专利名称：产肠毒素金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株及其构建的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术，具体的说是一种产肠毒素金黄色葡萄球菌or溶血毒素缺失菌株及其构建。
技术背景基因敲除技术是自80年代末发展起来的一种分子生物学技术，它是一 种通过一定的途径使特定的基因定向失活或缺失的技术。随着分子生物 学的发展和后基因组时代的到来，这项技术得到了前所未有的发展。利 用基因敲除技术，人们不但可以对特定的基因进行定向的改造，而且可 以通过该技术来了解未知基因的结构及功能。正因为基因敲除技术的这 些优越性，近年来这项技术在微生物基因工程菌的构建方面得到了广泛 的应用。金黄色葡萄球菌溶血毒素是由金黄色葡萄球菌在生长过程中产生的 一种外毒素，由a、 (3、 Y、 S四种亚型溶血毒素组成。由于a-溶血毒素能 对人和哺乳动物红细胞产生较强的溶血性，因此在临床上被认为是金黄 色葡萄球菌致病的主要因素之一。用于医药工业上以金黄色葡萄球菌发 酵生产含有效成份肠毒素的抗肿瘤药物中含有ct-溶血毒素，因此在临床 应用中对人体产生了较强的毒副作用，限制了其医用价值。因此，寻找 一种合适的技术方法来构建产肠毒素金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺陷 菌株，无疑对提高含肠毒素抗肿瘤药物的医药价值具有重要的意义。 发明内容本发明的目的是提供一种产肠毒素金黄色葡萄球菌cx-溶血毒素缺 失菌株及其构建。本发明根据同源重组的原理，利用基因敲除技术构建 相应的基因敲除载体，转化产肠毒素金黄色葡萄球菌，经过筛选验证最 终得到了产肠毒素金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株。通过该方法获 得的a-溶血毒素缺失型基因工程菌最终不产生a-溶血毒素，但不影响肠 毒素的生产。本发明的第二个目的是提供一种构建上述金黄色葡萄球菌a-溶血毒 素缺失菌株的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为； 一种产肠毒素金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株，是通过同源重组的方法将产肠毒素的野生型菌株的a-溶血毒素基因缺失后得到的基因工程菌。所述产肠毒素的野生型菌株为金黄色葡萄球菌，菌种保藏号为CGMCC0165，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。 缺失菌株可按如下步骤制备1) 利用PCR技术扩增得到a-溶血毒素基因上游同源序列Hla-u和下游 同源序列Hla-d，以及替换基因Neor;并将Hla-u、 Hla-d、 Neor连接得到 基因敲除片段Hu-Neor-Hd;2) 将Hu-Neor-Hd片段克隆入载体pMAD，经PCR扩增和酶切验证得 到基因敲除t;体pMHL-a，然后将pMHL-a载体转化进金黄色葡萄球菌 RN4220进行基因修饰；3) 将基因修饰过的基因敲除载体pMHL-a通过原生质体转化导入产 肠毒素野生型金黄色葡萄球菌CGMCC0165细胞内，通过培养，筛选得到 产肠毒素金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株。一种产肠毒素金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株的构建方法，可按 如下步骤操作(1)根据Genbank已公开的金黄色葡萄球菌a-溶血毒素基因序列，设 计两对引物，分别为Hla-uF 5'CGCGGATCCATCGATTACATTT3'， Hla-uR5，CGGAATTCTGAGCTGACTATACGTG3， ； Hla隱dF5，CTACTCGA GGTATATGGCAATCAAC3, ，Hla-dR5 ， CGCGGATCCCCTCTATAGTGTC ATG3，；以产肠毒素的野生型菌株基因组DNA为模板，用引物Hla-uF， Hla-uR进行PCR扩增得到与or溶血毒素基因上游序列同源的基因片段 