专利名称：miR397在培育高产水稻中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物育种，具体涉及miR397的新应用。
背景技术：
粮食问题是当今世界所面临的几个难题之一。寻找影响水稻产量相关特性的基因一直以来都是提高粮食产量的研究重点。目前已经发现了不少影响水稻产量的基因，对提高水稻产量提供了理论基础。但为了解决不断增长的人口与逐渐减少的耕地面积的矛盾， 发现更多调节水稻产量的基因仍是急需解决的大问题。因此，不断寻找新的提高水稻产量基因，已成为农业进一步增产的重要基础研究，倍受世界各国政府和科学家的关注，也是当前生命科学研究的热点。miRNA(microRNA)是一组非编码单链RNA，广泛存在于动物和植物等多细胞生物中，它可以通过与靶基因mRNA的特定位点结合，诱导该mRNA的降解或抑制该蛋白质的合成，在转录水平或转录后水平导致基因沉默，从而参与基因的表达调控。miRNAs参与了几乎所有的生命活动，并起着重要作用。在植物中，DCLl酶在细胞核内识别miRNA前体(pre_miRNA)的茎环结构，将其切割成miRNA :miRNA*双体，然后由HST蛋白将其转运到细胞质中进行进一步的加工。在不同的植物组织、器官和发育时期，miRNA的表达谱是不同的，并且部分miRNA在不同的外界环境下也有着不同的表达水平。因此，研究miRNA表达谱对miRNA生物功能的研究是非常重要的。植物miRNA主要参与植物逆境抵抗，发育调控、信号转导、自身生物合成调控等。 例如miR393与生长素信号介导的病原菌抗性，miR393的靶蛋白为F_box类的生长素因子 (TIR1, AFB2, AFB3)，这些蛋白是生长素信号的转导的重要节点，miR393的表达量提高会减少TIRl的表达，并进一步抑制生长素信号转导，从而使植物对病菌感染产生抵抗能力； miR398的表达受氧化胁迫的作用下下调表达，在拟南芥中，miR398的靶蛋白是超氧化物岐化酶CSDl和CSD2，它们在植物中可以清除氧负离子自由基，在植物抗氧化作用中起重要作用，组成型表达抗miR398切断CSD基因的转基因植物，对强紫光照射、重金属等高氧化状态的逆境有更好的抗性；miR399与植物无机磷吸收存在联系，miR399的表达受磷(Pi)饥饿的诱导而上调，这种上调在额外加入Pi之后马上被抑制，miR399的靶基因为一种UBC (Ubiquitin-conjugating E2 enzyme)蛋白，组成型表达miR399会引起植物体内Pi的代谢失调，使植物体内积累过多的Pi，导致植物呈现Pi中毒的症状；miR165/166调控叶子的极性、维管组织的发育，拟南芥有五个HD-ZIP III基因(REV、PHB、PHV、ATHB-8及ICU4)参与调节发育方面重要的方面，比如维管束的形成、在器官中建立或维持离轴及近轴的极性，所有这些基因内部都存在miR165/miR166的靶位点，miRNA调节对于维持正常器官的极性，维管系统及分生组织的发育是必不可少的。
有趣的是，还有一些植物miRNA参与调控水稻产量。例如miR167可以通过调控其靶基因ARF8，来调节生长素信号通路，并最终影响植物产量；miR159切割一类受赤霉素调控的MTO家族基因，组成型表达miR159会引起短日照情况下开花的推迟和花粉的不正常发育；近期更有报道，水稻中miR156通过对下调其靶基因0sSPL14，显著降低水稻分蘖，穗分支及种子数量，直接负调控水稻产量。因此，从miRNA角度寻找新的调节水稻产量的基因有着充分的理论基础，并将成为新的研究热点，有着广阔的发展空间。
发明内容
本发明的目的是针对当前粮食紧缺与不断增长的人口这一主要矛盾，将miRNA调控技术引入水稻的品种改良中，从而提供miR397在培育高产水稻中的应用。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的
