专利名称：植物抗冻蛋白的基因序列、编码蛋白及其应用的制作方法
植物抗冻蛋白的基因序列、编码蛋白及其应用技术领域
本发明本发明涉及植物抗冻蛋白的基因序列、编码蛋白及其应用，更具体涉及一种从小麦冷冻处理的AFLP-CDNA差异文库中筛选出小麦抗冻蛋白TaAFPIII的核苷酸序列、 编码蛋白及其应用。
背景技术：
抗冻蛋白(antifreeze protein, AFP)又称为热滞蛋白，最早是1969年Devnes在极区海鱼淋巴中被发现，研究对象先后从极区鱼类扩展到昆虫，最后又扩展到植物甚至微生物。
低温冻害是农业生产中一种严重的自然灾害，也是某些农作物区域性和季节性限定因素。世界上气温每降低l°c，粮食就会减产40%。全世界每年因为冻害造成的经济损失达到10亿美元。我国在1999年发生在广东、广西、福建三省的低温冻害造成经济损失 150亿元左右，受害面积在1500万亩以上。受2009年冬天大雪和2010年倒春寒等气候的影响，石家庄市有100万亩小麦出现不同程度的死苗死蘖现象，其中10万亩需要毁种，减产幅度在2 3成左右。因此如何改造农作物的遗传特性，使之从冻害的危害中解脱出来一直是农业科学工作者的理想和追求。
许多研究表明，植物要抵抗冰冻的危害需要具备两个基本要素一是避免细胞内结冰；二是细胞膜结构及核酸蛋白质等生命物质的低温稳定性。细胞外结冰和细胞液的过冷却是植物避免细胞内结冰伤害的主要和最普遍的适应机制。AFP对膜系统提供一种保护作用，即避免胞外冰晶透过细胞而使胞内液体结冰。据此推测植物体内存在能够阻止冰核形成的物质，这种物质的含量会随着季节和温度的变化而消长。AFPs被发现以来，研究对象先后从极区鱼扩展到昆虫。直到1992年，加拿大Griffith等第一次明确提出获得植物内生AFP，他们从经过低温处理的冬黑小麦(Secale cereale L.)叶片的质外体中提取并部分纯化了该蛋白，实验证明该蛋白具有和鱼AFP相似的功能特点。同年，Duman从白英 (Solanum dulcamara)中发现多种具有热滞效应的蛋白质，两年之后，Fei从常绿植物沙冬青(Amopiptanthus monglicus)中分离到了抗冻蛋白。2005年，Zhou等从日本大戟中证明植物中存在和鱼AFP能发生免疫反应的蛋白。
目前影响小麦生产的小麦冻害类型有冬季冻害、早春冻害和低温冻害。抗性育种一直是育种研究者们追求的目标，因为这和丰产育种、品质育种密切相关。植株生长发育阶段只有适应外界的环境才能获得丰产丰收，才能使产品具有好的品质。但是近年来，我国的各个小麦生产区都受到不同程度的低温侵袭，经济上受到了巨大损失，尤其是以春小麦为主的地区，这种现象则更为严重。目前在小麦中已经克隆出许多和低温相关的基因，同时证明这些基因的表达确实能够提高小麦的低温抗性，但提高的程度很有限，这就是小麦低温抗性育种停滞不前的主要原因。研究表明小麦对低温适应性受多基因调控，其中有主效基因和微效基因两类，如果能够分离出主效基因，无论对基因功能还是调控机理以及生产方面都有非常重大的意义。另外根据现在许多研究表明多数基因在抗逆境方面具有多重性，即一个基因的表达提高能够影响转基因植物对低温、干旱、盐等多种非生物的胁迫。从基因数量和低温有关的信号传递方面来看，研究进展还很缓慢。发明内容
本发明所要解决的第1个技术问题是提供一种植物抗冻蛋白的基因序列。
本发明所要解决的第2个技术问题是上述基因序列的编码蛋白。
本发明所要解决的第3个技术问题上述编码蛋的应用。
本发明所述的基因TaAFPIII是从小麦cDNA_AFLP差减文库中筛选到的一个新基因。其cDNA序列和编码蛋白的氨基酸序列如下。该基因cDNA全长782bp，开放阅读框为 507bp，编码一个含有168个氨基酸残基的蛋白质。该基因是首次在植物中发现的和极区鱼抗冻蛋白同源性达到93%。在GenBank中进行同源搜索，发现该基因尚无报道。
所述编码蛋在抗冻小麦、抗冻烟草中的应用。
本发明与现有技术相比，转TaAFPIII基因的烟草抗冻性显著提高，在-20°c条件下冷冻Ih后，仍然能够在室温下恢复生长。与前人抗冻蛋白转基因植物相比，效果极其显著。这对以后转基因抗冻植物的应用提供宝贵的基因资源。又因为小麦是主要粮食作物， 其体内的AFP对人的身体健康没有副作用，因此体外大量合成后可以将之应用于食品行业作为添加剂，必定有广阔的应用前景。
图1为荧光定量PCR检测不同天数冷冻诱导对AFP表达量的影响。
a表示叶子中的表达量；b表示根中的表达量
图2为用不同激素处理对小麦AFPIII表达量的影响，