Hla-u;用引物Hla-dF， Hla-dR进行PCR扩增得到与a-溶血毒素基因下游 序列同源的基因片段Hla-d;(2) 根据Genbank中公开的已知新霉素抗性基因序列，设计一对引 物上游引物为5，GGCGGAATTCATGATTGAACAAGATG3',下游引物 为5，ATAGCTCGAGATCTCAGAAGAACTCGTCA 3 ，；以载体pcDNA3.1 为模板，PCR扩增得到新霉素抗性基因Neor;(3) 基因敲除载体pMHL的构建将以上步骤(1)和(2)中扩增 得到的基因片段Hla-u、 Neor、 Hla-d进行酶切后连接，得到基因敲除片 段Hu-Neor-Hd，然后将此连接片段克隆入载体pMAD、转化，经质粒抽 提、PCR扩增及酶切鉴定，构建得到基因敲除载体pMHL-oi;(4) 基因敲除载体pMHL-a的基因修饰将载体pMHL-a通过电转 化导入金黄色葡萄球菌缺陷菌株，经过培养抽提质粒，PC財广增及酶切鉴 定，获得经过基因修饰过的敲除载体pMHL-a;(5)载体pMHL-a介导的基因敲除载体pMHL-a通过原生质体转 化的方法导入产肠毒素的野生型菌株内，构建得到产肠毒素金黄色葡萄 球菌a-溶血毒素缺失菌株。步骤(1)和(5)中用于产肠毒素野生型菌株为金黄色葡萄球菌，菌 种保藏号CGMCC0165，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心； 步骤(4)中用于基因修饰的菌株为金黄色葡萄球菌RN4220，菌种保藏号 ATCC 35556，保藏于美国典型菌种保藏中心，其可以接受任何外源DNA。本发明具有以下优点1. 本发明构建获得了产肠毒素金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌 株。利用该菌株生产得到的含肠毒素抗肿瘤药物中不含有or溶血毒素， 大大减小了肿瘤治疗中对人体引起的副作用。2. 本发明首次利用基因敲除技术对产肠毒素野生型金黄色葡萄球 菌CGMCC0165的a-溶血毒素基因进行了定向敲除，建立了一种比较成熟 可行的产肠毒素金黄色葡萄球菌(x-溶血毒素缺失菌株的构建方法。3. 本发明利用原生质体转化法用于野生型金黄色葡萄球菌外源DNA的转化，避免了实验室惯用的噬菌体转导法，防止了构建的基因工程菌 在生产中所导致的噬菌体污染，因此有很强的实用价值，用此种转化法 构建金黄色葡萄球菌基因工程菌目前在国内外尚未见报道。此方法可用 于其他金黄色葡萄球菌的基因工程菌的构建。
图l为HLa-u、 Hla-d、 Neor、及基因敲除片断Hu-Neor-Hd的PCR扩增 琼脂糖凝胶电泳图，其中1为DL2000 DNA分子量标准，2-5分别为 Hla-d、 HLa-u、 Neor、 Hu-Neor-Hd基因片段扩增产物，6为200bpDNA分子量标准。图2为基因敲除载体pMHL-a的酶切及Hu-Neor-Hd的PCR扩增琼脂糖凝 胶电泳图谱，其中l为5i-历"W7/digest分子量标准，2为pMHL-a的5aw// /酶切产物，3为Hu-Neor-Hd的PCR扩增产物，4为200bpDNA分子量标准图3为扩增SEC2基因得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析结果，其 中1为DL2000 DNA分子量标准，2为以金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺 失菌株基因组DNA为模板扩增肠毒素SEC2基因得到的PCR产物，3为以 突变前金黄色葡萄球菌CGMCC0165基因组DNA为模板扩增得到的肠毒素 SEC2基因产物。从图中可以看到对a-溶血毒素基因进行敲除前后肠毒 素基因没发生任何变化。图4为以野生菌株CGMCC0165和筛选获得的a-HL基因缺失菌株的基因 组DNA为模板，以引物Hla-uF和Hla-dRffl行PCR扩增得到的产物经琼脂糖凝胶电泳分析结果。其中M为DL2000DNA分子量标准，1,2为以金 黄色葡萄球菌CGMCC0165基因组DNA为模板扩增得到的PCR产物，3,4为 以金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株基因组DNA为模板扩增得到的 产物。