一种重组溶葡萄球菌素位点特异性整合载体及其构建的重组细胞的制作方法

专利名称：一种重组溶葡萄球菌素位点特异性整合载体及其构建的重组细胞的制作方法
技术领域：
本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆胚的核供体细胞的构建，特别涉及一种重组溶葡萄球菌素位点特异性整合载体及其构建的重组细胞。
背景技术：
奶牛乳房炎(mastitis)又名奶牛乳腺炎，主要由环境中的病原微生物感染引起的，是给奶牛养殖者带来严重经济损失的主要疾病之一，严重影响奶牛养殖业的健康发展。有资料报道美国每年因为奶牛乳房炎造成的奶产品产量和质量下降等损失达到350万美元。奶牛乳房炎分为临床型乳房炎和亚临床型乳房 炎。引起奶牛乳房炎可能有多种因素，包括牛本身的状况、治病的微生物和影响奶牛和微生物环境因素。其中治病的微生物种类很多，金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎最主要的病原菌，该菌可引起急性、慢性和亚临床性(隐性乳房炎)乳房炎，给奶业生产带来巨大损失，不仅产量下降，还增加治疗和给奶牛医疗月艮务的费用(Gill, J. et al, 2006. Efficacy and pharmacokinetics of bacteriophagetherapy in treatment of subclinical Staphylococcus aure—us mastitis inlactating dairy cattle. Antimicrob. Agents Chemother. 50，2912-2918)。多年来，治疗奶牛乳房炎都是采用广谱抗生素治疗的方法，尽管有效，但是治愈率不足50%。广谱抗生素的应用也导致了严重的耐药菌株的产生，增加了治疗的难度(D. Ferber. Antibiotic resistance-Livestock feed ban preserves drugs' power. [J].Science 2002;295:27-28)。因此，使用病原菌特异的抗生素有望减少抗性产生的机率。为了减少广谱抗生素的使用，避免对抗生素有抗性的菌株的出现，我们通过转基因奶牛的乳腺分泌病原菌特异的抗菌素，从而避免大量使用抗生素所引起的问题，抵抗奶牛乳房炎(D. E. Kerr and 0. Wellnitz Mammary expression of new genes to combatmastitis [J] Anim Sci 2003.81:38-47)。转基因动物的生产从20世纪70年代中叶开始，用原核显微注射生产转基因动物持续了 20 多年(BOWEN RA, REED ML, SCHNIEKE A, et al. Transgenic cattle resultingfrom biopsied embryos !expression of c_ski in a transgenic calf[J]. Biol Reprod,1994,50 :664-8),但这种技术的广泛应用有一定的局限性，外源基因往往是随机整合。在家畜上，胚胎干细胞还没有建系(SHIM H，GUTIERREZ-ADAN A, CHEN LR, et al. Isolationof pluripotent stem cells from cultured porcine primordial germ cells [J]. BiolReprod, 1997, 57 :1089)。而应用体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力(G00 J, BHUIYAN M. M. U. , HYUN Y J, et al. An approach for producing transgeniccloned cows by nuclear transfer of cells transfected with human alphaI-antitrypsin gene [J]. Theriogenology, 2006,65 (9) :1800-1812.)，其突出的优点是直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植(SCNT)，将基因转移步骤提前到体细胞培养阶段，这样只需在体细胞核移植前选择状态最佳的供体细胞，不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本。溶葡萄球菌素(Lysostaphin)是模仿葡萄球菌(staphylococcus simulans)分泌的ー种金属蛋白酶，具有水解葡萄球菌细胞壁肽聚糖五肽桥联的催化活性，对金葡菌有强大的溶菌作用(Recsei P A,GrussA D,Novick R P. Cloning, sequence, and expression ofthe lysostaphin gene from S taphylococcus simulans[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1987,84(5) :1127-1131) 天然溶葡萄球菌素基因编码ー种蛋白前体，产生的菌先表达蛋白前体，分泌到胞外后经巯基蛋白酶作用切去N端多个13aa重复序列而成为成熟的溶葡萄球菌素，成熟溶葡萄球菌素比蛋白前体的活性约高4. 5倍(Thumm G,Gotz F. Studies onP rolysostaphin p rocessing and characterization οι the Lysostapmn immunityfactor (Lif)of Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus[J]. MolMicrobiol,1997,23(6) :125ト1265)。国外有关成功转lysostaphin基因的动物研究有通过转基因小鼠乳腺表达Lysostaphin抗葡萄球菌感 染，结果表明通过遗传工程的方法增强泌乳动物健康降低乳房炎的经济负担是ー种有效的策略(David E. Kerri, Karen Plaut, A. JohnBramley, etal Lysostaphin expression in mammary glanas comers protectionagainst staphylococcal infection in transgenic mice[J]. Nat Biotechnol 2001 ；
