预测子宫内膜癌患者对化疗药物敏感性的方法和试剂盒的制作方法

专利名称：预测子宫内膜癌患者对化疗药物敏感性的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预测子宫内膜癌患 者对化疗药物敏感性的方法和试剂盒，特别涉及一种通过测定子宫内膜癌患者ΑΡ-2 α基因单核苷酸多态性位点rsl045385基因型来预测子宫内膜癌患者对化疗药物敏感性的方法和试剂盒，属于医学生物技术和基因诊断领域。
背景技术：
子宫内膜癌，又称为子宫体癌，是妇科常见的恶性肿瘤。子宫内膜癌的治疗以手术治疗为主，化学治疗(化疗)，是子宫内膜癌的辅助治疗方式。近年来化疗在子宫内膜癌治疗中的价值越来越受到重视。化疗不仅用于晚期患者的姑息治疗和有严重内科并发症、高龄等不宜手术治疗的病例，而且用于手术病理分期后具有高危因素者的辅助治疗或手术切除范围不足的补充治疗。术后化疗可降低早期子宫内膜癌患者的远处转移率，使死亡风险降低。本发明涉及到的AP-2ci基因是AP-2转录因子家族中的一个重要成员。AP-2基因家族在胚胎发育，细胞分化和肿瘤发生方面都有重要的调控作用，现在已鉴定属于该家族的成员有ΑΡ_2α、ΑΡ_2β、ΑΡ-2 γ、ΑΡ-2 δ和AP-2 ε。近来，越来越多的研究表明，ΑΡ_2 α 不仅是胚胎发育过程中的一个重要调控因子，而且参与肿瘤发生发展过程。AP-2CI调控许多参与细胞生长和凋亡的基因，从而抑制肿瘤的生长和肿瘤转移。AP-2CI蛋白在肿瘤细胞中表达水平与化疗敏感性有关，ΑΡ-2 α蛋白表达高的患者(肿瘤细胞)对顺钼、依托泊苷、 紫杉醇、阿霉素、吉西他滨等化疗药物敏感，反之，ΑΡ-2 α蛋白表达低的患者(肿瘤细胞)对这些化疗药物有耐药性(Wajapeyee N等，Cancer Res 2005;65:8628-8634; Jonckheere N 等，Br J Cancer 101: 637-644.)。MicroRNA (miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它通过不完全互补结合到目标靶mRNA 3'非翻译区(UTR)上并阻止目标基因的表达。miRNA在细胞分化、生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，越来越多的引起研究人员的关注。许多研究发现miRNA-200家族(包括miR-200b，miR-200c, miR-429, 以下统称为miR-200b/200c/429)在许多癌(尤其子宫内膜癌)组织中的表达显著高于相应的正常组织，而且miR-200b/200c/429在癌细胞中的高表达导致细胞对化疗药物敏感性降低(Lee JW 等，Genecol Oncol, 2011 120 56-62 ； Hamano R 等，Clin Cancer Res, 2011， 17:3029-3038)。单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传的变异中最常见的一种。目前，已有研究表明个体对药物的反应、疾病易感性等都与SNP相关(许玲等，世界消化杂志，2005，13:592-595)。因此，研究SNP 位点与肿瘤患者耐药性的关系可以为个性化用药和预后判断提供指导作用。目前已有通过检测SNP位点预测癌症、高血压继发性左心室肥厚、脑卒中等疾病易感性的方法(专利号 ZL200910043021. 0，ZL200710064639. 6，ZL200810102698. 2)，但尚未有通过检测单核苷酸多态性位点预测癌症患者对化疗药物敏感性的方法。

发明内容
本发明的目的 有两个一是提供一种预测子宫内膜癌患者对化疗药物敏感性的方法，用于弥补目前通过检测单核苷酸多态性位点预测癌症患者对化疗药物敏感性方面的空白；二是提供一种预测子宫内膜癌患者对化疗药物敏感性的试剂盒，用于实际预测子宫内膜癌患者对化疗药物敏感性。本发明公开的预测子宫内膜癌患者对化疗药物的敏感性的方法，通过检测子宫内膜癌患者的ΑΡ-2 α基因单核苷酸位点rsl045385的基因型来实现预测。所述的检测子宫内膜癌患者ΑΡ-2 α基因单核苷酸多态性位点 rsl045385基因型的方法，在PCR扩增与测序时使用的引物碱基序列为正向引物 5' -GGGACTGAGTCACCACCTTC- 3‘；反向引物 5' -GAATCGTGTTGCCAGAGAAAG- 3‘。一种用所述的引物制成的预测子宫内膜癌患者化疗药物敏感性的试剂盒，该试剂由下列试剂混合而成