从图中可以看到以金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株扩增得到 1686bp的PCR产物，而以金黄色葡萄球菌CGMCC0165基因组DNA为模板扩 增得到约1497bp长的产物。证明金黄色葡萄球菌CGMCC0165中的or溶血 毒素基因已经被Neor基因成功替换，金黄色葡萄球菌or溶血毒素缺失菌 株构建成功。图5为产肠毒素金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株溶血性分析。如 图所示l号为产肠毒素金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株在含有兔血 红细胞的培养基平板中生长经过2-4天的观察没有产生明显的溶血圈， 而2号产肠毒素野生型金黄色葡萄球菌CGMCC0165却产生了明显的溶血现象，并随着培养时间的增长溶血圈逐渐增大。说明本发明所提供的产 肠毒素金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株的构建方法是非常可行的， 通过此方法获得了产肠毒素金黄色葡萄球菌(x-溶血毒素缺失菌株，对今 后含肠毒素抗肿瘤药物的临床应用具有重要的意义，大大减小了在肿瘤 治疗中产生的毒副作用。
具体实施方式
实施例一、金黄色葡萄球菌a-溶血毒素基因上游同源序列Hla-u及下游同源 序列Hla-d的PCR扩增1) 金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取接种金黄色葡萄球菌单菌落于10ml液体LB培养基中，37'C摇床过夜 培养，取2ml的培养物离心收集菌体。提取金黄色葡萄球菌基因组DNA(基 因组DNA提取操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔， J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》 美国纽约John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)。金黄色葡萄球菌，菌种保藏号CGMCC0165，现保藏于中国普通微生 物菌种保藏管理中心；2) PCR引物设计及反应条件分别设计合成引物扩增or溶血毒素基因上游同源序列Hla-u及下游 同源序列Hla-d，引物序列如专利要求中所示PCR反应体系为10 xpfobuffer 5^1、 dNTP250pmo1、上下游引物各 20pmo1、金黄色葡萄球菌CGMCC0165基因组DNA0.1ug、 pfUDNA聚合酶 2U，无菌超纯水补齐体积至50ul。PCR反应条件为第一阶段95°C， 5分钟；第二阶段94。C，45s; 45。C,45s; 72。C，lmin; 5 cycles; 第三阶段94。C，45s; 55。C,45s; 72°C, lmin; 25 cycles; 第四阶段72°C， IO分钟；3) PCR产物的回收PCR扩增产物经L2。/。琼脂糖凝胶电泳分析并分 离(附图l)，分别切下大小为354bp和500bp大小的目的带，按宝生物工 程(大连)有限公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收； 二、新霉素抗性基因Neor及基因敲除片段的连接1) 新霉素抗性基因Neor的PCR扩增上游引物为5 ， GGCGGAATTCATGATTGAACAAGATG3 ，， 下游引物为5 ，ATAGCTCGAGATCTCAGAAGAACTCGTCA 3,横线所示为添加的酶切位点，上下游分别为^oi /和^0/。PCR反应体系为10 x PfU buffer 5^1、 dNTP 250pmol、上下游引物 各20pmol、含Neor基因的pcDNA3. 1质粒DNA模板0.1|ig、 Pfii DNA聚合酶2U，无菌超纯水补齐体积至50pl。 PCR反应条件为 第一阶段95°C， 5分钟；第二阶段94。C，45s; 50。