通过分析水稻种子和胚胎中特异表达的miRNAs，发现miR397在种子和胚胎中均高表达，并且在胚后发育时表达量显著下调。这暗示了 miR397可能有调节水稻种子发育的潜在功能。为了进一步验证miR397与水稻种子的关系，本发明构建了过表达miR397的水稻突变株，该突变株生长迅速，提前抽穗，并且在成熟期时稻穗明显比野生型下垂。对该突变株进行详细的表型分析后发现，该突变株的水稻谷粒显著大于野生型谷粒，并且每穗粒数与千粒重都也明显高于野生型。最终每穗产量约高出野生型37%。除了对水稻产量的影响外，该突变株还具有提前抽穗，提高有效分蘖率的表型，非常适宜于投入生产使用。综上所述可以得出结论过表达miR397可以显著提高水稻的产量，增大谷粒大小与千粒重，增多每穗粒数。因此miR397可以用于培育高产水稻。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1.本发明发现过表达miR397可以显著提高水稻的产量，增大谷粒大小与千粒重，增多每穗粒数，这一结果为培育高产水稻提供了一种全新的并且简单有效的方法，可投入大规模推广使用；
2.本发明通过分子生物学技术培育高产水稻，不但水稻的产量高，而且不会对环境造成污染，食用安全。
图1为northern杂交检测各T3代突变株中miR397的表达水平； 其中，1为野生型对照，2 10为T3代突变株的不同转基因系列；
图2为野生型与突变株全株的比较；
其中，左边为野生型，右边为过表达miR397的突变株
图3为野生型与突变株的种子大小比较；
其中，上排为野生型，下排为过表达miR397的突变株谷粒；
图4为野生型与突变株的穗大小比较；
其中，左为野生型，右为过表达miR397的突变株穗；
图5为野生型与突变株千粒重和每穗粒数的统计比较；其中，左图为千粒重比较，右图为每穗粒数比较；黑色柱子代表野生型，红色柱子代表过表达miR397的突变株；
图6为野生型与突变株每穗产量的统计比较；
其中，黑色柱子代表野生型，红色柱子代表过表达miR397的突变株。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。实施例1 水稻总RNA提取
本实施例采用本领域常用的酚氯仿异戊醇法提取水稻总RNA，其具体步骤如下
(1)称Ig水稻样品液氮研磨成细粉，加入IOmLRNA zol (100ml中含有异硫氰酸胍47. 2g，IM柠檬酸钠(pH7. 0) 2. 5ml，10%月桂酰基氮酸钠5ml)和ImL醋酸钠(2M，pH 4.0)，继续研磨；
(2)加入IOmL的水饱和酚，4mL的氯仿异戊醇(49:1，体积比)混合液，混勻后转入离心管，涡旋lmin，冰上放置5分钟，然后4°C,12000rpm离心15min ；
(3)离心后取上清，并向上清液中加入等体积的酚氯仿异戊醇(5049 :1，体积比)混合液，涡旋lmin,冰上放置5分钟，然后40C，12，OOOrpm离心15min ；
(4)离心后取上清，重复步骤(3)2^3次；
(5)离心后取上清，并向上清液中加入异丙醇(异丙醇和上清液的体积比为0.6 :1)，冰上放置30min Ih ；
(6)4°C，12，OOOrpm离心15min，弃上清，往管中加入1.2mL DEPC处理水溶解管底沉淀， 然后每管600 μ 1分装转入1. 5mL的离心管；
(7)向上述1.5L离心管中加入600μ 1的酚氯仿异戊醇(50:49:1，体积比)混合液，上下颠倒混勻后，冰上放置5分钟，室温12，OOOrpm离心15min ；
(8)离心后取上清，重复步骤(7)2^3次；
(9)离心后取上清，将上清液每管分装300μ L分装入新的离心管中，并向分装后的离心管中加入1/10上清体积的3Μ NaAc CpH 5. 2)和3倍上清体积的无水乙醇，混勻，-20°C 放置过夜；
(10)4°C，12，OOOrpm离心15min，弃除上清，70%乙醇洗两次，95%乙醇洗一次，晾干，用 15 30 μ L DEPC处理水溶解，_20°C保存备用，即获得水稻总RNA。本实施例总RNA提取时所用到的各种试剂均为市售。实施例 2 miRNA 的 Northern 杂交