19:66-70)。2005年携带Lysostaphin基因的转基因牛出生，提高奶牛抗葡萄球菌感染的乳房炎的能力(Wall RJ, Powell AM, Paape MJ, etal. Genetically enhanced cowsresist intramammary Staphylococcus aureus infection. Nat Biotechnol 2005 ；23 445-451.)。国内对lysostaphin的研究只见于作为抗生素治疗外伤感染，奶牛乳房炎和子宫内膜炎的治疗，取得了很好的效果。但是，以lysostaphin作为目的基因，以动物细胞为宿主细胞，特别是奶牛的体细胞为宿主细胞的表达载体，还少报道；也没有以lysostaphin作为目的基因构建基因克隆胚的核供体细胞细胞系的报道。OC31特异性整合酶可以介导基因的单向插入，发生位点特异性重组后产生的位点由于细胞内没有其他辅助因子存在，重组后的位点不再是整合酶的识别底物，与Cre和FLP等整合酶相比有效率上的优势。在很多动植物中均发现有假attP位点，并且他们大多位于基因间或内含子中，只有少量位于外显子中。在牛的基因组中已经定位了 4个整合位点(Ou H L, Huang Y, Zeng Y T,et al. Φ C31integrase_mediated integration hotspotin favor of transgene expression exists in the bovine genomelJ」· FEBS J,2009,276(1) :155-63)其中一个位点整合效率达到74%，是已知位点中效率最高的。这就说明在Φ〇31特异性整合酶的介导下，外源基因的插入不会影响宿主基因组及外源基因自身的正常表达。将带有attB位点的载体与表达Φ031位点特异性整合酶的质粒共转染细胞，这种方法是ー种效率上更有保证的转基因策略。

发明内容
本发明解决的问题在于提供一种重组溶葡萄球菌素位点特异性整合载体及其构建的重组细胞，以重组细胞作为核供体细胞，为制备抗金黄色葡萄球菌乳房炎的转基因奶牛提供坚实的基础。本发明是通过以下技术方案来实现一种重组溶葡萄球菌素基因，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。
所述的重组溶葡萄球菌素基因在其5'端连接如SEQ. ID. NO. 2所示的CSN5调控元件，在其3'端连接如SEQ. ID. NO. 3所示的CSN3调控元件。在CSN5调控元件的Y端还连接有如SEQ. ID. NO. 4所示的att B序列，在att B序列的上下游还分别设有绝缘子序列。所述的绝缘子序列为如SEQ. ID. NO. 5所示的鸡@ -乳球蛋白绝缘子序列。在重组溶葡萄球菌素基因的在上游还连接有荧光标记基因，下游还连接有抗生素筛选基因。所述的荧光标记基因与重组溶葡萄球菌素基因之间设有终止子或绝缘子序列，在抗生素筛选基因的上下游连接有Ioxp序列。 包括SEQ. ID. NO. I所示的重组溶葡萄球菌素基因，其5'端连接如SEQ. ID. NO. 2所示的CSN5调控元件，在其3'端连接如SEQ. ID. NO. 3所示的CSN3调控元件；CSN5调控元件的5'端还依次设有荧光标记基因及启动子，在CSN3调控元件与启动子之间设有抗生素筛选基因。在荧光标记基因与CSN5调控元件之间还设有att B序列，在att B序列的上下游还分别设有绝缘子序列；在抗生素筛选基因的上下游连接有Ioxp序列。基于所述的重组溶葡萄球菌素的乳腺特异性表达载体构建的重组细胞，以荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将线性化的重组溶葡萄球菌素的乳腺特异性表达载体转染到宿主细胞中。所述的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果I、本发明构建了一种重组溶葡萄球菌素基因，在其成熟肽编码序列中进行了糖基化突变保证能够在哺乳动物细胞中产生具有生物活性的溶葡萄球菌素；其次将溶葡萄球菌素基因成熟肽连接到牛￠-乳球蛋白信号肽后面组成重组溶葡萄球菌素基因，使溶葡萄球菌素基因在乳腺细胞中表达后分泌到乳汁中；最后用CSN5、CSN3作为调控元件指导重组溶葡萄球菌素基因在牛的乳腺组织中特异性高效表达。2、本发明将目的基因及其调控元件还通过attB序列，在OC31整合酶的介导下实现特异位点的整合，在构建的重组细胞的检测结果显示目的基因被整到到预期是位点；将乳腺特异性表达载体pEGFP-ClMAB与OC31整合酶的表达载体pCMVINT共转染牛胎儿成纤维细胞，构建转溶葡萄其菌素基因的牛胎儿成纤维细胞系。将其荧光显微观察标记基因EGFP的表达情况，并经G418筛选获得阳性细胞，提取阳性细胞基因组，并进行PCR和Southernbloting鉴定证实目的基因重组溶葡萄球菌素整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。而进一步在抗生素筛选标记基因neo的上下游设计Loxp序列，通过Loxp序列重组剪切掉neo基因。3、本发明构建了的乳腺特异性表达载体pEGFP-ClMAB，还在P -酪蛋白基因的5'调控区的前端和EGFP编码框的下游各添加了一个含两个鸡P -乳球蛋白绝缘子序列拷贝数的元件，插入基因组后保护目的基因和EGFP不受插入位点基因组附近沉默子的影响，目的基因和标记基因可以正常表达。4、以包含目的基因重组溶葡萄球菌素的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过SCNT获得转基因克隆胚，将这些胚胎移入受体牛的子宫有望生产出转重组溶葡萄球菌素基因的奶牛。


