5、7、9天，试验结果表明 5天时抑菌效果最佳。因此，理想的遗传转化体系中预培养时间为7天，农杆菌侵染时间为 10分钟，红掌愈伤组织与农杆菌共培养时间为3天，抑菌培养时间为5天。3.在筛选方式上，针对红掌对筛选抗生素(潮霉素)敏感的问题，采用了高选择压长时间筛选抗性芽点，无选择压恢复抗性芽分化和生长，再高选择压筛选抗性不定芽并结合生根筛选的多次筛选方法，取得了较好效果，提高了转化体再生率。4.在抑菌培养方法上，基于抑菌抗生素(头孢霉素)对红掌愈伤组织再生的强烈抑制作用，经筛选确定了遗传转化中使用的最适抑菌抗生素(头孢霉素)浓度以抑制农杆菌过度生长，在有效抑制农杆菌滋生的同时获得较高的转化体再生率。
图1红掌外植体类型对愈伤组织诱导的影响A.诱导茎段产生的愈伤组织；B.诱导叶柄产生的愈伤组织；C.诱导叶片产生的愈伤组织。图2不同激素浓度与组合对红掌茎段愈伤组织诱导的影响A. 1/2MS+1. Omg/L 6-BA+O. lmg/L IBA ；B. 1/2MS+1. Omg/L 6-BA+O. lmg/L NAA ； C. 1/2MS+1. Omg/L 6-BA。图3不同浓度IBA对红掌茎段愈伤组织诱导的影响A. 1/2MS+1. Omg/L 6-BA+O. 05mg/L IBA ；B. 1/2MS+1. Omg/L 6-BA+O. lmg/L IBA ； C. 1/2MS+1. Omg/L 6-BA+O. 15mg/L IBA。图4不同浓度潮霉素对红掌愈伤组织分化和芽再生的影响A Omg/L 潮霉素；B :5mg/L 潮霉素；C 1 Omg/L 潮霉素；D :20mg/L 潮霉素；E :30mg/L 潮霉素；F :50mg/L 潮霉素。图5红掌转基因的过程A 预培养；B/C/D 抗性芽生长的过程。
具体实施例方式实施例1无菌愈伤组织的获得1)外植体选择采用茎段、叶片、叶柄在继代培养基1/2MS+6-BA1. 0mg/L+IBA0. lmg/L上诱导愈伤组织，40天后供实验用。培养条件为温度24 26°C，光照强度40 μ mol ·πΓ2 .s—1，12h/12h 光暗交替。结果茎段作为外植体进行组织培养芽诱导率最高，最为成功(表1，图1)。表1 不同外植体对红掌的愈伤诱导
权利要求
1.DREB基因转化红掌的遗传转化方法，其特征在于包括如下步骤1)无菌愈伤组织的获得取红掌组培苗，切取带有一对叶的红掌茎尖，在继代培养基1/2MS+6-BA 1. Omg/ L+IBAO. lmg/L上诱导愈伤组织，40天后挑选大小一致的愈伤组织，将愈伤组织表层去掉后切割成片状，接种于MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L诱导培养基；2)农杆菌悬浮液制备中将插入目的基因DREB的重组质粒pCAMBIAl301-DREBa采用液氮冷冻法转化农杆菌LBA4404感受态细胞，取经酶切验证含有所述重组质粒pCAMBIAl301-DREBa的农杆菌 LBA4404-DREBa菌液制备农杆菌LBA4404_DREBa悬浮液，用于下一步的遗传转化；3)遗传转化选取步骤1)中在MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L诱导培养基中诱导45天大小一致的愈伤组织，切除分化的芽点，在相同的诱导培养基中预培养7天，温度为26士2°C，光照时间为16h/d ；然后将愈伤组织在步骤2)制备的农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液中侵染lOmin，用滤纸吸干愈伤组织表面菌液后将其转入垫有滤纸的诱导培养基中在温度为26士2°C、黑暗条件下共培养 3 天；之后转入 MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+Cef 400mg/L+AS 100 μ mg/L 培养基中抑菌培养5天，温度为26士2°C，光照时间为16h/d ；再转入MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+Cef 400mg/L+Hyg 20mg/L筛选培养基中进行抗性筛选6个月，温度26士2°C，光照时间为16h/d，具有潮霉素抗性的愈伤组织将长出不定芽点；4)抗性愈伤组织筛选切取步骤3)中经抗性筛选得到的带有不定芽点的愈伤组织块转入不加抗生素的再生培养基MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 1. 