本实施例对实施例1提取的处理样品组总RNA和对照组总RNA进行Northern blot检测，所用方法均可参考本领域Northern杂交的常规操作。取实施例1制备的水稻总RNA 1 μ L进行甲醛变性胶电泳，变性电泳采用本领域的常规操作。待电泳完毕，取下电泳板后揭板，用一张和目标区域差不多大小的干滤纸覆在凝胶样品区域上，用刀片切去多余的凝胶，利用滤纸把胶翻转，剥离另一块电泳板。在胶上盖一张等面积的预先用0. 5 X TBE浸润的Hybond N+尼龙膜，将滤纸-凝胶-尼龙膜放于电泳转移系统(Bio-Rad)电极之间，胶在上面，尼龙膜在下面，上下各垫10层用0.5XTBE浸湿并赶走气泡的滤纸。用0.8 mA/cm2尼龙膜的电流强度，通电45分钟。之后关闭电源，取下尼龙膜。尼龙膜在253 nm紫外灯下正反两面分别交联3分钟，将RNA及分子量标记固定于膜上。将交联好的尼龙膜放入杂交管中，加入5 10mL杂交液(杂交液的配制可参考本领域 Northern杂交所采用的常规杂交液配制)，42 °C预杂交1小时，然后加入同位素标记探针20 yL，42°C杂交过夜。杂交完毕，将杂交液倒出，用洗膜液(2XSSPE，0.5% SDS)于室温下洗 3次，每次10分钟。将杂交膜包入保鲜膜中，压磷屏3小时以上，再用磷屏扫描仪Typhoon 8600 imager扫描，并保存结果。本实施例的Northern杂交检测结果如图1所示，过表达miR397的突变株中 miR397表达量明显高于野生型。实施例3过表达miR397水稻突变株的构建
本实施例在实施例2的检测结果基础上，进一步构建了过表达miR397的水稻突变株， 其具体步骤如下所示
1. miR397组成型表达质粒的构建
本实施例选择载体pCAMBIA1390(市售)，并且在该载体的酶切位点历'/^III和SalY之间插入CaMV35S启动子，该启动子以后可以作为控制miR397表达的组成型启动子。这里的试验操作采用本领域的常规技术。从以实施例1制备的处理样品总RNA为模板，克隆miR397基因，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，并且在扩增产物两端加上损al和^^TPI的酶切位点。PCR扩增反应条件参考PCR扩增反应试剂盒说明。 (这里上游引物采用 5，- GAATCTAGAACACGCTCTACCTACATCGTGT-3，，下游引物采用 5，- A TTGAATTCTCACCTCGTCTGCTGGGGACCT-3’)
PCR结束后回收扩增产物并进行损aI和双酶切，同时对pCAMBIA1390载体也进行损al和双酶切，然后将两个双酶切产物用Τ4连接酶连接起来即构建成miR397组成型表达质粒。上述所涉及的扩增产物回收，双酶切反应，T4连接等反应均采用本领域的常规操作，实验中所涉及的载体、试剂等均为市售。2、miR397组成型表达质粒转化水稻愈伤组织
将上述构建的miR397组成型表达质粒转化根癌农杆菌(市售)，所述转化方法为本领域常规操作，然后将该转化有miR397过表达质粒的根癌农杆菌菌种，在含有利福平，卡那霉素和潮霉素的YEP培养基(IOg酵母膏，10 g蛋白胨，5 g NaCl, 15 g琼脂)上进行划线培养，黑暗培养2 3天后挑取单菌落涂布于含有相同抗生素的YEP培养基上，黑暗培养2天，刮取适量菌体悬浮于含有100 μ M乙酰丁香酮的液体共培养基中，使之稀释至 0D550为0.3左右，28°C摇床(140 rpm)培养40分钟，即制备得到根癌农杆菌浸染液，可用于侵染。取水稻的成熟种子剥去颖壳，用75%酒精浸泡1分钟后用无菌水清洗多次，然后用次氯酸钠处理两次，每次20分钟，期间摇动多次，无菌水清洗多次后用无菌滤纸吸干水分，接到诱导培养基(N6大量，B5微量，B5有机，铁盐，2mg/L 2，4_D，30g/L蔗糖，500mg/L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，3. Og/L植物凝胶)上，将诱导出的胚性愈伤组织接到新鲜的诱导培养基上继续培养，每隔2 3个星期再挑取生长状态好的愈伤组织接到新鲜的诱导培养基上进行继代培养。