图I是乳腺特异性表达载体pEGFP-ClMAB的质粒图谱。图2是乳腺特异性表达载体pEGFP-ClMAB的构建流程示意图。图3是鸡β -乳球蛋白绝缘子扩增流程示意图。图4是EcoRl 1091单酶切载体pE GFP-ClMAB的琼脂糖凝胶电泳检测图。图5是Mlu I和Xho I双酶切载体pEGFP-ClMAB的琼脂糖凝胶电泳检测图。图6是荧光显微镜观察pEGFP-ClMAB载体阳性表达的牛胎儿成纤维细胞的报告基因EGFP表达的结果图。图7是对pEGFP-ClMAB载体阳性表达的牛胎儿成纤维细胞基因组的重组溶葡萄球菌素基因扩增之后的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图。图8是对pEGFP-ClMAB载体阳性表达的牛胎儿成纤维细胞基因组的反向PCR结果图。图9是对pEGFP-ClMAB载体阳性表达的牛胎儿成纤维细胞基因组的反向PCR测序结果与NCBI中牛的基因组的比对结果图。图10是对pEGFP-ClMAB载体阳性表达的牛胎儿成纤维细胞基因组的重组溶葡萄球菌素的Southern bloting结果图。图11是包含重组溶葡萄球菌素基因的重组胚的囊胚发育图；图12是对包含重组溶葡萄球菌素基因的重组胚胎基因组的重组溶葡萄球菌素基因扩增之后的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图。
具体实施例方式本发明首先构建含有重组溶葡萄球菌素和绿色荧光蛋白(EGFP)基因的乳腺特异性表达载体PEGFP-C1MAB，可以使重组溶葡萄球菌素基因在乳腺组织中特异性表达，其次在表达OC31位点特异性整合酶的质粒pCMVInt介导下，用Fugen HD将乳腺特异表达载体pEGFP-ClMAB转染高产奶牛胎儿成纤维细胞，荧光显微镜观察标记基因EGFP的表达情況，并经G418筛选获得阳性细胞，进行PCR和Southern bloting鉴定，证实目的基因重组溶葡萄球菌素整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组中。最后，将转染重组溶葡萄球菌素基因的牛胎儿成纤维细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞中，获得转基因克隆胚，并进行PCR鉴定。下面结合附图和实验对本发明作进ー步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。I、乳腺特异性表达载体pEGFP-ClMAB的构建乳腺特异性表达载体pEGFP-ClMAB的质粒图谱如图I所示，该载体包括目的基因为重组溶葡萄球菌素基因，其5'端连接如CSN5调控元件，在3'端连接所示的CSN3调控元件；CSN5调控元件的上游还依次设有荧光标记基因及启动子，在CSN3调控元件与启动子之间设有抗生素筛选基因neo,在抗生素筛选基因的上下游连接有Ioxp序列；在荧光标记基因与CSN5调控元件之间还设有att B序列，在att B序列的上下游还分别设有绝缘子序列。乳腺特异性表达载体pEGFP-ClMAB是经过多次中间载体的拼接和剪切而构成的，下面结合图2所示的构建流程图来具体说明其构建过程。I. I目的基因的克隆葡萄球菌素基因成熟肽的定点突变对溶葡萄球菌素基因成熟肽做点突变，成熟肽的蛋白第125、232位的N点突变为Q，即蛋白质是Asn点突变为Gin。在DNA序列上是将AAT突变成CAG，在序列的373 375、694 696位分别做点突变，以恢复表达的 溶葡萄球菌素蛋白在真核细胞中的生物活性，经真核细胞表达分泌，突变后的溶葡萄球菌素成熟肽可以维持其生物活性。根据GenBank ID :M15686所公布的Iysostaphin基因序列设计成熟肽点突变引物。以人工合成Iysostaphin全基因(XAFW021，TaKaRa编号CAG593)为模板，利用重叠延伸PCR技术实现成熟肽点突变，引物序列如下TBl gctgcaacac atgaacattc agcacTB2 gatcttgggc agttgactgt gaaaatgaat taacTB3 gttaattcat tttcacagtc aactgcccaa gatccaatgc cTB4 tcactttata gttccccaaa gaacacctaa agtattagta gatttctgcc atgttcttacaggTB5 tcactttata gttccccaaa gaacacctaa ag50 ii L 的 PCR 反应体系为5 X Prime S TAR Buffer (Mg2+plus) 10uL,dNTP Mixture (各 2. 5mM) :4 u L, TBl(10u mol/L) 1u L, TB2(10umol/L) 1 u L,PrirneSTAR HS DNAPolymerase (2. 5U/ u L)) :0. 5 y L，模板 I y L，加灭菌超纯水至50 u L ；反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，64°C退火15s，72°C延伸25s，30个PCR循环，72°C再延伸7min。首先利用引物TB1，TB2扩增溶葡萄球菌素基因成熟肽序列的前391bp，PCR产物命名为片段1，该片段突变了序列的373 375位的密码子，同时也就突变了蛋白的第125个
氨基酸；其次再用引物TB3，TB4，反应体系和反应条件同上，扩增溶葡萄球菌素基因成熟肽序列的后384bp。PCR产物命名为片段2，该片段突变了序列694 696位的密码子。同时也就突变了蛋白的第232个氨基酸；最后再用引物TBl和TB5，以片断I和片段2等比例的混合物为模板，反应体系同上。PCR反应条件为94°0预变性51^11，941变性308，621退火158，721延伸458，30个？0 循环，72°C再延伸IOmin结束之后在反应的产物里面加入0.5 ii L rTaq DNA聚合酶，0. 5 y LTBl和0.5 ii L TB5，放入PCR仪里，72°C反应10分钟(这个反应的目的是在上一步所得到的扩增产物两端加上A便于下一步完成TA克隆)。将所扩增的PCR产物纯化回收后做TA克隆，连接到PMD-18T Vector，转化感受态细胞E. coli DH5 a，通过a -互补的蓝白斑筛选挑选重组子，经BamH I酶切鉴定阳性重组质粒并送交上海生物工程技术服务有限公司测序，结果显示溶葡萄球菌素基因与公布的序列一致，且在预定的位点成功实现溶葡萄球菌素成熟肽的点突变，将所得载体称为重组质粒plys。