125 ml 2. 5mmol/L 10'PCR 缓冲液，100 ml 2. 5mmol/L dNTP 混合液，50 ml 10mmol/L 正向引物，50 ml 10mmol/L 反向引物，6. 5 ml 5 unit/ml Taq DNA 聚合酶，1 ml 无菌蒸馏水，试剂盒包含50次反应用量。本发明公开的预测子宫内膜癌化疗药物敏感性的方法通过测定子宫内膜癌患者 ΑΡ-2α基因单核苷酸多态性位点rsl045385基因序列来实现检测目的，有如下几个优点
1、对样品没有限制，可通过血液、腹水、病理切片等样品来提取患者DNA;
2、测定简单，只需对患者提取的DNA进行PCR扩增和DNA测序即可完成测定，不需要提取细胞并进行细胞培养，时间短，效率高；
3、本发明的方法和试剂盒对子宫内膜癌患者的测定，可以为个性化用药和预后判断提供指导作用。下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制。


图1 :ΑΡ-2 α基因的3' UTR上的π Κ-200ν200( /429结合位点(箭头所指为SNP rsl045385 位点)。图2 在子宫颈癌细胞HeLa细胞中过表达miR_200b/200c/429导致ΑΡ_2α蛋白水平下降。图3 在子宫颈内膜癌细胞HEC-IA中干扰miR_200b/200c/429的表达导致ΑΡ-2 α 蛋白水平上升。图4 :ΑΡ-2 α基因多态性影响π Κ-200ν200(;/429对ΑΡ-2 α表达的调控。图5 :ΑΡ-2 α基因多态性影响子宫内膜癌细胞对顺钼的敏感性。
具体实施例方式实施例1:
检测ΑΡ-2 α基因单核苷酸位点rsl045385基因型的PCR引物的设计1、从Ensembl 数据库(http://www.ensembl.org)上下载包含 rsl045385 位点的 ΑΡ-2 α基因的DNA序列，其中SNP位点上下游各选取300 bp ；
2、将上述序列用Primer3软件或其他引物设计软件来设计引物。引物设计要遵循以下原则引物长度为If 30 bp，引物GC含量在409Γ60%之间，碱基要随机分布，尤其3'端不应超过3个连续的G或C，引物自身及引物之间不应存在互补序列，扩增产物的长度为 150 500 bp ；
3、检测引物的特异性引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测，如果引物与其它基因不具有互补性，就可以进行预实验。用设计好的引物扩增人基因组DNA，将PCR反应产物在琼脂糖胶上电泳，并在紫外分析仪上观察PCR产物。PCR产物应为单一的条带，分子量大小为预期大小一致。实施例2 检测子宫内膜癌化疗敏感性的方法和试剂盒
试剂盒为50人份，包括下列试剂125 ml 10'PCR缓冲液，100 ml dNTP混合液(各 2. 5mM) , 50 ml 正向引物(10 mM), 50 ml 反向引物(10 mM), 6. 5 ml Taq DNA 聚合酶(5 unit/ml)，1 ml无菌蒸馏水。使用步骤如下
1、采取患者外周血Iml或者病理切片提取基因组DNA ； 2、按下列组分配制PCR反应液2. 5 ml 10'PCR缓冲液，2 ml dNTP混合液(各 2. 5mM), 1 ml 正向引物(10 mM), 1 ml 反向引物(10 mM), 50 ng DNA, 1.5 ml Taq DNA 聚合酶(5 unit/ml)，加水至 25ml ；
3、将步骤2所得溶液放到PCR扩增仪上，按下列反应条件设定PCR反应程序94°C预变性2分钟，然后进行30个循环(每个循环包括94°C变性30秒，56 °C退火30秒，72°C延伸 30秒)，，最后72 °C延伸5分钟；
4、反应结束后，取5ml PCR产物加入1 ml 6X加样缓冲液，在含溴化乙锭的1. 5%琼脂糖胶上电泳，当溴酚蓝至胶长度的1/2时，取出胶在紫外分析仪上观察PCR产物。PCR产物应为单一的条带，分子量大小为217 bp ；
5、剩余的20ml PCR产物送测序公司直接测序，测序引物为正向引物 5 ‘ -gggactgagtcaccaccttc- 3 ‘弓 L 5 ‘ —gaatcgtgttgccagagaaag— 3 ‘；
6、用bl2seq 软件(http//blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)将测得的引物和下列序列进行比对，根据比对结果和测序峰图判定基因型(aa型，ac型，cc型)。aa型患者对化疗药物不敏感，cc型患者对化疗药物敏感，ac型患者对药物敏感性介于aa型和cc型之间。gggactgagt caccaccttc ccttacatac ttcagttcag attgtagcca tacttaaaaa