挑取淡黄色、颗粒状、结构致密、生长状态好的愈伤组织到无菌三角瓶中适当干燥处理后，加入上述制备好的根癌农杆菌侵染液侵染20分钟，期间适当摇动几次。侵染后将愈伤组织放在加有无菌滤纸的培养皿中，风干1 2小时。然后把愈伤组织接到加有一层滤纸的共培养基上，再风干半小时左右后，置于^TC黑暗培养2 3天。3、转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化
取出共培养后的愈伤组织放在加有三层滤纸的无菌培养皿中，干燥1天左右，再接到筛选培养基上，置于26°C黑暗培养14 21天。共筛选两次。挑取生长状态好的抗性愈伤组织接到预分化培养基上，26°C光照培养。21天后，把生长状态好及出现绿点的抗性愈伤组织接到分化培养基上，使愈伤组织进行再生。待抗性愈伤组织分化出的小苗长到4 6 cm时，将其转到生根培养基上，继续在 ^TC光照培养。待小苗长至10 12 cm，叶片宽大、颜色深绿且根系生长健全后，洗掉培养基及其基部附着的愈伤组织，在室外进行盆栽种植，即得到转基因水稻(过表达miR397)。上述筛选培养基的配方为N6培养基大量+MS培养基微量+B5培养基少量+Ig/ L水解酪蛋白+lg/L脯氨酸+2mg/L (2，4_D) +30g/L蔗糖+潮霉素50mg/L+头孢500mg/ L+4g/L植物凝胶，筛选培养基的终PH=5. 8。上述预分化培养基的配方为MS培养基+ lg/L水解酪蛋白+ 20g/L蔗糖+lmg/L (2，4-D) +头孢500mg/L+潮霉素50mg/L + 4g/L植物凝胶，预分化培养基的终pH=5. 8。上述分化培养基的配方为MS培养基+ang/L (6-BA)+0. 5mg/L萘乙酸+ lmg/L激动素+30g/L蔗糖+3%山梨醇+4g/L植物凝胶，分化培养基的终pH=5. 8。上述生根培养基的配方为1/2 MS培养基。本实施例中所采用的MS培养基、1/2MS培养基和N6培养基等的配方均采用本领域的常规配方。上述各培养基配方中所涉及的试剂均为市售。实施例4转基因水稻种植和表型分析
所有表型分析均使用T3代水稻植株。水稻种子用水萌发，在平盘上种植一周后，转种于大田中长至谷粒成熟。其中，种子大小，千粒重比较使用完全成熟并烘干后的种子；每穗粒数统计使用完全成熟并烘干的完整的穗；所有统计数据均为多于60棵的水稻苗的平均值。每穗产量计算是用单颗谷粒重量乘以每穗粒数。
权利要求
1.miR397在培育高产水稻中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于该应用是通过筛选过表达miR397的水稻从而得到高产水稻。
全文摘要
本发明公开miR397在培育高产水稻中的应用。本发明人通过分析水稻谷粒和胚胎中特异性表达的miRNA，发现miR397在谷粒中大量表达，并在胚后发育中显著下调，暗示了miR397在水稻谷粒发育中的调控作用。然后本发明人构建了过表达miR397的水稻突变株，该突变株生长迅速，提前抽穗，并且在成熟期时稻穗明显比野生型下垂。对该突变株进行详细分析后，结果显示，过表达miR397的突变株谷粒明显大于野生型谷粒，并且穗型更大，每穗粒数显著高于野生型，千粒重和产量也有显著提高。这一结果为培育高产水稻提供了一种全新的并且简单有效的方法，可投入大规模推广使用，且不会对环境造成污染，食用安全。
文档编号C12N15/113GK102409055SQ20111036486
公开日2012年4月11日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者于洋, 张玉婵, 徐杰, 李洪清, 王小菁, 陈月琴 申请人:中山大学, 华南师范大学