牛β -乳球蛋白信号肽长度为48bp，GenBank ID U31361. I。然后通过PCR的方法在点突变的溶葡萄球菌素基因序列的5'添加牛β_乳球蛋白信号肽得到融合溶葡萄球菌素基因，加β -乳球蛋白信号肽的目的是使溶葡萄球菌素基因在乳腺细胞中表达后分泌到乳汁中。在进行PCR上下游引物是添加BamH I酶切位点，具体设计如下LysBGHS ggatccatga agtgcctcct gcttgccctg gccctcactt gtggcgcccaggccgctgcaacacatgaac attcLysB GHA ggatcctcac tttatagttc cccaaagaac acc50μ L 的 PCR 反应体系为10 X PCR Buffer 5μ L, dNTPs (2. 5mmol/L) :4 μ L，上游引物(10ymol/L) :lyL，下游引物(10μπιο1 /υ :lyL，LAtaq 聚合酶(5U/ μ L) 0. 5μ L,|l板为点突变后的溶葡萄球菌素PCR产物I μ L，加超纯水至50 μし将克隆的带有牛乳球蛋白信号肽的重组溶葡萄球菌素基因与PMD-20TVector 4°C连接过夜，转化感受态细胞E. coli DH5 α，通过α -互补的蓝白斑筛选挑选重组子，经BamH I酶切鉴定阳性重组质粒并送交上海生物工程技术服务有限公司测序。测序结果所示与预期设计一致，成功实现重组的溶葡萄球菌素基因的克隆，所得载体称为Plys载体。所构建的重组溶葡萄球菌素基因，其具体的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。I. 2调控序列的扩增和表达载体构建利用牛β -酪蛋白基因的调控序列来调控重组的溶葡萄球菌素在牛乳腺上皮细胞中特异性的表达，具体在目的基因的5'端连接酪蛋白基因的调控序列，称为CSN5作为调控元件，其功能是使重组溶葡萄球菌素基因在乳腺中特异性表达；在目的基因3,连接酪蛋白基因的调控序列，称为CSN3作为调控元件，其功能是使重组溶葡萄球菌素基因能够在乳腺细胞中能够正常的終止转录及翻译。根据GenBank ID Μ55158. I公布的牛β -酪蛋白的基因序列，扩增该蛋白起始密码子之前的大约2. Skb的调控序列。上游添加Xho I酶切位点。引物如下CbN5F ctcgagtgag aaaagggaaa tgttgaatgg gCSN5R atgcctaatg ttatctcccc tttgtcc50μ L 的 PCR 反应体系为10 X PCR Buffer 5μ L, dNTPs (2. 5mmol/L) :4 μ L，上游引物(10ymol/L) :lyL，下游引物(10ymol/L) :1 μ L，LATaq 聚合酶(5U/ μ L) 0. 5μ L,iE常牛基因组I μ L,加超纯水至50 μしPCR 反应条件为94°C预变性 5min，94°C变性 30s，63°C退火 45s，72°C延伸 lmin，35个PCR循环，72°C再延伸7min。所扩增的CSN5的核苷酸序列具体如SEQ. ID. NO. 2所示。根据GenBank ID M55158. I公布的牛β -酪蛋白的基因序列，扩增该蛋白终止密码子620bp的V调控区，上游添加酶切位点BamH I，下有添加酶切位点Acc65I。引物如下CSN3F aatgattcca agtaagccga tgCSN3R ggtaccacgc gttccaattt taattttcca cagc50μ L 的 PCR 反应体系为10 X PCR Buffer 5μ L, dNTPs (2. 5mmol/L) :4 μ L，上游引物(10ymol/L) :lyL，下游引物(10ymol/L) :1 μ L，LATaq 聚合酶(5U/ μ L) 0. 5μ L,iE常牛基因组I μ L,加超纯水至50 μし
PCR 反应条件为94°C预变性 5min，94°C变性 30s，59°C退火 45s，72°C延伸 lmin，35个PCR循环，72°C再延伸7min。所扩增的CSN3的核苷酸序列具体如SEQ. ID. NO. 3所示。分别将PCR扩增的产物连接pMD20-T载体，酶切鉴定并测序得到正确的质粒，分别命名为 pCSN5、pCSN3。用BamH I和Acc65I分别双酶切pCSN5、pCSN3质粒，回收pCSN5的大片段和pCSN3的小片段，经T4DNA连接酶4°C连接过夜，重组子转化感受态细胞E. coli DH5 a，经BamH I和Acc65I酶切鉴定正确的重组子命名为pCSN53。再BamH I酶切质粒pCSN53和质粒plys，回收pCSN53和plys的小片段，T4DNA连接酶4°C连接过夜，重组子转化感受态细胞E. coli DH5 a，酶切鉴定正确的重组子并测序，命名为 pCSN531ys。 1.3attB位点和鸡P球蛋白绝缘子的克隆根据GenBank ID :X60952公布的attB的基因序列，以包含attB序列的载体作为扩增模板。所用引物如下attBS gtcgacgatg taggtcacgg ；attBA gtcgacatgc ccgccgt ；50 ii L 的 PCR 反应体系为5XPCR Buffer 10u L, dNTPs (2. 5mmol/L) 4u L,attBS (10 u mol/L) I u L, attBA (10 u mol/L) I u L, primestar 聚合酶(5U/ u L) :0. 5 y L,模板I U L,加超纯水至50 u L0PCR 反应条件为94°C预变性 5min，94°C变性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 lmin，31个PCR循环，72°C再延伸7min ；PCR反应后在体系中添加0. 