C,45s; 72°C, 90s; 5 cycles; 第三阶段94。C，45s; 60。C，45s; 72°C, 90s; 25 cycles; 第四阶段72°C， IO分钟；2) PCR产物的回收PCR扩增产物经1.2。/。琼脂糖凝胶电泳分析并分 离(如图l所示)，切下大小为798bp大小的目的带，按宝生物工程(大 连)有限公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收；3) 基因敲除片段的连接将基因片段Hla-u、 Neor、 Hla-d分别用限制性内切酶fe/nZ/i"、 /、 ^;o/进行切割，酶切产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析并分离(附图 1)，分别切下三条目的带Hla-u、 Neor及Hla-d，按宝生物工程(大连) 有限公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收。将切胶回收得到的产物 进行连接，得到连接产物Hu-Neor-Hd:连接反应体系为10xT4 DNA ligase buffer 2.5ul、 Hla-u片段4ul、 Hla-d片段4ul、 Neor片段4ul、 T4 DNA ligase lul、 dH20补齐体积至25ul。连接反应条件为16°C， 12小时；4) 基因敲除片段的PCR扩增上游弓I物为5 ，CGCGGATCCATCGATTACATTT3'8下游引物为5 ，CGCGGATCCCCTCTATAGTGTCATG3 ， PCR反应体系为10 x Pfb buffer 5^1、 dNTP 25(Himo1、上下游引物 各20pmol、连接产物Hu-Neor-Hd 5ul、 Pfb DNA聚合酶2U，无菌超纯 水补齐体积至50W。 PCR反应条件为 第一阶段95°C， 5分钟；第二阶段94。C,45s; 50。C，45s; 72°C, 3min; 30 cycles; 第三阶段72°C， IO分钟； 三、a-溶血毒素基因敲除载体的构建 对基因敲除片断Hu-Neor-Hd用限制性内切酶5amH /进行酶切，胶 回收试剂盒回收相应的酶切产物。以T4 DNA连接酶将Hu-Neor-Hd酶切 产物连接入经同样酶切的穿梭载体pMAD。转化大肠杆菌￡.^//2^001感 受态细胞，经酶切验证和PCR扩增得到正确的基因敲除载体pMHL-a(如 图2所示)。四、产肠毒素金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺陷型基因工程菌的构建1) 基因敲除载体pMHL-a在金黄色葡萄球菌RN4220中的基因修饰 将构建获得的基因敲除载体pMHL-a经过电转化导入金黄色葡萄球菌RN4220 (其为金黄色葡萄球菌缺陷菌株，菌种保藏号ATCC 35556， 保藏于美国典型菌种保藏中心，其可以接受任何外源DNA)，在含有红霉 素(10吗/ml)的TSA培养基平板上培养挑单克隆，提取质粒经PCR扩增和 酶切验证，筛选获得经过金黄色葡萄球菌RN4220修饰过的正确的基因 敲除载体pMHL-a (如图3所示)。2) 产肠毒素金黄色葡萄球菌or溶血毒素缺陷型基因工程菌的构建 被修饰过的基因敲除载体pMHL-a经过原生质体转化的方法导入产肠毒素野生型金黄色葡萄球菌CGMCC0165 (原生质体的制备操作按 Novick RP." Genetic systems in s鄉/^/ococc/". Me//w<is /" e^ymo/ogy. 1991 ;204:587)。原生体转化实验为取0.25ml的pMHL-a质粒DNA与等体积的 2xSMM溶液混合并加入0.5ml的原生质体，然后立即加入1.5ml 40%的 PEG6000，轻轻翻转混合。2min后，加入5ml SMMP培养基，1900g ， 10min离心收集菌体。32。C振荡培养2小时，然后涂布含有红霉素(10吗/ml) 的DM3 agr平板于32t:倒置培养2-3天。挑取长出的单克隆接种于50ml TSB培养基，3CTC振荡培养2小时后，于43t:振荡培养6小时。稀释涂含 有新霉素(l(Hig/ml)的TSA培养基，于42'C倒置培养过夜，长出的单菌落 即为a-溶血毒素缺陷型基因工程菌株。