0mg/L上，在温度为26士2°C，光照时间为16h/d的条件下培养，待不定芽长至2. 0-3. Ocm时，切下不定芽转入生根筛选培养基1/2MS+IBA 0. Img/ L+Hyg 7mg/L中培养，获得具有潮霉素抗性的生根苗，将生根苗转入1/2MS+IBA 0. lmg/L培养基中正常生根；5)转基因植株的获得待步骤4)得到的具有潮霉素抗性的植株长出8-10片叶时，取其嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA，，设计并合成SEQ ID No. 3所示的正向引物Hyg-F和SEQ ID No. 4所示的反向引物Hyg-R，以抗性植株的DNA为模板，进行PCR扩增，PCR鉴定结果能够扩增出950bp条带的抗性植物为转入目的基因DREBa成功的转基因红掌植株。
2.根据权利要求1所述的DREB基因转化红掌的遗传转化方法，其特征在于所述的重组质粒pCAMBIAl301-DREBa通过如下方法构建①DREBa基因克隆以菊花品种‘钟山红枫，RNA为模板，以SEQ ID No. 1所示的正向引物DREBa-F和SEQ IDNo. 2所示的反向引物DREBa-R进行RT-PCR扩增合成DREBa基因的cDNA开放阅读框0RF， 用琼脂糖凝胶电泳回收纯化长度为872bp的RT-PCR目的产物片段，与T-载体连接后转化大肠杆菌DH5 α感受态，进行LB+50mg/L氨苄青霉素平板培养，培养条件为37°C，16h，挑取白色克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37°C，16h，提取含有DREBa基因片段的T-载体质粒，测序验证，DREBa基因的cDNA开放阅读框ORF序列如SEQ ID No. 5所示；②pCAMBIAl301-DREBa植物表达载体构建用BamH I和Kpn I双酶切连接了 DREBa基因的T-载体，电泳回收目的片段，与用BamH I和Kpn I双酶切过的植物表达载体pCAMBIA 1301连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态，挑取阳性克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37°C，16h，提取质粒，经BamH I和 KpnI双酶切鉴定得到pCAMBIAl301-DREBa重组质粒。
3.根据权利要求1所述的DREB基因转化红掌的遗传转化方法，其特征在于所述的农杆菌LBA4404-DREBa悬浮液的通过如下方法制备将农杆菌LBA4404_DREBa菌液于 YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平固体培养基划板培养，培养条件为28 V，48h，挑取单克隆接种于30ml YEP+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平液体培养基震荡培养，培养温度为 28°C，震荡速度200r/min，至农杆菌LBA4404_DREBa长至对数生长期即OD6tltl为0. 5时，将 LBA4404-DREBa菌液倒入无菌离心管中，4000rpm离心lOmin，收集菌体沉淀，用等量30ml MS液体培养基重悬，备用。
4.根据权利要求1所述的DREB基因转化红掌的遗传转化方法，其特征在于步骤1)中切割为片状的愈伤组织的大小为0. 3 0. 8cmX0. 3 0. 8cmX0. 1 0. 3cm。
全文摘要
本发明属于分子育种领域，公开了DREB基因转化红掌的遗传转化方法。该方法是将红掌无菌愈伤组织切开后用含有重组质粒pCAMBIA1301-DREBa的农杆菌液侵染10min，共培养3d、抑菌培养5d、筛选培养获得具潮霉素抗性的生根苗。经PCR检测证实外源基因已转入红掌基因组DNA中。本发明首次针对红掌建立了其遗传转化体系，为红掌分子育种工作提供了理论基础和实验依据，将有效推动其分子育种进程。
文档编号C12N15/66GK102286527SQ20111025270
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者刘兆磊, 房伟民, 滕年军, 蒋甲福, 陈发棣, 陈琳, 陈素梅, 陶清良 申请人:南京农业大学