5 ii L的rTaq聚合酶，72°C延伸30min，完成加A过程。加A后的PCR产物与pMD-20T Vector 4°C连接过夜，转化感受态细胞E. coliDH5ci，通过a-互补的蓝白斑筛选挑选重组子，经酶切鉴定阳性重组质粒pattB并送交上海生物工程技术服务有限公司测序。所扩增的attB的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。根据GenBank ID :U78775. 2公布的鸡P球蛋白绝缘子的基因序列，用重叠PCR的方法扩增两个带有不同酶切位点的含有两个重复的绝缘子元件，以保护目的基因和EGFP不受插入位点基因组附近沉默子的影响，目的基因和标记基因可以正常表达。在其上游引物和下游引物分别添加Spe I、Nde I和BamH I、EcoR I两组酶切位点。参见图3所示的绝缘子扩增流程，设计两组引物。第一组所用引物如下Insulor21S gacagaatca tagaacggcc gaaaagaagc aggctttcctInsulor21A catatgggcc gttctatgat tctgtcInsulor22S actagtgaaa agaagcaggc tttcctInsulor22A aggaaagcct gcttcttttc ggccgttcta tgattctgtc第二组所用引物如下twoInsulor21S gacagaatca tagaacggcc gaaaagaagc aggctttccttwoInsulor21A gaattcggcc gttctatgat tctgtc
twoInsulor22S ggatccgaaa agaagcaggc tttccttwoInsulor22A aggaaagcct gcttcttttc ggccgttcta tgattctgtc50μ L 的 PCR第一阶段反应体系为10XPCR Buffer 5μ L, dNTPs (2. 5mmol/L)4 μ L,上游引物(10 μ mol/L) S :1 μ L,下游引物(10 μ mol/L) A 1 μ L, primestar 聚合酶(5U/ μ L) :0. 5 μ L，鸡血基因组:1 μ L，加超纯水至50 μしPCR 反应条件为94°C预变性 5min，94°C变性 30s，63°C退火 30s，72°C延伸 lmin，31个PCR循环，72°C再延伸IOmin。第一阶段扩增得到的Insulor21、Insulor22 片段和 twoInsulor21、twoInsulor22片段；以Insulor21、Insulor22片段为模板，上下游引物分别为Insulor22S和Insulor21A,进行 plnsulator 序列的扩增；以 twoInsulor21 和 twoInsulor22 片段为模板，上下游引物分别为twoInsulor22S和t woInsulor21A,进行ptwolnsulator序列的扩增；反应体系及反应程序如下50μ L 的 PCR 反应体系为5XPCR Buffer :10 μ L，dNTPs (2. 5mmol/L) 4μ L, ±游引物(10 μ mol/L) :1 μ L,下游引物(10 μ mol/L) :1 μ L, primestar 聚合酶(5U/μ L)0. 5 μ L,模板I μ L,加超纯水至50 μしPCR 反应条件为94°C预变性 5min，94°C变性 30s，63°C退火 30s，72°C延伸 lmin，33个PCR循环，72°C再延伸lOmin。PCR反应后在体系中添加0. 5 μ L的rTaq聚合酶，72°C延伸30min，完成加A过程。加A 后的两组 PCR 产物(plnsulator、ptwolnsulator)与 pMD_20T Vector4°C连接过夜，转化感受态细胞E. coli DH5ci，通过α-互补的蓝白斑筛选挑选重组子，经酶切鉴定阳性重组质粒plnsulator和ptwolnsulator并送交上海生物工程技术服务有限公司测序。用Spe I和Nde I双酶切plnsulator、pattB质粒，回收pattB的大片段和plnsulator的小片段，经T4DNA连接酶4°C连接过夜，重组子转化感受态细胞E. coliDH5a,经Spe I和Nde I酶切鉴定正确的重组子命名为pattBInsulatorl。再BamH I和EcoRI 酶切质粒 ptwolnsulator 和 pattBInsulatorl,回收 pattBInsulatorl 和 ptwolnsulator的小片段，T4DNA连接酶4°C连接过夜，重组子转化感受态细胞E. coli DH5 α，酶切鉴定正确的重组子并测序，命名为pattBInsulatorl2。其中所扩增的两个重复的鸡β球蛋白绝缘子Insulator 12的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示。I. 4抗生素筛选基因及Ioxp序列的克隆根据载体pEGFP-Cl的序列设计引物扩增包含抗生素筛选基因neo的第1642bp到8bp的序列，在上游引物前加上34bp的Ioxp序列和酶切位点Ase I，在下游引物前加上34bp的Ioxp序列和酶切位点Mlu I。扩增产物的两处Ioxp序列方向一致。Loxp序列为tattgaagca tattacatac gatatgcttc aata。引物设计如下neoloxp21S acgcgttatt gaagcatatt acatacgata tgcttcaata aaattgtaagcgttaatattttgttaaaat tcg ；neoloxp21A attaattatt gaagcatatc gtatgtaata tgcttcaata aactaatgcatggcggtaatacgg ；