实施例2产肠毒素金黄色葡萄球菌or溶血毒素缺失菌株的分子鉴定、溶血性 实验及肠毒素SEC2基因检测 1)分子鉴定实验由于a-HL基因编码区的大部分(621bp)已经被Neo抗性基因(795bp) 所替换，所以用金黄色葡萄球菌ct-HL基因的上游PCR弓I物的Hla-uF和下 游PCR引物的Hla-dR为扩增引物，分别以野生菌株CGMCC0165和筛选获得 的a-HL基因缺失菌株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，验证敲除前 后PCR产物大小是否发生变化。(如图3所示)PCR反应体系为10 xPfo buffer 2.5^1、 dNTP150nmo1、上下游引物 各10pmo1、金黄色葡萄球菌CGMCC0165基因组DNA或a-HL基因缺失菌株 基因组DNA模板50ng、 PfU DNA聚合酶1U，无菌超纯水补齐体积至25pl。 PCR反应条件为 第一阶段95°C， 5分钟；第二阶段94。C,45s; 45。C,45s; 72。C,2min; 5 cycles; 第三阶段94。C,45s; 55。C，45s; 72。C，2min; 25 cycles; 第四阶段72°C, lOmin; PCR产物经1.2。/。的琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示分别以野生菌 株CGMCC0165和初筛获得的a-HL基因缺失菌株的基因组DNA为模板，扩 增得到的PCR产物大小分别为1497bp和1686bp，与a-HL基因敲除前后 的理论值相符，说明a-溶血毒素基因已经成功地被Neor基因替换，证明 金黄色葡萄球菌a-HL基因缺失菌株构建成功。(如图4所示) 2)溶血性实验挑取候选的a-溶血毒素缺失菌株划线培养于兔血琼脂培养基平板 (含5%的脱纤维兔血)，同时划线培养未进行基因敲除前的产肠毒素金 黄色葡萄球菌CGMCC0165作为对照实验。于37'C培养16小时以上进行溶 血性观察。实验结果显示金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株菌落周围 无明显的溶血圈产生，而野生型金黄色葡萄球菌CGMCC0165菌落周围有 明显溶血圈产生，说明金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株构建成功， 其or溶血毒素基因已被成功敲除(如图5所示)。此缺失菌株的获得，将 解决以往由于产肠毒素金黄色葡萄球菌野生菌发酵滤液中存在a-溶血 毒素所带来的临床副作用。由于产肠毒素金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺 失菌发酵液中已经不产生a-溶血毒素，因此避免了a-溶血毒素所带了的 对人体的毒副作用，从而大大增强了金黄色葡萄球菌超抗原药物在抗肿 瘤临床应用中的价值。3)肠毒素C2(SEC2)基因的PCR扩增检测根据GeneBank提供的金黄色葡萄球菌SEC2序列，设计一对引 物，如下上游引物为5'-GAA TTC GAG AGT CAA CCA GAC CCT A-3， 下游引物为5，-CTC GAG TTA TCC ATT CTT TGT TGT A-3' 分别以野生型菌株CGMCC0165和a-HL基因缺失菌株基因组DNA为 模板，对金黄色葡萄球菌SEC2基因进行PCR扩增，检测a-溶血毒素 基因敲除前后SEC2基因有无变化。PCR反应体系为10 x pftj buffer 2.5|il、 dNTP150pmo1、上下游引 物各lOpmol、金黄色葡萄球菌基因组DNA或a-HL基因缺失菌株基因 组DNA模板50ng、 PfUDNA聚合酶lU，无菌超纯水补齐体积至25(il。 PCR反应条件为 第一阶段95°C， 5分钟；第二阶段94。C，45s; 45。C，45s; 72。C,2min; 5 cycles; 第三阶段94。C,45s; 55。C，45s; 72。C,2min; 25 cycles; 第四阶段72°C， 10min;PCR扩增产物经1.2。/。琼脂糖凝胶电泳分析，显示金黄色葡萄球菌a-溶血毒素基因敲除前后SEC2基因序列无任何变化，从而获得了产肠毒素 C2金黄色葡萄球菌or溶血毒素缺失菌株。(如图3所示)