图中1为水杨酸、2为PEG10000，3为ABA，4为茉莉酸甲酯，图2表明0. 2mM茉莉酸甲酯和15% PEG10000在喷洒小麦Mi的时候，TaAFPIII表达量有所提高，但随着时间的延长，AFP表达量又趋于正常。0. ImM水杨酸对TaAFPIII表达量没有影响，而0.2mM脱落酸 (ABA)对TaAFPIII的表达反而有一定程度的抑制作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细的说明。
实施例1 小麦抗冻基因的获得
1、采取异硫氰酸胍-酚法提取小麦RNA
(1)取IOOmg小麦(中国春Chinese Spring)叶片放入研钵中，加入液氮充分研磨，加入1. 5mL异硫氰酸胍(4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠(pH 7. 0),0. 5%十二烷基磺酸钠，0. IM β -巯基乙醇)。转移到2mL离心管中，置于冰上放置。
(2)加入100 μ L 2M NaAc, 200 μ L氯仿/异戊醇，ImL水饱和酚，混勻。
(3)剧烈振荡10s，冰上放置15min。
(4) 4°C，12000rpm 离心 20min。
(5)将上清转移至焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的离心管中，加入等体积异丙醇，混勻，-20°C沉淀Ih。
(6)4°C，12000rpm 离心 20min，弃上清。(7)70%乙醇重悬漂洗两次，41，12000印111离心51^11。弃上清。(8)加入40 μ L DEPC处理的水溶液，溶解得到总RNA。2、SMART cDNA 文库的构建^ M BD Clonetech & 目白勺 Switching Mechanism At 5’ end of the RNATranscript (SMART) cDNA文库构建试剂盒，按照说明书步骤分别构建室温培养和4°C处理小麦两种cDNA文库，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较冷处理和正常处理的小麦样本的电泳结果，挑取差异片段委托上海生工完成测序工作，得到其中一条差异序列如下TAAGTCCGTGGTGGCCAACCAGCTGATCCCCATAAATACTGCCCTGACTCTAGTGATGATGMGGCGGA GGAAGTCAGCCCAAAGGGCATCCCTGCCGAGGAGATCCCCAAACTAGTGGGAATGCAAGTGAACAGGGCAGTGTATC TGGACCAAACCCTAATGCCAGATATGGTGAAAAACTATGAGATGA。3. RACE技术扩增AFPIII全长采用clonetech smarter RACE试剂盒，根据以上得到的基因片段序列，设计两条特异引物Pl :GATGAAGGCGGAGGAAGT和P2 :CTGGCATTAGGGTTTGGT，按照试剂盒说明书，进行 PCR扩增，得到的目的条带委托上海生工测序后获得5 ‘端基因序列和3’端基因序列，经过序列拼接后得到该基因全长。该cDNA全长782bp，含有504bp的开放阅读框。编码一个含有168个氨基酸残基的蛋白质，推测其分子量为18. 19kD，pI值为8. 8。在GeneBank中进行同源搜索，发现它与极区鱼类抗冻蛋白AFPIII达到93%，为一种新型的植物抗冻蛋白基因。我们命名为TaAFPIII。实施例2 小麦抗冻基因的表达模式分析1.小麦叶片和根的冷处理取中国春种子放在铺有滤纸的9#培养皿中，加水使滤纸湿润，于25°C暗培养Mh， 待其萌发后，16h光培养，8h暗培养的条件下培养一周，150 μ EnT2 s_2福照度待小麦长至 7-8cm长度时，加入霍格兰Hogland营养液进行培养，取一半小麦作为处理组移入4°C冷库， 剩下作为对照组。每天分别在25°C条件下和4°C条件下取三株小麦材料，连续取样一周，共取7次样，分别提取小麦叶片和根部的RNA。2.小麦叶片和根的植物激素处理取中国春种子放在铺有滤纸的9#培养皿中，加少量水使滤纸湿润，于25°C暗培养 Mh，待其萌发后，光培养一周，待小麦长至7-8cm长度时，分别用0. ImM的水杨酸、0. 2mM茉莉酸甲酯、0. 2mM ABA和15%PEG10000溶液10mL，对小麦叶片进行喷洒，分别于0h、6h、12h、 18h、24h取样，置于_20°C，提取各样品的RNA。3.