50ii L 的 PCR 反应体系为5XPCR Buffer :10 y L，dNTPs (2. 5mmol/L) :4 y L，neoloxp21S (10 u mol/L) I u L, neoloxp21A (10 u mol/L) I u L, primestar 聚合酶(5U/U L) 0. 5 u L,模板I u L,加超纯水至50 u L。PCR反应后在体系中添加0. 5 ii L的rTaq聚合酶，72°C延伸30min，完成加A过程。加A后的PCR产物与pMD-20T Vector 4°C连接过夜，转化感受态细胞E. coliDH5a，通过a -互补的蓝白斑筛选挑选重组子，经酶切鉴定阳性重组质粒pneoloxp3100并送交上海生物工程技术服务有限公司测序。用Ase I 和 Mlu I 双酶切 pEGFP-Cl、pneoloxp3100 质粒，回收 pEGFP-Cl 的大片段和pneoloxp3100的大片段，经T4DNA连接酶4°C连接过夜，重组子转化感受态细胞E.coli DH5a，经Spe I和Nde I酶切鉴定正确的重组子命名为pEGFP-Clloxp。将质粒pEGFP-Clloxp转化JMllO感受态细胞中，重新提取质粒。
再用BspE I和Xba I酶切质粒pEGFP-Clloxp，回收大片段，用Klenow酶补平粘性末端，用solution I进行自连，4°C连接过夜，成环后转化感受态细胞E. coli DH5 a，酶切鉴定正确并测序，命名为pEGFPloxp-plus。以引物的形式合成含有用Spe I、EcoR I、Xho I 3个酶切位点的多克隆位点，两端是Mlu I的粘性末端，Spe I—侧紧挨粘性末端的第一个碱基由T变成A，具体序列如下，MCS2F cgcgactagtgaattcctcgagaMC S2R :cgcgtctcgaggaattcactagt用Mlu I单酶切质粒pEGFPloxp-plus，回收片段，经T4DNA连接酶将合成的多克隆位点与酶切回收产物4°C连接过夜，重组子转化感受态细胞E. coli DH5a，经Mlu I酶切鉴定正确的重组子，命名为pEGFP-ClM.用Spe I 和 EcoR I 酶切 pEGFP-ClM 和 pattBInsulorl2，回收 pEGFP-ClM 的片段和pattBInsulorl2的小片段，经T4DNA连接酶4°C连接过夜，重组子转化感受态细胞E. coliDH5 a，酶切鉴定正确并测序，命名为pEGFP-ClMA。用Xho I 和 Mlu I 酶切 pEGFP-ClMA 和 pCSN531ys，回收 pEGFP-ClMA 片段和pCSN531ys的大片段，经T4DNA连接酶4°C连接过夜，重组子转化感受态细胞E. coli DH5 a，酶切鉴定正确并测序，命名为pEGFP-ClMAB。对于pEGFP-ClMAB载体首先用EcoRl 1091单酶切鉴定，检测结果如图4所示，可以看到一条约IOOOObp的目标条带,条带大小与原载体大小一致,说明质粒没有问题。然后再用Mlu I和Xho I双酶切鉴定，检测结果如图5所示，可以看到两条目标条带，表明质粒没有问题，符合原质粒的大小特点。用Promega公司的去内毒素的质粒纯化试剂盒提取质粒后用核酸蛋白测定仪测定质粒的浓度和纯度，经测定，质粒的浓度为600ng/iil，0D260/280为I. 90，说明质粒较
纯，可用于转染。2、pEGFP-ClMAB表达载体转染牛胎儿成纤维细胞并筛选核供体细胞系2. I、牛胎儿成纤维细胞的培养从液氮中取一管荷斯坦奶牛的牛胎儿成纤维细胞(< 3代)于38°C解冻，加0.8ml的DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle Media)细胞培养液离心，弃上清，加细胞培养液(DMEM细胞培养液加10%胎牛血清)重悬，取3ml细胞悬浮液接种于直径6cm的培养皿中，置于CO2培养箱中38. 5°C条件下培养。待牛胎儿成纤维细胞达到80%汇合吋，吸弃培养液，用无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗细胞，加入胰酶与EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，悬浮，按I : 3的比例接种于24孔板，放入CO2培养箱中培养。以G418作为筛选药物，由于表达载体pEGFP-CIMAB的骨架上有G418抗性基因neor,外源基因nec/得到表达，使得牛胎儿成纤维细胞能够在含有一定浓度G418的培养液中存活下来，而未转染的正常细胞会在该浓度下死亡，因此需要确定正常细胞G418的最小致死浓度来作为筛选浓度。
G418最小致死浓度的测定在牛胎儿成纤维细胞培养液中分别加入浓度梯度的G418筛选I周，測定正常细胞的G418最小致死浓度。当细胞培养液中G418的浓度彡600 μ g/ml时，在显微镜下可见细胞全部死亡，所以G418的最小致死浓度为600μ g/ml。2. 2、pEGFP-CIMAB表达载体转染牛胎儿成纤维细胞本发明具体采用FuGen HD(Roche)转染试剂在有血清存在的条件下，共转染pEGFP-ClMAB和OC31整合酶的表达载体pCMVINT与牛胎儿成纤维细胞。用FuGen HD转染试剂进行基因转移与其它方法相比，操作简便、重复性好、不受DNA大小限制、无组织特异性和免疫原性,不需要血清饥饿,对细胞损伤小。具体操作如下接种前一天，将第2代牛胎儿成纤维细胞接种于6孔板中，培养过夜使细胞达到70-80%汇合。对于每孔细胞，分别将2 μ g pEGFP-CIMAB表达载体和2 μ g的OC31整合酶的表达载体pCMVINT与8 μ I的FuGen HD转染试剂加入到Opti-MEM培养液中，终体积为200 μ 1，室温孵育15min后，缓慢将其加入到含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液中，24h后转换为含血清的正常DMEM细胞培养液继续培养。2. 3、pEGFP-CIMAB载体阳性细胞筛选在不含转染试剂的培养液(含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液)培养转染细胞24小时之后，在荧光显微镜下观察报告基因EGFP的表达情況，并在含10%血清的DMEM细胞培养液中添加600 μ g/ml G418筛选阳性细胞；以未转染的牛胎儿成纤维细胞为阴性对照，其细胞培养液加有同样浓度的G418(600l·! g/ml)。