权利要求
1. 一种产肠毒素金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株，其特征在于是通过同源重组的方法将产肠毒素的野生型菌株的α-溶血毒素基因缺失后得到的基因工程菌。
2. 根据权利要求l所述的缺失菌株，其特征在于所述产肠毒素的 野生型菌株为金黄色葡萄球菌，菌种保藏号为CGMCC0165，现保藏于中 国普通微生物菌种保藏管理中心。
3.根据权利要求2所述的缺失菌株，其特征在于所述缺失菌株可按 如下步骤制备，1) 利用PCR技术扩增得到a-溶血毒素基因上游同源序列Hk-u和下游 同源序列Hla-d，以及替换基因Neor;并将Hla-u、 Hla-d、 Neor连接得到 基因敲除片段Hu-Neor-Hd;2) 将Hu-Neor-Hd片段克隆入载体pMAD，经PCR扩增和酶切验证得 到基因敲除载体pMHL-a，然后将pMHL-a载体转化进金黄色葡萄球菌 RN4220进行基因修饰；3) 将基因修饰过的基因敲除载体pMHL-oi通过原生质体转化导入产 肠毒素野生型金黄色葡萄球菌CGMCC0165细胞内，通过培养，筛选得到 产肠毒素金黄色葡萄球菌a-溶血毒素缺失菌株。
4. 一种产肠毒素金黄色葡萄球菌oi-溶血毒素缺失菌株的构建方法， 其特征在于可按如下步骤操作，(1) 根据Genbank已公开的金黄色葡萄球菌a-溶血毒素基因序列， 设计两对引物，分别为Hla-uF 5'CGCGGATCCATCGATTACATTT3'， Hla隱uR5 ，CGGAATTCTGAGCTGACTATACGTG3'; Hla-dF5 ，CTACTCGA GGTATATGGCAATCAAC3 ，,Hla-dR5 ，CGCGGATCCCCTCTATAGTGTC ATG3，；以产肠毒素的野生型菌株基因组DNA为模板，用引物Hla-uF， Hla-uR进行PCR扩增得到与or溶血毒素基因上游序列同源的基因片段 Hla-u;用引物Hla-dF， Hla-dRiS行PCR扩增得到与a-溶血毒素基因下游 序列同源的基因片段Hla-d;(2) 根据Genbank中公开的已知新霉素抗性基因序列，设计一对引 物上游引物为5，GGCGGAATTCATGATTGAACAAGATG3'，下游引物 为5，ATAGCTCGAGATCTCAGAAGAACTCGTCA 3，；以载体pcDNA3.1 为模板，PCR扩增得到新霉素抗性基因Neor;(3) 基因敲除载体pMHL的构建将以上步骤(1)和(2)中扩增 得到的基因片段Hla-u、 Neor、 Hla-d进行酶切后连接，得到基因敲除片段Hu-Neor-Hd，然后将此连接片段克隆入载体pMAD、转化，经质粒抽 提、PCR扩增及酶切鉴定，构建得到基因敲除载体pMHL-a;(4) 基因敲除载体pMHL-a的基因修饰将载体pMHL-a通过电转 化导入金黄色葡萄球菌缺陷菌株，经过培养抽提质粒，PCR扩增及酶切鉴 定，获得经过基因修饰过的敲除载体pMHL-a;(5) 载体pMHL-a介导的基因敲除载体pMHL-a通过原生质体转 化的方法导入产肠毒素的野生型菌株内，构建得到产肠毒素金黄色葡萄 球菌a-溶血毒素缺失菌株。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述步骤(1)和 (5)中用于产肠毒素野生型菌株为金黄色葡萄球菌，菌种保藏号 CGMCC0165 ，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
全文摘要
本发明属于生物工程技术，具体地说是一种产肠毒素金黄色葡萄球菌α-溶血毒素缺失菌株及其构建，是通过向源重组的方法将产肠毒素的野生型菌株的α-溶血毒素基因缺失后得到的基因工程菌。通过该方法得到了除不产α-溶血毒素外，其他遗传背景与出发菌株相同的基因工程菌。
文档编号C12N1/21GK101280285SQ20071001083
公开日2008年10月8日 申请日期2007年4月4日 优先权日2007年4月4日
发明者张惠文, 张成刚, 王小刚, 苏振成, 陈彦竹 申请人:沈阳协合集团有限公司