对以上两种模式的real-time RT-PCR反应使用异硫氰酸胍法(实施例1)分别提取小麦总RNA，分别设计AFPIII引物P3 =TTT GCT GTT CGT CCT CCT TT、P4 :TCC GAT TAT TCG GGG AAT GT禾口 β-Actin 引物P5 :GTC GGT GAA GGG GAC TTA CA、P6 :TTC ATA CAG CAG GCA AGCAC，荧光定量PCR反应条件为94°C (30 秒)-58 V (30秒)-72 V (1分钟)，30个循环。结果如图1、2所示小麦的叶片在4°C冷处理的在第二天的时候叶子中的 TaAFPIII基因表达量突然长至平时基因的266倍，之后又恢复正常水平，而根中的 TaAFPIII基因在第三天时表达量有所上升，长至平时的3倍多。证明该基因受温度显著调控。0. 2mM茉莉酸甲酯和15% PEG10000在喷洒小麦6h的时候，TaAFPIII表达量有所提高，但随着时间的延长，TaAFPIII表达量又趋于正常。水杨酸对TaAFPIII表达量没有影响，而ABA对TaAFPIII的表达反而有一定程度的抑制作用。实施例3 =AFPIII基因在烟草中的表达1.植物表达载体pBI121-AFP的构建根据TaAFPIII 基因全长序列设计一对引物 P7 :ACT TCTAGA ATG AAG TCA GTTGTT TTA ACT (划线部分为 Xba I 酶切位点)，P8 :ACT GGATCC CTC ATA GTT TTT CACCAT ATC (戈Ij 线部分为BamHI酶切位点)从反转录的cDNA模板上扩增出带有酶切位点的TaAFPIII基因全长序列。退火温度设置为65°C。用BamHI和)(baI双酶切回收后的RT-PCR产物和pBI121 质粒，使用天根的胶回收试剂盒对基因片段进行回收，用Takara的连接酶连接后形成重组载体，用冻融法转入农杆菌LB4404菌株中。(冻融法转入农杆菌参考文献余云舟等，2003. 重组质粒导入根癌农杆菌冻融法的研究，吉林农业大学学报(3) :257-259)2.使用农杆菌侵染烟草方法如下(参考文献Horsch，R.B.，J. E. Fry, et al. (1985). “ A Simpleand General Method for Transferring Genes into Plants. " Science 227(4691) 1229-1231.)一周后，待其分化出小芽，当小芽长至2 3cm时，切下芽，将其插在常用的生根培养基(如 J/^MS+O. 3mg/L NM+100mg/L Kan+250mg/L Cef)上，置于培养瓶中，28°C光培养。一个月后，待其根系较粗时移盆，温室培养。选择长势较好的移盆的烟草进行低温冷冻处理，选择两株对照(没有进行农杆菌转化，仅仅同时培养的烟草)，两株PCR检测阳性植株。放入冰柜中冷冻处理，池后，打开冰柜，烟草表型上没有区别，用手触摸叶片发现，转基因烟草叶片表面冰冷但质地柔软，与正常叶片相似。而对照烟草叶片冰冷且质地僵硬，明显感觉有冰晶的形成。取出后放于室温下，对照叶片开始凋落，而转基因植株没有任何变化。但对照组尚有一株没有完全萎焉，因此选择在放入冰柜Ih冷冻处理。冷冻处理4h后，对照的两株烟草已经全部凋落，而转基因植株没有明显变化。将烟草放入光照培养室，进行恢复培养，一天后，对照组烟草已经枯萎，而转基因植株仍然正常生长。上述结果显示转入了 TaAFPIII基因的烟草具有在_20°C至少4h的的低温环境中仍能存活。
权利要求
1.植物抗冻蛋白的基因序列，其特征在于其由序列表SEQID NO :1的核苷酸序列定义。
2.植物抗冻蛋白的基因序列的编码蛋白，其特征在于其由序列表SEQIDNO :2的氨基酸序列定义。
3.权利要求2所述的植物抗冻蛋白的基因序列的编码蛋白在植物抗冻方面的应用。
全文摘要
本发明公开了植物抗冻蛋白的基因序列、编码蛋白及其应用，所述的基因序列，其由序列表SEQ ID NO1的核苷酸序列定义。本发明与现有技术相比，转TaAFPIII基因的烟草抗冻性显著提高，在-20℃条件下冷冻1h后，仍然能够在室温下恢复生长。与前人抗冻蛋白转基因植物相比，效果极其显著。这对以后转基因抗冻植物的应用提供宝贵的基因资源。又因为小麦是主要粮食作物，其体内的AFP对人的身体健康没有副作用，因此体外大量合成后可以将之应用于食品行业作为添加剂，必定有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/84GK102505015SQ20111036479
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者于红梅, 何光源, 程立宝, 高轩 申请人:安徽师范大学