在荧光显微镜下观察报告基因EGFP的表达情況，结果如图6所示，在荧光显微镜下可以看到转基因的牛胎儿成纤维细胞发出绿色荧光，说明pEGFP-ClMAB已经进入细胞并且阳性表达；pEGFP-ClMAB转染细胞7d后，对照组的细胞全部死亡，将包含pEGFP-ClMAB转染阳性的细胞组的G418浓度减半持续筛选直到细胞长满皿底，可见到阳性细胞形成岛屿状细胞群，在荧光显微镜下仍然可以看到绿色荧光；然后消化细胞用不加G418的正常培养液扩大培养。所筛选的阳性细胞都是稳定转染pEGFP-ClMAB的细胞，目的基因整合到细胞的基因组上，而不是游离于基因组之外；在稳定转染的过程中，在Φ031位点特异性整合酶的介导下，质粒pEGFP-ClMAB上携帯的基因会整合到宿主细胞的基因组特定的假attP位置上；通过G418筛选7天再半剂量持续筛选来达到稳定转染的目的，表现为报告基因在被转染的阳性细胞内持续表达，因此筛选的阳性细胞持续发出绿色荧光并呈现G418抗性。2. 4、pEGFP-CIMAB载体阳性细胞的PCR鉴定
取传到第八代的pEGFP-ClMAB阳性表达的牛胎儿成纤维细胞，提取细胞基因组DNA,以基因组DNA为模板，PCR鉴定重组溶葡萄球菌素基因是否整合到细胞基因组中，阴性对照为未转染的正常牛胎儿成纤维细胞，PCR鉴定所用引物对为Pl和P2 ；Platgaagtgcc tcctgcttgc ccP2 tcactttata gttccccaaa gaacaccPCR 反应条件为94°C预变性 5min，94°C变性 30s，63°C退火 30s，72°C延伸 lmin，30个PCR循环，72°C再延伸7min ;回收PCR产物进行0. 8 %琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图7所示，其中，泳道M为DNAMarker,泳道2为未转染的牛胎儿成纤维细胞,泳道I为pEGFP-ClMAB转染的牛胎儿成纤维细胞，泳道I与2相比，明显可以看到一条约800bp左右的条带，目的基因为789bp。而作为阴性 对照的泳道I并没有看到，说明目的基因整合到了宿主细胞牛胎儿成纤维细胞的基因组。重组溶葡萄球菌素基因整合到了宿主细胞牛胎儿成纤维细胞的基因组，与之相连的牛P酪蛋白基因的5'调控区和3'调控区与目的基因也会一起整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。2. 5、pEGFP-ClMAB载体阳性细胞整合位点的检测用BamH I酶切pEGFP-ClMAB载体阳性细胞基因组，12小时后回收酶切产物并用50 ii L水洗脱液洗脱，加入50 ii L solution I配成100 y L的连接体系，过夜连接，直接以连接产物为模板进行方向PCR.引物如下P2Scgatgtaggt cacggtctcg aag ；P2A cgcagtcaat tctgtggaat aggg ；50 ii L 的 PCR 反应体系为10XPCR Buffer 5u L, dNTPs (2. 5mmol/L) :4yL，反IS (10 u mol/L) : I ii L，反 IA (10 ii mol/L) 1 u L, LA Taq 聚合酶(5U/ u L) :0. 5 y L，模板Iu L，加超纯水至50 u L0PCR 反应条件为94°C预变性 5min，94°C变性 30s，60°C退火 45s，72°C延伸 lmin，38个PCR循环，72°C再延伸7min ;回收PCR产物，以PCR产物为模板进行同样程序的PCR反应，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图8所示，其中，泳道M为TranslOObpMarker,泳道I为未转染的母牛基因组，泳道2为pEGFP-ClMAB转染的牛胎儿成纤维细胞基因组，泳道2与I相比，明显可以看到一条约500bp左右的条带。而作为阴性对照的泳道I并没有看到。说明阳性细胞基因组与反向引物结合，扩增出PCR产物，同时说明目的基因的插入按照0C31整合酶的插入原理进行定点整合的。将第二次PCR产物送交上海生物工程技术服务有限公司测序，测序结果与NCBI中牛的基因组进行比对，比对结果如图9所示，结果显示目的基因插入到牛的9号染色体中。2. 6、pEGFP-ClMAB 载体阳性细胞的 Southern blotting 检测以阳性细胞基因组DNA JjjSouthern blotting检测目的基因是否完全整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组中。所用的探针序列Tl和T2如下Tltggtcaaata atcggttggt ctgT2 ccaaacatga ccgtcttgtt teaSouthern blotting的实验操作按照Roche公司提供的实验方案完成,用限制性内切酶HindIII过夜酶切阳性细胞基因组，检测结果如图10所示，表示目的基因已经插入到了基因组中。3、以上述基因组整合了重组溶葡萄球菌素基因的牛胎儿成纤维细胞作为核供体细胞，构建转基因克隆胚胎。3. I、卵母细胞的体外成熟培养卵巢采自西安市牛屠宰场，无菌采取荷斯坦奶牛卵巣，2-3小时内运回实验室，抽取3 8mm直径的卵泡，收集卵母细胞卵丘复合体，实体显微镜下挑选具有完整的三层以上卵丘细胞，胞质均匀的卵母细胞用于成熟培养。卵母细胞的成熟培养液为TCM199 (Gibaco)加10%胎牛血清，10ng/ml的表皮生长因子，培养条件为38. 5°C，5% C02、95%空气的气体环境，饱和湿度；成熟培养20h后用O. 2%透明质酸酶去除卵丘细胞，以第一极体排放作为卵母细胞成熟的判定标准，挑选成熟卵母 细胞用于核移植试验。3. 2转基因克隆胚的构建本发明采用体细胞核移植(SCNT)技术将供体核转移到去除细胞核的成熟卵母细胞中，其中，整合有外源基因的供体细胞控制到10代以内，这主要考虑减少体外培养导致的突变在培养过程中的积累。