gccaaaagat gatgacaaca tttttatcag tmttgtgaat aaacttgaac acaaatacac gaagttccat gtcatgtctt cagttgtaga agtttttcct ctttaaggta aagcgaccaa cttgaacttt ctctggcaac acgattc
注m为多态性位点rsl045385，a或c。实施例3 生物信息学方法预测调控ΑΡ-2 α基因的miRNA
我们米用 4 个在线软件 TargetScan (http //www. targetscan. org/)，MicroCosm Targets(http//www. ebi. ac. uk/enright-srv/microcosm)，DIANA-microT (http//diana. cslab. ece. ntua. gr/microT)禾口 miRanda(http://www. microrna. org)予页测 AP-2 α 基因上miRNA结合位点。这4个软件预测的结果不完全相同，但都预测出在ΑΡ-2α基因的 3'端非翻译区(3' UTR)的第517至537位核苷酸是miR-200b，miR_200c和miR-429的结合位点(图1)。通过查询 Ensembl 数据库(http //www. ensembl. org)，我们发现在 miR_200b， miR-200c和miR-429的结合位点上有一个单核苷酸多态性位点(rsl045385)(图1中黑色箭头所示)。实施例4: miR_200b/200c/429对子宫内膜癌和子宫颈癌细胞中ΑΡ_2α蛋白表达的影响
子宫内膜癌细胞系HEC-IA和子宫颈癌细胞系HeLa均购自中科院上海细胞库。HEC-IA 和HeLa细胞在37°C、5% C02、90%相对湿度培养箱中，分别用McCoy’ s 5a和DMEM完全培养液(加10%新生牛血清、2 mM L-谷氨酸、青霉素和链霉素)进行培养。待细胞密度至70%，用脂质体Lipofectamine 2000转染试剂盒(Invitrogen公司)将miRNA模拟体和miRNA抑制剂(购自上海吉玛公司)分别转染HeLa细胞和HEC-IA细胞。脂质体法转染步骤如下在转染前将细胞从完全培养基中转入到无血清无抗生素的培养基中培养。每IOcm皿孔miRNA模拟体或miRNA抑制剂用量为600 pmol，用无血清无抗生素的培养液稀释到1.5 mL，轻轻混勻，室温静置5 min0同时取30 μ L脂质体用无血清无抗生素的培养液稀释到1.5 mL，轻轻混勻，室温静置5min。将上述稀释的脂质体和miRNA 模拟体(miRNA抑制剂RNA)混勻，室温静置20min。然后滴加入细胞培养皿中，轻轻混勻，常规条件培养。让DNA/脂质体复合物与细胞接触6h后，换成有血清和抗生素的培养液继续培养。转染36h后，吸去培养液，用PBS缓冲液漂洗细胞，吸净PBS，再加入2 mL的1 X 裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl (pH 7. 2), 150 mM NaCl, 1% (v/v) Triton X-100, 1% (w/ ν) sodium deoxycholate, 0.1% (w/v) SDS)摇勻。-80°C冰箱内放置 15min，37°C培养箱内温育5min，重复冻溶一次，使细胞充分裂解。用细胞刮将细胞从小孔上刮下，将细胞裂解液及细胞用移液枪转入1. 5mL的离心管，置于冰上。旋涡震荡10-15sec，12000Xg于4°C离心2min。取上清液转移至干净的离心管中。 将蛋白样品首先用15 %的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳。通过电转移的方法(恒压lOOv，4°C电转移1.5h)将蛋白质转印至PVDF膜，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。将转印好的尼龙膜用含10%脱脂奶粉的TBS缓冲液(10 mM Tris-HCl (pH 7. 4)，0. 9 % NaCl)作为封闭剂封闭60min。膜浸没加入按1 1000用封闭剂稀释的AP-2 α单克隆抗体，于摇床中摇Ih让稀释的抗体与PVDF膜充分结合。用TBS 缓冲液洗膜4次，每次lOmin。将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG (稀释2000倍)作为第二抗体加入封闭剂，使膜浸没其中于摇床中继续摇lh。用TBS缓冲液洗膜4次。最后用 DAB溶液显色。结果显示，未转染的或转染阴性对照的HeLa细胞中，ΑΡ-2 α蛋白表达高，而加入 miR-200b, miR_200c或miR-429后，细胞中ΑΡ-2 α蛋白量显著下降(图2)。未转染的或转染阴性对照的HEC-I细胞中，AP-2ci蛋白量极微，而干扰 miR-200b, miR_200c或miR-429后，细胞中ΑΡ-2 α蛋白量显著上升(图3)。