核移植具体为显微操作液为含10% FBS, 5 μ g/ml细胞松弛素B的PBS，用内径20 μ m的去核管在显微操作仪上吸出第一极体及部分胞质，以10 μ g/mlHoechst 33342染色lOmin，在荧光显微镜下挑出完全去核的卵母细胞；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。卵母细胞的注核与融合，具体过程如下0. 25%胰蛋白酶消化接触抑制3d的6 10代的转染PBELS的荷斯坦牛胎儿成纤维细胞用作供核细胞。用去核管将供体细胞注入去核成功的卵母细胞透明带下。核质复合体在电融合液中平衡3min，用微电极法进行融合，用与显微操作仪连接的微电极尖部排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，用微电极尖轻轻压住重组体，给予电脉冲进行电融合。融合电压为28V，融合时间为10 μ m。融合后的重组体放入10% FBS的M199中，38. 5°C>5% CO2、饱合湿度下培养，2h后观察融合情況。3. 3、转基因克隆胚的激活及体外培养融合的重组胚(细胞-卵胞质重组体)在含10% FBS的M199中平衡2h后，用含5 μ mol/L离子霉素(Ionomycin，购自SIGMA公司)的mSOFaa培养液(购自SIGMA公司)处理5min，然后在含2mmol/L ニ甲基氨基嘌呤(6-DMAP)的mSOFaa培养液内培养5h，洗3次后转移到mSOF aa微滴中培养，培养密度为5yL每个重组胚，在38. 5°C、5% CO2、饱和湿度下培养，每48h半量换液I次，第7 9天检查囊胚发育情况，如图11所示，克隆胚正常发育至囊胚。3. 4、转基因克隆胚PCR鉴定目的基因重组胚胎基因组DNA的提取将重组胚胎样品放入100μ I灭菌的离心管中，加入
20μ I灭菌双蒸水，煮沸5m in后稍离心，置于-20°C保存或直接用于PCR。以提取的重组克隆胚的基因组为模板，PCR鉴定重组溶葡萄球菌素基因，PCR反应反应体系和过程同步骤2. 4。以未转基因的克隆胚为阴性对照。PCR扩增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳，获得了大小为SOObp左右的扩增带，与预期大小相符，如图12所示，其中，泳道M为IOObp DNALadder,泳道I为未转基因的克隆胚，泳道2为重组克隆胚，泳道2与I相比，明显可以看到一条789bp左右的条带。说明目的基因lysostaphin整合到胚胎基因组中。4、转基因克隆胚的胚胎移植和妊娠鉴定第7天的囊胚用非手术法移入自然发情后第七天的荷斯坦受体牛子宫内，每个受体牛移植2枚囊胚。受体牛移植后观察其返情情况，对未返情的在移植后60d用B超做怀孕检查。以后每隔一月检查一次，以观察妊娠维持情况。本发明共移植转重组溶葡萄球菌素基因克隆胚胎到100头同期发情的受体奶牛体内，两个月后有48头建立妊娠， 3个月后有30头维持妊娠并将继续被监测。
权利要求
1.一种重组溶葡萄球菌素基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。
2.如权利要求I所述的重组溶葡萄球菌素基因，其特征在于，在其5'端连接如SEQ.ID. NO. 2所示的CSN5调控元件，在其3'端连接如SEQ. ID. NO. 3所示的CSN3调控元件。
3.如权利要求2所述的重组溶葡萄球菌素基因，其特征在于，在CSN5调控元件的5'端还连接有如SEQ. ID. NO. 4所示的att B序列,在att B序列的上下游还分别设有绝缘子序列。
4.如权利要求3所述的重组溶葡萄球菌素基因，其特征在于，所述的绝缘子序列为如SEQ. ID. NO. 5所示的鸡β -乳球蛋白绝缘子序列。
5.如权利要求I 4任何一项所述的重组溶葡萄球菌素基因，其特征在于，在重组溶葡萄球菌素基因的在上游还连接有荧光标记基因，下游还连接有抗生素筛选基因。
6.如权利要求5所述的重组溶葡萄球菌素基因，其特征在于，所述的荧光标记基因与重组溶葡萄球菌素基因之间设有終止子或绝缘子序列，在抗生素筛选基因的上下游连接有Ioxp序列。
7.—种重组溶葡萄球菌素基因的乳腺特异性表达载体，其特征在干，包括SEQ.ID. NO. I所示的重组溶葡萄球菌素基因，其5'端连接如SEQ. ID. NO. 2所示的CSN5调控元件，在其3!端连接如SEQ. ID. NO. 3所示的CSN3调控元件； CSN5调控元件的5'端还依次设有突光标记基因及启动子,在CSN3调控元件与启动子之间设有抗生素筛选基因。
8.如权利要求7所述的ー种重组溶葡萄球菌素基因的乳腺特异性表达载体，其特征在于，在荧光标记基因与CSN5调控元件之间还设有att B序列，在att B序列的上下游还分别设有绝缘子序列；在抗生素筛选基因的上下游连接有Ioxp序列。
9.基于权利要求8所述的重组溶葡萄球菌素的乳腺特异性表达载体构建的重组细胞，其特征在于，以荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将线性化的重组溶葡萄球菌素的乳腺特异性表达载体与Φ031整合酶的表达载体共转染到宿主细胞中。
10.权利要求8所述的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。
全文摘要
本发明公开了一种重组溶葡萄球菌素位点特异性整合载体及其构建的重组细胞，重组溶葡萄球菌素基因由牛生长激素信号肽加上突变的溶葡萄球菌素成熟肽组成，在他的5′端和3′端加入酪蛋白基因的调控序列，在酪蛋白5′端和EGFP的终止密码子后各添加一个鸡β乳球蛋白的绝缘子元件。用整合了目的基因的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过SCNT获得转基因克隆胚胎。通过胚胎移植技术将发育正常的转基因克隆胚胎，有望生产出转重组溶葡萄球菌素基因的抗乳房炎的高产奶牛。
文档编号C12N15/57GK102676559SQ20111039090
公开日2012年9月19日 申请日期2011年11月30日 优先权日2011年11月30日
发明者上官陶, 张勃伟, 张涌, 权富生, 黄欣 申请人:杨凌科元克隆股份有限公司, 西北农林科技大学