实施例5 :ΑΡ-2 α基因多态性影响细胞中π Κ-200ν200(;/429对ΑΡ-2 α基因表达的调控
按实施例2中的方法进行细胞培养、转染、提取蛋白质和Western杂交。在6cm培养皿上培养HEK293细胞，并将Myc-AP_2融合蛋白表达质粒 pMyc-AP-2 α (A)禾Π pMyc-AP-2 α (C)质粒分别与 miRNA共转染到细胞中。pMyc-AP-2 α (A) 和pMyc-AP-2 α (C)为本研究室构建的含有ΑΡ_2 α全长序列(包括编码区序列和3 ‘ -UTR) 的Myc-AP-2融合蛋白表达质粒，这2种质粒区别在于多态性位点rsl045385的碱基不同， 前者为A，后者为C，其它序列均完全相同。转染后36小时提取蛋白质并Western杂交方法检测ΑΡ_2α的表达。结果表明，在转入miRNA阴性对照的细胞中，pMyc-AP-2 α (A) 和pMyc-AP-2 α (C)表达量一致，而在转染miR-200b，miR-200c或miR-429的细 胞中，pMyc-AP-2 α (C)表达量显著高于pMyc-AP-2 α (A)图4)。这些结果说明多态性位点rsl045385 A突变为C后， miR-200b, miR-200c 和 miR-429 不再和和 AP-2 3 ‘ -UTR 结合，从而 AP-2 α 表达提高。实施例6: ΑΡ-2 α基因多态性影响子宫内膜癌细胞对顺钼的敏感性
按实施例2中的方法进行细胞培养、转染。在6cm培养皿上培养子宫内膜癌细胞系 HEC-1A，并将Myc-AP-2融合蛋白表达质粒pMyc-AP-2 α (A)和pMyc-AP-2 α (C)质粒分别转染到细胞中。转染后12小时后，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在 10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。细胞计数后，把细胞接种于6孔培养皿中，每皿 50,100,200 个细胞。培养4小时后，加入不同浓度的顺钼(cisplatin，美国SIGMA公司生产)处理6小时，然后换成新鲜完全培养基。置37°C 5% C02及饱和湿度的环境下，静置培养2周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2 次。用甲醇固定15分钟，然后去固定液，加适量Giemsa染色液染15分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，最后计算克隆形成率和细胞存活率(surviving fraction)。结果(图5)表明在细胞中顺钼浓度大于IOmM时，转pMyc-AP-2 α (C)的细胞中细胞存活率显著低于转染pMyc-AP-2 α (A)的细胞，说明多态性位点rsl045385 A突变为C后， 细胞对顺钼的敏感性增加。
权利要求
1.一种预测子宫内膜癌患者对化疗药物敏感性的方法，其特征在于通过测定子宫内膜癌患者AP-2CI基因单核苷酸多态性位点rsl045385的基因型来实现预测。
2.根据权利要求1所述的预测子宫内膜癌患者AP-2ci基因单核苷酸多态性位点 rsl045385基因序列的方法，其特征在于PCR扩增与测序时使用的引物碱基序列为正向引物 5' -gggactgagtcaccaccttc- 3‘；反向弓丨物 5' -gaatcgtgttgccagagaaag- 3‘ 0
3.一种用如权利要求2所述的引物制成的预测子宫内膜癌患者化疗药物敏感性的试剂盒，其特征在于该试剂由下列试剂混合而成125 ml 2. 5mmol/L 10'PCR缓冲液，100 ml 2. 5mmol/L dNTP 混合液，50 ml 10mmol/L 正向引物，50 ml 10mmol/L 反向引物，6. 5 ml 5 unit/ml Taq DNA聚合酶，1 ml无菌蒸馏水，试剂盒包含50次反应用量。
全文摘要
本发明公开了一种预测子宫内膜癌患者对化疗药物敏感性的方法和试剂盒，通过检测子宫内膜癌患者AP-2α基因单核苷酸多态性位点rs1045385基因型来预测子宫内膜癌患者对化疗药物的敏感性。利用本发明的方法和试剂盒来与预测子宫内膜癌患者对化疗药物敏感性，方法简单、时间短、效率高，可以为个性化用药和预后判断提供指导作用。
文档编号C12Q1/68GK102382894SQ20111039124
公开日2012年3月21日 申请日期2011年12月1日 优先权日2011年12月1日
发明者丁小凤, 向双林, 周建林, 周畅, 张健, 胡翔 申请人:湖南师范大学